甲型流感病毒H1N1血凝素茎部亚单位疫苗与不同佐剂组合在小鼠中诱导的免疫应答与保护

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作者 王瑭琪 韩瑞雯 +11 位作者 程雪婷 邴佳洛 李佳 孙树才 郭俊佳 翟程程 郭晓炎 王东红 王文玲 周剑芳 邓瑶 谭文杰 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第1期1-12,共12页

通过真核表达系统表达并纯化流感病毒H1N1血凝素(Haemagglutinin,HA)茎部,将其与不同佐剂联合免疫小鼠,评价其免疫原性及攻毒保护效果。本研究以密码子优化且结构修饰的甲型流感病毒A/Brisbane/59/2007(H1N1)的HA茎部为目的基因构建真... 通过真核表达系统表达并纯化流感病毒H1N1血凝素(Haemagglutinin,HA)茎部,将其与不同佐剂联合免疫小鼠,评价其免疫原性及攻毒保护效果。本研究以密码子优化且结构修饰的甲型流感病毒A/Brisbane/59/2007(H1N1)的HA茎部为目的基因构建真核表达质粒pcDNA3.1‐MiniHA(H1),转染HEK‐293T细胞,通过镍离子亲和层析柱纯化Mini‐HA。将Mini‐HA分别与Al(OH)_(3)、Al(OH)_(3)+CPG ODN、AddaS03^(TM)三种佐剂联合免疫小鼠,通过ELISA、ELISPOT和细胞内因子染色进行体液与细胞免疫检测,以H1N1‐PR8进行攻毒保护试验,监测小鼠存活率、体重变化、肺病毒载量以及肺组织病理变化,评估其保护效果。结果显示,Mini‐HA表达形成三聚体结构,Mini‐HA各组初次免疫后即可检测到针对HA茎部及全长HA的特异性IgG,加强免疫后抗体滴度显著增高;Mini‐HA联合Al(OH)_(3)+CPG ODN佐剂可以刺激Th1型细胞因子分泌,联合AddaS03^(TM)佐剂可以刺激Th1/Th2型细胞因子分泌;攻毒保护试验中,Mini‐HA联合Al(OH)_(3)+CPG ODN或AddaS03^(TM)佐剂组小鼠存活率达100%,体重下降低于5%,其中Mini‐HA联合AddaS03^(TM)佐剂组肺组织结构完整,仅见小部分肺泡腔代偿性扩张以及少量淋巴细胞浸润。本研究成功纯化了HA茎部蛋白Mini‐HA,联合佐剂免疫小鼠具有良好的免疫原性,以AddaS03^(TM)佐剂效果最好,可以诱导产生特异性体液与细胞免疫应答,保护小鼠抵御H1N1‐PR8流感病毒的攻击,有效抑制病毒复制、减少肺组织病理损伤。 展开更多

关键词 流感亚单位疫苗 佐剂 血凝素茎部 免疫原性

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甲型流感病毒重组血凝素蛋白的真核表达及免疫效力分析 被引量：1

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作者 刘京 龚铮 +7 位作者 年悬悬 邓涛 周蓉 张国梅 李雪丹 张哲罡 张家友 杨晓明 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第1期31-44,共14页

利用真核表达系统稳定表达HA重组蛋白并评价其免疫原性及攻毒保护效果,为重组流感亚单位疫苗的研制提供更多的理论基础。本研究以H1N1型流感病毒HA胞外区域序列为目的基因构建重组质粒KS001-HA并转染至CHO细胞得到表达重组蛋白rHA的单... 利用真核表达系统稳定表达HA重组蛋白并评价其免疫原性及攻毒保护效果,为重组流感亚单位疫苗的研制提供更多的理论基础。本研究以H1N1型流感病毒HA胞外区域序列为目的基因构建重组质粒KS001-HA并转染至CHO细胞得到表达重组蛋白rHA的单克隆细胞株,通过离子交换层析法纯化rHA。将rHA与佐剂联合免疫小鼠以评估免疫原性,并对免疫后的小鼠进行攻毒,监测小鼠存活率和体重变化,检测其肺组织病毒载量,并分析肺组织的病理变化。重组质粒KS001-HA在CHO细胞中稳定整合并分泌表达rHA蛋白,其相对分子质量约70 kD,经PNGaseF酶处理后,蛋白大小变为60kD。纯化后rHA蛋白纯度>95%。加强免疫后小鼠血清抗体效价显著增强,佐剂配伍免疫效果优于rHA单独免疫,其中HA203佐剂配伍组15、30、60μg剂量组免疫效应显著高于阳性对照组H1N1疫苗原液组。攻毒后HA203佐剂配伍组无小鼠死亡,小鼠体重平均下降率低于10%,肺组织肺泡结构清晰,仅见肺泡壁轻度增厚,伴随少量的炎性细胞浸润,仅检测到少量呈灶性分布的棕黄色颗粒。本研究成功构建了重组质粒KS001-HA,于CHO细胞中表达,并筛选出稳定表达目的蛋白的单克隆细胞株。rHA蛋白以单体形式存在且糖基化丰富。rHA蛋白独自作用小鼠产生的免疫原性较低且不能保护小鼠抵抗H1N1型流感病毒的攻击,rHA蛋白联合佐剂免疫小鼠后具有较好的免疫原性,以HA203佐剂效果最好。HA蛋白配伍HA203佐剂可以诱导小鼠产生特异性体液免疫保护小鼠抵御H1N1型流感病毒的攻击,减少炎性细胞浸润,有效抑制病毒的复制。 展开更多

关键词 流感亚单位疫苗 重组蛋白血凝素 免疫原性

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一种用于流感病毒亚单位疫苗纯度分析的改进方法

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作者 田文莉 邵铭 +5 位作者 祁骥 刘淑珍 谷堃 李长贵 杨旭 李小强 《生物技术通讯》 CAS 2013年第1期98-100,共3页

目的:在SDS-PAGE方法的基础上建立一种改进方法,用于流感病毒亚单位疫苗中间体的杂质分析。方法:用糖苷酶F对不同亚型的疫苗中间体去糖基化处理后进行SDS-PAGE,与未经去糖基化处理的还原型SDS-PAGE结果进行比较。结果:去糖基化处理消除... 目的:在SDS-PAGE方法的基础上建立一种改进方法,用于流感病毒亚单位疫苗中间体的杂质分析。方法:用糖苷酶F对不同亚型的疫苗中间体去糖基化处理后进行SDS-PAGE,与未经去糖基化处理的还原型SDS-PAGE结果进行比较。结果:去糖基化处理消除了血凝素的糖基化对电泳迁移率的影响,从而实现了血凝素亚基和杂质的电泳分离。结论:此方法应用于流感病毒亚单位疫苗中间体的杂质分析,较之常规的还原型SDS-PAGE方法具有更高的分辨力。 展开更多

关键词 流感病毒亚单位疫苗 SDS-PAGE 血凝素 糖苷酶F 去糖基化

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流感病毒亚单位疫苗中间体中沙门菌快速检测方法的建立

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作者 田文莉 祁骥 +1 位作者 杨旭 李小强 《生物技术通讯》 CAS 2013年第3期406-408,共3页

目的:建立一种能够快速、准确地检测流感病毒亚单位疫苗中间体样品中沙门菌污染的方法。方法:首先利用选择性增菌培养基对样品进行增菌培养,然后提取样品中的细菌基因组DNA,通过沙门菌特异性引物对基因组DNA进行PCR扩增,以琼脂糖凝胶电... 目的:建立一种能够快速、准确地检测流感病毒亚单位疫苗中间体样品中沙门菌污染的方法。方法:首先利用选择性增菌培养基对样品进行增菌培养,然后提取样品中的细菌基因组DNA,通过沙门菌特异性引物对基因组DNA进行PCR扩增,以琼脂糖凝胶电泳实现对目的片段的检测。结果:该PCR反应体系的扩增检测灵敏度可达1 pg的沙门菌DNA,利用选择性增菌培养配合该PCR体系可在最快24 h内实现对沙门菌的准确检测,测定结果与传统方法相符。结论:此方法应用于流感病毒亚单位疫苗中间体的沙门菌检查,较之传统的培养法结合生化鉴定的方法,大大缩短了检测周期,降低了结果判读的难度,在实际生产中有很好的应用前景。 展开更多

关键词 流感病毒亚单位疫苗 沙门菌 PCR 增菌培养

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甲型H1N1流感病毒亚单位疫苗对小鼠的免疫原性观察 被引量：1

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作者 刘英 郭世杰 +5 位作者 闫昆明 严超英 王明惠 王飞宇 傅连弟 韩军 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2013年第6期615-617,共3页

目的:观察国产甲型H1N1流感病毒亚单位疫苗对小鼠的免疫原性。方法:将不同血凝素含量(20、30、40μg/ml)各3批甲型H1N1流感病毒亚单位疫苗分别免疫小鼠,腹腔注射0.5 ml/只,每批疫苗又分为1针组、2针组,每组10只,2针间隔1周,同时设对照... 目的:观察国产甲型H1N1流感病毒亚单位疫苗对小鼠的免疫原性。方法:将不同血凝素含量(20、30、40μg/ml)各3批甲型H1N1流感病毒亚单位疫苗分别免疫小鼠,腹腔注射0.5 ml/只,每批疫苗又分为1针组、2针组,每组10只,2针间隔1周,同时设对照组。首针免疫后21天,分别采血,分离血清,检测血凝抑制抗体效价和中和抗体效价,观察疫苗的免疫原性。结果:血凝素含量为20μg/ml的甲型H1N1流感病毒亚单位疫苗1针组、2针组血凝抑制抗体效价均小于1∶40,中和抗体效价均小于1∶200;血凝素含量为30、40μg/ml的甲型H1N1流感病毒亚单位疫苗1针组、2针组的血凝抑制抗体效价均大于1∶40,中和抗体效价均大于1∶200;血凝素含量为30、40μg/ml的甲型H1N1流感病毒亚单位疫苗1针组和2针组的血凝抑制抗体和中和抗体效价比较,差异均无统计学意义。结论:血凝素含量为30μg/ml的甲型H1N1流感病毒亚单位疫苗接种1针即可达到理想的免疫效果。 展开更多

关键词 流感病毒亚单位疫苗 血凝素 小鼠 免疫原性

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亚单位流感疫苗中裂解剂壬苯醇醚-9含量两种检测方法的比较

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作者 田文莉 杨江山 +2 位作者 万亚芬 祁骥 杨旭 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2013年第1期120-121,共2页

目的比较高效液相色谱法(HPLC)和紫外分光光度法检测亚单位流感疫苗中裂解剂壬苯醇醚-9含量的效果。方法分别采用HPLC法和紫外分光度法检测亚单位流感疫苗中间体和成品中壬苯醇醚-9的含量,并取中间体进行SDS-PAGE分析。结果紫外分光光... 目的比较高效液相色谱法(HPLC)和紫外分光光度法检测亚单位流感疫苗中裂解剂壬苯醇醚-9含量的效果。方法分别采用HPLC法和紫外分光度法检测亚单位流感疫苗中间体和成品中壬苯醇醚-9的含量,并取中间体进行SDS-PAGE分析。结果紫外分光光度法测定亚单位流感疫苗成品和中间体的壬苯醇醚-9含量比HPLC法高10%以上,测定中间体3壬苯醇醚-9含量的结果差异更显著;SDS-PAGE分析显示中间体1、2、3的核蛋白(NP)含量差异显著,大多数存在于中间体3中。结论 HPLC法可代替紫外分光光度法检测亚单位流感疫苗中裂解剂壬苯醇醚-9的含量。 展开更多

关键词 亚单位流感疫苗 壬苯醇醚-9 高效液相色谱法 紫外分光光度法

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一款四价流感病毒亚单位疫苗在≥65岁健康人群中安全性和免疫原性的非劣效Ⅲ期临床试验

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作者 牛媛娜 杨泳慧 +5 位作者 由汪洋 谭洁冰 冯光伟 王燕 王彦霞 赵玉玲 《中国疫苗和免疫》 CSCD 北大核心 2024年第1期1-5,共5页

目的评价一款四价流感病毒亚单位疫苗在≥65岁健康人群中的安全性和免疫原性。方法采用随机、盲法、阳性对照的非劣效Ⅲ期临床试验,在河南省两个区县招募≥65岁健康人群,随机接种1剂次试验疫苗(试验组)或已上市的四价流感病毒裂解疫苗(... 目的评价一款四价流感病毒亚单位疫苗在≥65岁健康人群中的安全性和免疫原性。方法采用随机、盲法、阳性对照的非劣效Ⅲ期临床试验,在河南省两个区县招募≥65岁健康人群,随机接种1剂次试验疫苗(试验组)或已上市的四价流感病毒裂解疫苗(对照组),观察免疫后0-30 d不良反应和6月内严重不良事件,分析发生率;检测免疫前后血清A(H1N1)、A(H3N2)、BV和BY流感病毒血凝抑制抗体,分析抗体阳转率和几何平均滴度(GMT)增长倍数。结果试验组和对照组受试者不良反应发生率分别为7.00%(28/400,95%CI:4.70%-9.96%)、5.25%(21/400,95%CI:3.28%-7.91%),所有不良反应均发生在免疫后0-7 d,无4级和严重不良反应。试验组免疫后A(H1N1)、A(H3N2)、BV、BY流感病毒抗体阳转率分别为78.99%(312/395)、87.85%(347/395)、82.03%(324/395)、79.24%(313/395),与对照组阳转率的率差(95%CI)分别为5.69(-0.24-11.61)、2.46(-2.28-7.20)、5.70(0.06-11.34)、5.94(0.03-11.85)。试验组免疫后各型流感病毒抗体GMT(1:)分别为314.43、331.43、134.96、305.19,与对照组GMT的比值(95%CI)分别为1.10(0.93-1.31)、1.21(1.03-1.43)、1.14(0.97-1.35)、1.28(1.06-1.53),分别是免疫前GMT的13.88倍、13.98倍、10.19倍、7.62倍。结论试验流感疫苗在≥65岁健康人群中具有较好的安全性和免疫原性,非劣于对照流感疫苗。 展开更多

关键词 四价流感病毒亚单位疫苗 安全性 免疫原性 临床试验 ≥65岁人群

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四价流感病毒亚单位疫苗在3-64岁人群中的免疫原性评价

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作者 杨泳慧 牛媛娜 +5 位作者 冯光伟 王燕 谭洁冰 由汪洋 王彦霞 赵玉玲 《中华微生物学和免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2023年第11期843-849,共7页

目的评价四价流感病毒亚单位疫苗在3~64岁健康人群中接种后的免疫原性。方法选择3~64岁的健康人群为研究对象,采用随机、盲法、阳性对照的非劣效试验,招募受试者后按1∶1随机接种相对应的实验疫苗或对照疫苗,受试者全程接种1剂。采集所... 目的评价四价流感病毒亚单位疫苗在3~64岁健康人群中接种后的免疫原性。方法选择3~64岁的健康人群为研究对象,采用随机、盲法、阳性对照的非劣效试验,招募受试者后按1∶1随机接种相对应的实验疫苗或对照疫苗,受试者全程接种1剂。采集所有受试者免疫前和全程免疫后28 d的血样,血凝抑制(hemagglutination inhibition,HI)试验检测流感病毒H1N1、H3N2、B/Victoria(BV)和B/Yamagata(BY)血清抗体水平,分析抗体几何平均滴度(geometric mean titer,GMT)增长倍数、抗体阳转率和抗体保护率。结果符合方案分析集的共有3~64岁受试者2157例,其中实验组1074例,对照组1083例。两组受试者免疫前H1N1、H3N2、BV和BY型抗体GMT和抗体保护率差异均无统计学意义(P>0.05),两组基线均衡。全程免疫后,实验组各型别抗体GMT增长倍数分别为11.16、17.77、9.61和15.13,抗体阳转率分别为84.08%(903/1074)、92.46%(993/1074)、86.03%(924/1074)和91.71%(985/1074),抗体保护率分别为96.74%(1039/1074)、97.58%(1048/1074)、88.08%(946/1074)和94.97%(1020/1074)。实验组4个型别抗体GMT均较免疫前增长2.5倍以上,抗体阳转率95%CI下限均>40%,抗体保护率95%CI下限均>70%;实验疫苗与对照疫苗4个型别抗体的阳转率率差的95%CI下限均>-10%,GMT实验组/GMT对照组的95%CI下限均>2/3。结论在3~64岁人群中,实验疫苗具有较好的免疫原性,且非劣效于对照疫苗。 展开更多

关键词 四价流感病毒亚单位疫苗 免疫原性 3~64岁人群

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四价流感病毒亚单位疫苗的制备和检定 被引量：2

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作者 李雪峰 陈宁 +2 位作者 徐朝静 姚蕊 阮承迈 《中华实验和临床感染病杂志（电子版）》 CAS 2019年第6期524-527,共4页

目的建立四价流感病毒亚单位疫苗制备方法。方法将4株毒种分别接种于9~11日龄的健康鸡胚尿囊腔中,在33~35℃培养箱培养48~72 h后,冷胚处理,收获尿囊液,经澄清、病毒灭活、裂解和纯化,除菌过滤制成单价疫苗原液;利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(S... 目的建立四价流感病毒亚单位疫苗制备方法。方法将4株毒种分别接种于9~11日龄的健康鸡胚尿囊腔中,在33~35℃培养箱培养48~72 h后,冷胚处理,收获尿囊液,经澄清、病毒灭活、裂解和纯化,除菌过滤制成单价疫苗原液;利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)方法,分析有效成分及纯度。将收获的4种单价疫苗原液进行混配,制成四价流感病毒亚单位疫苗。最终按《中华人民共和国药典》2015年版对成品疫苗进行全面检定。结果成功制备出四价流感病毒亚单位疫苗,其有效成分血凝素含量占总蛋白比例为91.4%。4种疫苗株血凝素含量分别为H1N1:30μg/ml、H3N2:34μg/ml、B1:36μg/ml、B2:30μg/ml,对成品的检定完全合格。结论本研究所制备的四价流感亚单位疫苗符合生产和检定规程要求。 展开更多

关键词 四价流感病毒亚单位疫苗 四价 流感 疫苗 乙型

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国产流感病毒亚单位疫苗的安全性及免疫原性 被引量：3

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作者 张艳 吴徐锋 +3 位作者 田文莉 潘晓男 仇艳平 李小强 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2012年第8期1013-1016,共4页

目的观察国产流感病毒亚单位疫苗的安全性及免疫原性。方法按照单盲法、随机、对照的原则,将900名观察对象分为幼儿组、儿童组、成人组和老年组,各组分别按2∶1的比例随机接种试验疫苗和对照疫苗(进口疫苗),观察各组接种后的全身反应、... 目的观察国产流感病毒亚单位疫苗的安全性及免疫原性。方法按照单盲法、随机、对照的原则,将900名观察对象分为幼儿组、儿童组、成人组和老年组,各组分别按2∶1的比例随机接种试验疫苗和对照疫苗(进口疫苗),观察各组接种后的全身反应、局部反应和其他不良反应以及免疫后HI抗体阳转率、保护率和GMT增长倍数。结果观察组接种后全身反应发生率为8.33%,仅1例发生局部反应,不同年龄人群全身反应发生率与对照组相比,差异均无统计学意义(P>0.05);免疫后观察组H1N1、H3N2和B(亚)型HI抗体总阳转率分别为87.90%、70.02%和71.32%,保护率分别为93.30%、93.30%和74.67%,与对照组相比,差异均无统计学意义(P>0.05);GMT增长倍数分别为31.6、8.2和14.0,除H1N1亚型GMT平均增长倍数高于对照组外,其他两(亚)型与对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。结论国产流感病毒亚单位疫苗具有与进口同类疫苗相似的安全性和免疫原性。 展开更多

关键词 流感疫苗 亚单位疫苗 安全性 免疫原性

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一种新型广谱流感病毒亚单位疫苗的表达与纯化 被引量：2

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作者 魏义举 龙海亭 +4 位作者 杨旭 李建芳 毕研伟 李健峰 徐维明 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第5期90-95,共6页

通过引物设计,利用重叠延伸PCR(OE-PCR)和搭桥PCR方法扩增得到A型流感病毒M2蛋白缺失跨膜区基因以及HA多表位基因,分别克隆测序后以pET28a+为表达载体构建重组质粒pET28a+-M2d-HA。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),筛选获得了高效表达... 通过引物设计,利用重叠延伸PCR(OE-PCR)和搭桥PCR方法扩增得到A型流感病毒M2蛋白缺失跨膜区基因以及HA多表位基因,分别克隆测序后以pET28a+为表达载体构建重组质粒pET28a+-M2d-HA。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),筛选获得了高效表达流感病毒缺失跨膜区M2蛋白和HA多表位蛋白片段重组融合蛋白的工程菌,表达的重组蛋白约占菌体总蛋白的45%左右。表达的蛋白以包涵体形式存在,包涵体经亲和层析和阴离子交换层析纯化后复性,得到纯度在90%以上的目的蛋白。Westernblot结果显示纯化的重组蛋白具有较好的抗原性和特异性。为进一步研究广谱型流感病毒亚单位疫苗奠定了基础。 展开更多

关键词 流感病毒 亚单位疫苗 多表位 表达纯化 抗原性

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