为了建立快速、敏感、特异的小反刍兽疫(peste des petits ruminants,PPR)活疫苗中病毒含量的检测方法,本研究根据GenBank数据库中登录的小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)基因序列设计合成特异性引物,采用RT-PCR...为了建立快速、敏感、特异的小反刍兽疫(peste des petits ruminants,PPR)活疫苗中病毒含量的检测方法,本研究根据GenBank数据库中登录的小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)基因序列设计合成特异性引物,采用RT-PCR扩增PPRV基因片段,并克隆至pUC57载体上,构建标准品质粒p UC57-N-PPRV,再采用SYBR GreenⅠ染料法进行实时荧光定量PCR(real-time PCR)检测,绘制标准曲线并进行特异性、稳定性和重复性试验,同时应用于检测4批不同厂家生产的PPR活疫苗病毒含量。结果显示,用该方法检测病毒含量为2.61×10^(1)~2.61×10^(9)copies/μL的标准品,各稀释度质粒拷贝数与C_(t)值之间呈良好的线性关系,且相关系数高(R^(2)=0.999),说明引物特异性强。4批不同厂家生产的PPR活疫苗的病毒含量水平差异显著(P<0.05)。结果表明,该方法具有耗时短、灵敏度高、特异性强且稳定等优点,可用于检测PPR活疫苗中病毒含量水平。展开更多
利用禽脑脊髓炎病毒(Avian encephalomyelitis virus,AEV)YBF02株VPI基因序列设计一对特异性引物,通过对反应体系条件的确定和阳性质粒标准曲线的建立,建立了用于快速检测AEV含量的SYBR Green I荧光定量RT-PCR。结果显示:该方法能特异...利用禽脑脊髓炎病毒(Avian encephalomyelitis virus,AEV)YBF02株VPI基因序列设计一对特异性引物,通过对反应体系条件的确定和阳性质粒标准曲线的建立,建立了用于快速检测AEV含量的SYBR Green I荧光定量RT-PCR。结果显示:该方法能特异性地检测AEV YBF02株,且与其他禽类病毒无交叉反应;敏感性试验表明,该方法最低能检出10拷贝的AEV RNA模板,为普通PCR的100倍;使用该方法和鸡胚半数感染量(EID50)法对样品进行检测,二者具有良好的线性关系,且重复性试验的变异系数均小于4%。研究表明,建立的SYBR Green I荧光定量RT-PCR敏感性高、特异性强、重复性好,为AEV含量的快速检测提供了一种新的技术手段。展开更多
文摘利用禽脑脊髓炎病毒(Avian encephalomyelitis virus,AEV)YBF02株VPI基因序列设计一对特异性引物,通过对反应体系条件的确定和阳性质粒标准曲线的建立,建立了用于快速检测AEV含量的SYBR Green I荧光定量RT-PCR。结果显示:该方法能特异性地检测AEV YBF02株,且与其他禽类病毒无交叉反应;敏感性试验表明,该方法最低能检出10拷贝的AEV RNA模板,为普通PCR的100倍;使用该方法和鸡胚半数感染量(EID50)法对样品进行检测,二者具有良好的线性关系,且重复性试验的变异系数均小于4%。研究表明,建立的SYBR Green I荧光定量RT-PCR敏感性高、特异性强、重复性好,为AEV含量的快速检测提供了一种新的技术手段。
