负载hTERT调控相关miR-138复制缺陷型腺病毒的包装及鉴定 被引量：6

1

作者 熊晓峰 陈陵 +5 位作者 范亚川 邹利全 张方征 王洪斌 游斌 刘志鹏 《重庆医学》 CAS CSCD 北大核心 2011年第9期896-898,共3页

目的包装负载人端粒酶逆转录酶(hTERT)调控相关miR-138前体全长cDNA(pre-miR-138)的复制缺陷型腺病毒载体(Ad-miR138)。方法 pre-miR-138全基因合成后插入腺病毒穿梭质粒(pDC315-miR138),与腺病毒包装质粒pBHGloxDel-taE1、3Cre共转染... 目的包装负载人端粒酶逆转录酶(hTERT)调控相关miR-138前体全长cDNA(pre-miR-138)的复制缺陷型腺病毒载体(Ad-miR138)。方法 pre-miR-138全基因合成后插入腺病毒穿梭质粒(pDC315-miR138),与腺病毒包装质粒pBHGloxDel-taE1、3Cre共转染人胚肾293细胞(HEK293),包装Ad-miR138并大量扩增,收集纯化。对纯化后的Ad-miR138进行滴度测定、感染性鉴定、电镜鉴定及双引物PCR鉴定。结果包装成功的腺病毒载体具有良好的感染性,纯化浓缩后的病毒滴度可达5×1010pfu/mL。电镜可见病毒在HEK293细胞中大量复制。PCR双引物鉴定Ad-miR138可扩增出Ad及pre-miR-138特异片段,而对照Ad-LacZ只能扩增出Ad特异片段,不能扩增出pre-miR-138特异片段。结论成功包装了负载miR-138全长cDNA的复制缺陷型腺病毒载体,为进一步研究微RNAs(microRNAs)在肿瘤发生、发展中的作用,以及hTERT调控相关miR-138在肿瘤治疗中的价值奠定了基础。 展开更多

关键词 RNA指导的dna聚合酶 微RNAS 人胚肾293细胞 复制缺陷型腺病毒载体

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HBV DNA聚合酶在介导HBV相关肝细胞癌肿瘤细胞免疫逃逸中的作用 被引量：1

2

作者 李鸿侠 孙一萌 +6 位作者 张鸿涛 韩树旺 张德林 尚海涛 郭午 刘军舰 李忠廉 《临床肝胆病杂志》 CAS 北大核心 2023年第12期2858-2866,共9页

目的本研究旨在明确HBV DNA聚合酶是否与T淋巴细胞功能衰竭相关,进而介导HBV相关肝细胞癌(HCC)肿瘤细胞的免疫逃逸以及探寻具体的分子机制。方法稳定转染带有Flag标签的HBV DNA聚合酶表达质粒(FlagHBV-P)和细胞间黏附分子-1(ICAM1)的肝... 目的本研究旨在明确HBV DNA聚合酶是否与T淋巴细胞功能衰竭相关,进而介导HBV相关肝细胞癌(HCC)肿瘤细胞的免疫逃逸以及探寻具体的分子机制。方法稳定转染带有Flag标签的HBV DNA聚合酶表达质粒(FlagHBV-P)和细胞间黏附分子-1(ICAM1)的肝癌细胞系Huh7、HepG2与Jurkat细胞共培养,MTT、qRT-PCR、酶联免疫吸附测定(ELISA)实验分别检测Jurkat细胞增殖、活化(CD69表达)以及细胞因子IFN-γ分泌情况。RNA-seq筛选稳转细胞系与对照细胞中表达差异的免疫相关分子,mRNA半衰期及蛋白半衰期实验确定HBV DNA聚合酶对免疫相关分子具体在何种水平产生影响。网站预测此免疫相关分子启动子区域可能结合的转录因子,Western Blot实验验证转录因子对免疫相关分子的影响,挽救实验确定HBV DNA聚合酶是否通过此转录因子影响免疫相关分子的表达水平。两组间比较采用成组t检验。结果与对照组相比,实验组细胞(Huh7、HepG2)增殖、活化及细胞因子分泌明显降低(P值均<0.01)。与对照细胞相比,实验组细胞(Huh7、Hep G2)的ICAM1 mRNA和蛋白水平均降低(P值均<0.01)。网站预测ICAM1启动子并初步筛选锚定了NFKB1、RELA和STAT3。与对照组相比,实验组细胞(Huh7、Hep G2)p65蛋白的表达水平明显降低(P值均<0.01)。过表达p65后,ICAM1蛋白表达水平明显升高,降表达p65后,ICAM1蛋白表达水平明显降低(P值均<0.01),挽救实验中过表达p65后,对照组与实验组细胞的ICAM1表达水平无明显差异(P值均>0.05)。过表达ICAM1后,对照组与实验组细胞(Huh7、Hep G2)的增殖、活化及细胞因子分泌无明显差异(P值均>0.05)。结论HBV DNA聚合酶通过抑制NF-κB中p65的表达来下调ICAM1的水平以介导HCC免疫逃逸。 展开更多

关键词 癌 肝细胞 肿瘤逃逸 指导dna的dna聚合酶 细胞黏附分子

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外源hTERT基因对人肝细胞增殖及CYP450 19A1表达的影响 被引量：4

3

作者 王开利 迟淑萍 +4 位作者 孙杰 邢汉前 刘俊威 赵鸿 赵军 《军医进修学院学报》 CAS 2011年第11期1137-1138,1163,共3页

目的探讨外源hTERT基因对体外培养的人肝细胞增殖及细胞色素P450 19A1(CYP450 19A1)表达的影响。方法将携带有hTERT片段的重组逆转录病毒载体pLNCX2-hTERT转染至体外培养的人肝细胞;四甲基偶氮唑蓝比色(MTT)法观察hTERT表达对细胞增殖... 目的探讨外源hTERT基因对体外培养的人肝细胞增殖及细胞色素P450 19A1(CYP450 19A1)表达的影响。方法将携带有hTERT片段的重组逆转录病毒载体pLNCX2-hTERT转染至体外培养的人肝细胞;四甲基偶氮唑蓝比色(MTT)法观察hTERT表达对细胞增殖的影响;通过采用Western blot法检测CYP450 19A1的表达情况。结果成功将带有hTERT逆转录病毒载体pLNCX2-hTERT转染至人肝细胞,转染后的肝细胞组较未转染组增殖明显,转染前后肝细胞在55kU处均可见有CYP450 19A1蛋白表达。结论外源hTERT基因可促进肝细胞增殖;转染组与未转染组肝细胞均可表达CYP450 19A1。 展开更多

关键词 基因 RNA指导的dna聚合酶 肝细胞 增殖 细胞色素P450酶系19A1

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端粒酶逆转录酶在五羟色胺诱导的大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖过程中的作用 被引量：3

4

作者 宋景春 李志超 +2 位作者 黄国明 乔怀宇 涂晓文 《中华心血管病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第9期837-842,共6页

目的研究端粒酶逆转录酶(TERT)在五羟色胺(5-HT)诱导的肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)增殖过程中的作用。方法组织块法培养大鼠 PASMCs。大鼠 PASMCs 增殖实验分别检测5-HT 和反义 TERT 寡核苷酸对大鼠 PASMCs 增殖的影响。激光共聚焦显微镜... 目的研究端粒酶逆转录酶(TERT)在五羟色胺(5-HT)诱导的肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)增殖过程中的作用。方法组织块法培养大鼠 PASMCs。大鼠 PASMCs 增殖实验分别检测5-HT 和反义 TERT 寡核苷酸对大鼠 PASMCs 增殖的影响。激光共聚焦显微镜检测异硫氰酸荧光素(FITC)标记的反义 TERT 寡核苷酸,明确反义 TERT 寡核苷酸在 PASMCs 中的分布。原位杂交实验和免疫组化实验检测反义 TERT 寡核苷酸和5-HT 对 PASMCs 中 TERT 的 mRNA 和蛋白表达的影响。结果 5-HT 诱导大鼠 PASMCs 增殖实验证实5-HT 在10^(-9)～10^(-5)mol/L 的剂量范围内,5-HT 对大鼠 PASMCs 的促增殖作用具有剂量依赖性。原位杂交实验和免疫组化实验证实5-HT 可能直接或间接促进 TERT 的 mRNA 和蛋白表达。FITC 标记的反义 TERT 寡核苷酸在激光共聚焦显微镜下显示,反义 TERT 寡核苷酸主要分布于 PASMCs 胞质。反义 TERT 寡核苷酸对大鼠 PASMCs 增殖抑制实验证实反义 TERT 寡核苷酸可以抑制5-HT 诱导的大鼠 PASMCs 增殖,而正义 TERT 寡核苷酸对5-HT诱导的大鼠 PASMCs 增殖没有作用。原位杂交实验和免疫组化实验证实反义 TERT 寡核苷酸可以抑制5-HT 引起的 TERT 的 mRNA 和蛋白表达增强。结论研究结果提示,TERT 在5-HT 诱导的PASMCs 增殖过程中发挥重要作用,通过反义技术抑制 TERT 表达为肺动脉高压的基因治疗提供了理论基础。 展开更多

关键词 肺动脉 RNA指导的dna聚合酶 寡核苷酸类 血清素

原文传递

siRNA靶向沉默hTERT基因对人胰腺癌Capan-2细胞增殖、凋亡和周期的影响 被引量：1

5

作者 钟英强 魏菁 +4 位作者 罗招凡 傅玉如 邵静 刘娟 朱兆华 《中华临床医师杂志（电子版）》 CAS 2008年第10期36-42,共7页

目的研究hTERT-siRNA对人胰腺癌Capan-2细胞增殖、凋亡、细胞周期的影响。方法利用RNAi技术靶向沉默Capan-2的hTERT基因表达,应用细胞直接计数法和流式细胞术(FCM)检测Capan-2细胞的增殖、凋亡和细胞周期的变化。结果在hTERT-siRNA的使... 目的研究hTERT-siRNA对人胰腺癌Capan-2细胞增殖、凋亡、细胞周期的影响。方法利用RNAi技术靶向沉默Capan-2的hTERT基因表达,应用细胞直接计数法和流式细胞术(FCM)检测Capan-2细胞的增殖、凋亡和细胞周期的变化。结果在hTERT-siRNA的使用浓度为50nm、Lipo转染浓度为3μl/2ml转染体积和hTERT沉默效率为100%的条件下,转染hTERT-siRNA24h后,细胞生长已明显减慢,抑制细胞增殖率为26.39%(P<0.05),第2、3、5、7天抑制细胞增殖率分别为46.77%、70.61%、84.71%和85.99%(P<0.001)。随着转染细胞按常规培养时间的延长,早期凋亡细胞明显增多(P<0.001),以24h后更明显;活性细胞明显减少(P<0.001),而损伤细胞明显增多(P<0.001),以6h后明显;死亡细胞明显增多(P<0.001),以24h后更明显。siRNA组与阴性对照组和Lipo对照组均有明显差异(P<0.001)。G0～G1期细胞明显增多(P<0.01),S期细胞明显减少(P<0.01),以24h后明显;G2～M期细胞明显减少(P<0.01),以48h后明显;晚期凋亡细胞增多(P<0.05),以48h后明显。结论hTERT-siRNA可抑制人胰腺癌Capan-2细胞生长,使较多的细胞停留在G0～G1期,而进入G～M期和S期的细胞减少,可促进细胞凋亡。 展开更多

关键词 胰腺肿瘤 Capan-2细胞株 RNA指导的dna聚合酶 RNA 小分子干扰 细胞增殖 细胞凋亡 细胞周期

原文传递

构建人端粒酶反转录酶修饰的永生化大鼠骨髓间充质干细胞株 被引量：2

6

作者 刘慧萍 钟晓龙 +2 位作者 赵晴 黄文起 安珂 《中国组织工程研究》 CAS 北大核心 2015年第23期3621-3627,共7页

背景:骨髓间充质干细胞具有取材方便、多向分化及低免疫原性等优点,是转基因细胞移植镇痛领域中的理想载体细胞,但由于骨髓中间充质干细胞含量有限、体外培养的复制性衰老等问题,制约其在镇痛研究中的应用。目的:构建永生化大鼠骨髓间... 背景:骨髓间充质干细胞具有取材方便、多向分化及低免疫原性等优点,是转基因细胞移植镇痛领域中的理想载体细胞,但由于骨髓中间充质干细胞含量有限、体外培养的复制性衰老等问题,制约其在镇痛研究中的应用。目的:构建永生化大鼠骨髓间充质干细胞株,为转基因细胞移植镇痛提供载体细胞来源。方法:构建携带人端粒酶反转录酶基因的慢病毒pL V-Puro-EF1α-h TERT并转染第3代骨髓间充质干细胞后进行嘌呤霉素筛选,获得阳性细胞克隆并扩大培养,分别采用RT-PCR和TRAP法检测转染细胞人端粒酶反转录酶的表达和端粒酶活性,同时观察细胞形态、增殖和诱导分化能力、表面分子以及Nestin、MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ的表达,检测细胞染色体核型和致瘤性。结果与结论:人端粒酶反转录酶基因修饰的骨髓间充质干细胞可以体外连续培养超过30代。与未转染的细胞和对照病毒转染的细胞相比,慢病毒转染的骨髓间充质干细胞人端粒酶反转录酶mR NA表达、端粒酶活性以及细胞增殖能力均提高,细胞周期主要处于G2/M以及S期,增殖指数明显升高;细胞表面分子CD29、CD44、CD90表达阳性率大于70%,而CD34、CD45表达阳性率不足5%,胞浆Nestin的表达阳性,而MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ未见表达,保留了干细胞成骨、成脂、成神经的分化能力,细胞形态、染色体核型均正常,裸鼠接种无致瘤性。以上结果提示成功构建了人端粒酶反转录酶基因修饰的永生化大鼠骨髓间充质干细胞株,为转基因细胞移植用于镇痛研究提供了生物学性状均一、稳定的安全载体细胞。 展开更多

关键词 骨髓 间质干细胞 端粒 末端转移酶 RNA指导的dna聚合酶 干细胞 骨髓干细胞 人端粒酶反转录酶 骨髓间充质干细胞 永生化 镇痛 国家自然科学基金

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天花粉蛋白对单纯疱疹病毒1型DNA聚合酶和DNA结合蛋白mRNA表达的影响

7

作者 陈光福 尹飞 +2 位作者 张红媛 黄文革 陈凤英 《中华临床医师杂志（电子版）》 CAS 2010年第9期41-45,共5页

目的探讨天花粉蛋白对体内外单纯疱疹病毒-1(HSV-1)DNA聚合酶和DNA结合蛋白mRNA表达的抑制作用。方法 36只小鼠随机分为正常组、模型对照组和天花粉蛋白治疗组,每组各12只,小鼠颅内接种HSV-1建立病毒性脑炎模型,治疗组于接种HSV-1前30mi... 目的探讨天花粉蛋白对体内外单纯疱疹病毒-1(HSV-1)DNA聚合酶和DNA结合蛋白mRNA表达的抑制作用。方法 36只小鼠随机分为正常组、模型对照组和天花粉蛋白治疗组,每组各12只,小鼠颅内接种HSV-1建立病毒性脑炎模型,治疗组于接种HSV-1前30min腹腔注射天花粉蛋白注射液,于接种病毒后12h、24h、48h、96h分别测定脑组织HSV-1DNA聚合酶和DNA结合蛋白mRNA表达水平。体外培养神经细胞分为正常组、药物对照组、病毒对照组和药物预处理组,接种病毒后12h、24h、48h、96h分别测定各组培养神经细胞的HSV-1DNA聚合酶和DNA结合蛋白mRNA表达水平。结果天花粉蛋白治疗组于小鼠颅内接种HSV-1后12h、24h、48h、96h脑组织HSV-1DNA聚合酶mRNA表达水平(8.39±0.84、9.62±0.87、7.81±0.90、7.66±0.85)显著低于模型组(11.26±1.02、12.43±1.17、11.56±1.68、12.78±1.71)(P<0.05);治疗组脑组织HSV-1DNA结合蛋白mRNA表达水平(7.28±1.07、8.25±0.78、7.56±0.96、7.85±1.22)显著低于模型组(10.45±2.72、12.33±1.97、11.24±1.86、12.54±2.32)(P<0.01)。药物预处理组在12h、24h、48h、96h培养神经细胞HSV-1DNA聚合酶mRNA表达水平(9.33±0.87、9.57±0.97、9.73±0.94、9.84±0.86)显著低于病毒对照组(10.15±1.12、15.63±1.24、12.77±2.38、16.58±1.92)(P<0.05);药物预处理组在24h、48h、96h培养神经细胞HSV-1DNA结合蛋白mRNA表达水平(7.58±1.75、8.63±1.79、7.38±1.47)显著低于病毒对照组(10.24±2.16、10.85±1.67、11.63±2.05)(P<0.05)。结论天花粉蛋白对体内外HSV-1DNA聚合酶和DNA结合蛋白mRNA表达具有抑制作用。 展开更多

关键词 单纯疱疹病毒属 天花粉素 指导dna的dna聚合酶 dna结合蛋白质类 基因表达 动物 实验

原文传递

负载miR-138复制缺陷型腺病毒对hTERT表达的影响 被引量：1

8

作者 刘志鹏 王宗华 +6 位作者 梁光萍 熊晓峰 范亚川 邹利全 王洪斌 陈陵 李学成 《重庆医学》 CAS CSCD 北大核心 2011年第29期2947-2948,2951,共3页

目的探讨以复制缺陷型腺病毒为载体,上调人端粒酶逆转录酶(hTERT)调控相关miR-138表达丰度后,能否有效抑制靶基因hTERT的表达。方法 将负载hTERT调控相关miR-138的复制缺陷型腺病毒以200∶1的感染复数(MOI),感染人胃癌BGC-823细胞;采... 目的探讨以复制缺陷型腺病毒为载体,上调人端粒酶逆转录酶(hTERT)调控相关miR-138表达丰度后,能否有效抑制靶基因hTERT的表达。方法 将负载hTERT调控相关miR-138的复制缺陷型腺病毒以200∶1的感染复数(MOI),感染人胃癌BGC-823细胞;采用实时荧光定量PCR(real-time PCR)检测BGC-823细胞内miR-138和hTERT mRNA的表达丰度;Western Blot检测hTERT蛋白表达。结果 与阴性对照腺病毒相比,负载miR-138的腺病毒感染BGC-823细胞后,可显著提高miR-138表达丰度(P<0.05);而未感染腺病毒的空白对照组与阴性对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。与感染阴性对照腺病毒的BGC-823细胞相比,感染负载人miR-138腺病毒(Ad-miR138)的BGC-823细胞内hTERT蛋白表达有所下调。结论 以复制缺陷型腺病毒为载体,可有效上调hTERT调控相关miR-138的表达丰度,进而可有效抑制miR-138靶基因hTERT的表达水平。 展开更多

关键词 RNA指导的dna聚合酶 胃肿瘤 复制缺陷型腺病毒载体

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《生物化学》第九、十章复习思考题(续)

9

《当代护士（中旬刊）》 1996年第12期46-47,共2页

本刊自本期起仍将陆续刊登“自学考试辅导题”,此期刊登的《生物化学复习思考题》是续1995年第4期的,请参加自学考试的读者注意结合起来复习参考。

关键词 《生物化学》 复习思考题 dna聚合酶I dna复制 化学修饰 RNA指导的dna聚合酶 酶蛋白 引物酶 活性中心 酶活性

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端粒酶逆转录酶高表达新生鼠真皮细胞株的构建及其生物学功能的初步研究 被引量：1

10

作者 谭挺 胡志奇 《实用医学杂志》 CAS 北大核心 2011年第12期2136-2138,共3页

目的:以逆转录病毒载体pLEGFP-N1-TERT为介导构建TERT高表达新生鼠真皮细胞株,并观察其相关生物学功能变化情况。方法:将pLEGFP-N1-TERT感染C57新生鼠真皮细胞,并用G418筛选法进行阳性克隆的筛选并培养观察,同时将空载对照。两组细胞均... 目的:以逆转录病毒载体pLEGFP-N1-TERT为介导构建TERT高表达新生鼠真皮细胞株,并观察其相关生物学功能变化情况。方法:将pLEGFP-N1-TERT感染C57新生鼠真皮细胞,并用G418筛选法进行阳性克隆的筛选并培养观察,同时将空载对照。两组细胞均经MTT法检测生长情况,流式检测表面标记物CD44、CD133的表达情况,Westernblot法检测TERT蛋白的表达,免疫组化检测Versican表达。结果:荧光显微镜下观察TERT高表达细胞发出绿色荧光,其生长速度较对照趋缓,其CD44、CD133、TERT蛋白、Versican表达均升高。结论:本实验获得TERT高表达新生鼠真皮细胞株,其毛发诱导能力较高,可作为毛囊细胞移植种子细胞来源之一。 展开更多

关键词 RNA指导的dna聚合酶 逆转录病毒载体 真皮细胞 毛囊细胞移植

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反转录酶活性检测实时荧光定量PCR方法的建立

11

作者 孔艳 吴小红 +3 位作者 杨立宏 安祺 董关木 俞永新 《中国医药生物技术》 CSCD 2010年第6期438-441,共4页

目的在传统产物增强性反转录酶(PERT)活性检测方法基础上建立检测反转录酶活性的实时荧光定量PCR方法。方法以噬菌体MS2RNA为模板,设计、合成引物和探针,并分别以连续10倍倍比稀释的AMV反转录酶(1×10-1～1×10-9U/μl)标准品... 目的在传统产物增强性反转录酶(PERT)活性检测方法基础上建立检测反转录酶活性的实时荧光定量PCR方法。方法以噬菌体MS2RNA为模板,设计、合成引物和探针,并分别以连续10倍倍比稀释的AMV反转录酶(1×10-1～1×10-9U/μl)标准品催化体外反转录反应合成相应cDNA。采用实时荧光定量PCR法检测底物cDNA模板量,并获得相应的PCR荧光值曲线,分析AMV反转录酶的相对活性。同时应用传统PERT方法对cDNA进行扩增,测定该方法的灵敏度。结果将AMV反转录酶标准品连续10倍倍比稀释后催化反转录反应,实时荧光定量PCR分析所得的反转录产物cDNA,结果得到与理论值完全相符合的PCR标准荧光值曲线;定量分析结果显示,浓度为1×10-2～1×10-8U/μl的AMV反转录酶均可得到相应的荧光值。不同稀释度的AMV反转录酶,经传统PERT方法扩增后,结果显示浓度为1×10-3～1×10-7U/μl的AMV反转录酶均可见大小为112bp的阳性条带,检测灵敏度达到1×10-7U/μl。结论成功建立了基于实时荧光定量PCR技术的检测反转录酶活性的新方法,实验操作简单,具有高精确性和无污染性,为生物制品外来污染尤其是反转录病毒污染的检测提供了参考指标。 展开更多

关键词 聚合酶链反应 RNA指导的dna聚合酶

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外源hTERT基因对大鼠肝细胞增殖的影响

12

作者 王开利 迟淑萍 +2 位作者 孙杰 戚扬 赵军 《军医进修学院学报》 CAS 2009年第1期76-78,共3页

目的:构建含目的基因人端粒逆转录酶(hTERT)重组逆转录病毒载体pLNCX2-hTERT,体外感染原代大鼠肝细胞,观察对大鼠肝细胞增殖的影响。方法:将hTERT插入逆转录病毒载体pLNCX2获得重组逆转录病毒载体pLNCX2-hTERT,转染包装细胞293T后可获... 目的:构建含目的基因人端粒逆转录酶(hTERT)重组逆转录病毒载体pLNCX2-hTERT,体外感染原代大鼠肝细胞,观察对大鼠肝细胞增殖的影响。方法:将hTERT插入逆转录病毒载体pLNCX2获得重组逆转录病毒载体pLNCX2-hTERT,转染包装细胞293T后可获得表达hTERT逆转录病毒,感染体外培养的原代大鼠肝细胞,通过RT-PCR及western-blot检测基因在细胞中的表达情况。结果:重组载体pLNCX2-hTERT经双酶切鉴定及序列测定,证实构建正确。转染原代大鼠肝细胞后能明显促进其增殖。结论:体外转染原代大鼠肝细胞后能有效促进其增殖,这为进一步解决人工肝细胞来源问题奠定了实验基础。 展开更多

关键词 RNA指导的dna聚合酶 肝细胞 肝 人工 细胞增殖

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一种新乙型肝炎病毒表型耐药分析方法的建立

13

作者 李新艳 陈良 +3 位作者 马张妹 毛日成 黄玉仙 张继明 《中华传染病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2014年第5期257-262,共6页

目的 建立一种新的、简便的HBV表型耐药分析方法,通过置换完整的反转录酶（RT）区研究药物敏感性.方法 首先全基因扩增未经核苷（酸）类似物治疗患者的HBV DNA,构建含HBV野毒株全基因组表达质粒PHY536207（B基因型）及PHY97（C基因型）... 目的 建立一种新的、简便的HBV表型耐药分析方法,通过置换完整的反转录酶（RT）区研究药物敏感性.方法 首先全基因扩增未经核苷（酸）类似物治疗患者的HBV DNA,构建含HBV野毒株全基因组表达质粒PHY536207（B基因型）及PHY97（C基因型）,继而在RT区上、下游设计限制酶切位点,改造后的质粒分别命名为mPHY536207及mPHY97.以CHB患者血清中分离到的拉米夫定（LAM）耐药变异株和阿德福韦酯（ADV）耐药变异株为骨架,分别构建LAM耐药株质粒PHY634和ADV耐药株质粒PHY6923,再用耐药株的RT区段取代mPHY536207中的RT区构建重组质粒,命名为RT634（LAM耐药）及RT6923（ADV耐药）.分别用RT区置换前、后的质粒转染Huh7细胞,用ELISA法检测分泌到细胞上清液中的HBsAg水平,用实时PCR和Southern印迹法检测细胞内HBVDNA水平.结果 成功构建B型和C型野毒株表达质粒PHY536207和PHY97,经转染Huh7细胞证实有HBV复制能力,6孔细胞培养板中每孔细胞所抽提的HBV DNA均＞1＆#215;107拷贝/mL;在RT区上游设计的Pst Ⅰ酶切位点不影响HBV的表型（HBsAg的表达及HBV DNA的复制）.在PHY634及RT634转染实验中,HBV DNA水平却并未随LAM浓度的升高而明显下降,50％抑制浓度（IC50）＞100 μmol/L,mPHY536207仅为0.18 μmol/L;PHY6923及RT6923转染实验中,HBV DNA对外加的ADV不敏感,IC50＞100 μmol/L,明显高于mPHY536207（1.2 μmol/L）.结论 本研究建立了一种新的HBV表型耐药分析方法,可通过RT区置换来研究RT区变异对药物敏感性的影响. 展开更多

关键词 肝炎病毒 乙型 RNA指导的dna聚合酶 抗药性 表型

原文传递

miR-138靶基因hTERT的生物信息学预测及鉴定

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作者 陈陵 陈先华 +4 位作者 梁光萍 范亚川 王国威 宋航 邹利全 《实用肿瘤杂志》 CAS 2013年第6期579-582,共4页

目的预测并鉴定miR-138的靶基因人端粒酶反转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)。方法采用生物信息学技术,预测miR-138与hTERT 3'UTR结合位点及结合后稳定性。分别采用RTqPCR、Western blot技术检测过表达miR-138... 目的预测并鉴定miR-138的靶基因人端粒酶反转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)。方法采用生物信息学技术,预测miR-138与hTERT 3'UTR结合位点及结合后稳定性。分别采用RTqPCR、Western blot技术检测过表达miR-138后MKN-45细胞内hTERT在mRNA与蛋白水平的变化。采用双荧光素酶实验及突变实验,验证miR-138与hTERT mRNA的结合位点。结果生物信息学技术预测显示,miR-138可稳定结合于hTERT 3'UTR。miR-138过表达后可明显抑制MKN-45细胞内hTERT蛋白表达水平(P<0.01),但对hTERT mRNA水平无显著影响(P>0.05)。双荧光素酶实验证实miR-138可稳定结合于hTERT 3'UTR相应位点。结论 miR-138通过直接结合于靶基因hTERT 3'UTR抑制hTERT蛋白表达。miR-138可能成为基于miRNA的肿瘤基因治疗的新靶标。 展开更多

关键词 胃肿瘤 微RNAS 端粒 RNA指导的dna聚合酶 萤光素酶类 逆转录聚合酶链反应 基因表达

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纳米羟基磷灰石介导靶向hTERT的RNA干扰可有效抑制人肺癌A549细胞增殖

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作者 郑庆丰 王建军 +1 位作者 应敏刚 柳硕岩 《中华胸心血管外科杂志》 CSCD 北大核心 2010年第1期41-44,共4页

目的探讨纳米羟基磷灰石（nHAP）介导靶向端粒酶逆转录酶（hTERT）的RNA干扰对人肺癌A549细胞的影响。方法采用均相沉淀法制备nHAP。分为nHAP—PLL组、脂质体组、nHAP组及对照组，分别配制转染复合物并转染人肺癌A549细胞。MTT法测定细... 目的探讨纳米羟基磷灰石（nHAP）介导靶向端粒酶逆转录酶（hTERT）的RNA干扰对人肺癌A549细胞的影响。方法采用均相沉淀法制备nHAP。分为nHAP—PLL组、脂质体组、nHAP组及对照组，分别配制转染复合物并转染人肺癌A549细胞。MTT法测定细胞生长活力；Western Blot检测hTERT蛋白表达，流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果nHAP-PLL组、脂质体组与nHAP组的A549细胞增殖受到抑制，较对照组差异有统计学意义（P〈0．05）；nHAP—PLL组抑制细胞增殖较脂质体组及nHAP组明显，差异均有统计学意义（P〈0．05）。各组的hTERT蛋白表达的变化趋势与人肺癌A549细胞的增殖情况一致。流式细胞仪检测nHAP—PLL组、脂质体组及nHAP组均有不同程度的细胞凋亡，凋亡率与对照组差异有统计学意义，P〈0．05。结论nHAP本身能诱导人肺癌A549细胞凋亡，经PLL修饰后能有效地结合保护DNA并介导人肺癌A549细胞的基因转染，介导靶向hTERT的RNA干扰可有效抑制人肺癌A549细胞增殖。 展开更多

关键词 羟基磷灰石类 端粒 RNA指导的dna聚合酶 肺肿瘤 A549细胞 纳米颗粒

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肾母细胞瘤黑色素抗原基因-1mRNA的表达及临床意义

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作者 张媛 王常林 《临床小儿外科杂志》 CAS 2013年第2期90-92,共3页

目的探讨小儿肾母细胞瘤中黑色素抗原基因-1（MAGE-1）mRNA的表达及意义。方法用逆转录多聚酶链反应（RT—PCR）方法检测32例肾母细胞瘤组织、10例瘤旁组织、6例无瘤肾组织的MAGE-1mRNA的表达情况，并分析MAGE-1mRNA的表达与。肾母细胞... 目的探讨小儿肾母细胞瘤中黑色素抗原基因-1（MAGE-1）mRNA的表达及意义。方法用逆转录多聚酶链反应（RT—PCR）方法检测32例肾母细胞瘤组织、10例瘤旁组织、6例无瘤肾组织的MAGE-1mRNA的表达情况，并分析MAGE-1mRNA的表达与。肾母细胞瘤的病理分型、临床分期之间的关系。结果所有标本均有不同程度的MAGE-1mRNA表达，表达程度按肿瘤组织、瘤旁组织、无瘤组织依次降低。肿瘤组织是瘤旁组织的1．40倍（t=0．853，P〉0．05），是无瘤对照组的2．58倍（t=2．35，P〈0．05）。MAGE-1mRNA在肾母细胞瘤组织中的表达与病理分型及临床分期均无关（P〉0．05）。结论MAGE-1mRNA在肾母细胞瘤组织中呈高表达，提示MAGE-1mRNA可望成为肾母细胞瘤免疫治疗的靶抗原。 展开更多

关键词 基因 肾母细胞瘤 RNA指导的dna聚合酶

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