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菌落PCR技术在重组质粒筛选与鉴定中的应用 被引量：9
1
作者 李华 刘延琳 +1 位作者 夏惠 张振文 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2004年第9期35-37,共3页
　应用以菌落为模板的聚合酶链反应(PCR)技术,筛选插有酒类酒球菌苹果酸-乳酸酶基因mleA和苹果酸通透酶基因mleP序列的重组阳性克隆,筛选到的阳性克隆分别扩增到约1600bp及900bp的条带,且与两个目的基因片段大小一致。提取阳性克隆的质... 　应用以菌落为模板的聚合酶链反应(PCR)技术,筛选插有酒类酒球菌苹果酸-乳酸酶基因mleA和苹果酸通透酶基因mleP序列的重组阳性克隆,筛选到的阳性克隆分别扩增到约1600bp及900bp的条带,且与两个目的基因片段大小一致。提取阳性克隆的质粒进一步进行双酶切(EcoR -Kpn )及质粒PCR鉴定,证明结果正确。菌落PCR技术的应用使重组质粒的筛选和鉴定得以优化和简化。 展开更多
关键词 菌落PCR 重组质粒 苹果酸-乳酸酶基因 苹果酸通透酶基因
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重组质粒对大肠杆菌HB101生长影响的微量热研究 被引量：10
2
作者 刘义 王戈林 +2 位作者 赵儒铭 沈萍 屈松生 《化学学报》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2005年第4期327-331,共5页
用微量热方法研究了嗜麦芽假单胞菌AT18,受体菌大肠杆菌HB101,mel基因工程菌——大肠杆菌HB101/pWSY8和携带克隆载体pUC18质粒的大肠杆菌HB101等的生长代谢过程.实验结果从热化学和热动力学上阐明了细菌的生长速率常数与其所含质粒的大... 用微量热方法研究了嗜麦芽假单胞菌AT18,受体菌大肠杆菌HB101,mel基因工程菌——大肠杆菌HB101/pWSY8和携带克隆载体pUC18质粒的大肠杆菌HB101等的生长代谢过程.实验结果从热化学和热动力学上阐明了细菌的生长速率常数与其所含质粒的大小呈负相关.探讨了低温处理对含不同质粒大肠杆菌生长的影响,发现低温处理对工程菌生长影响最大. 展开更多
关键词 HB 大肠杆菌 重组质粒 携带 UC 克隆载体 生长影响 mel基因 工程菌 微量热
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猪带绦虫六钩蚴期特异性抗原基因真核表达质粒pcDNA3.1/TSO45-4B的构建 被引量：7
3
作者 方强 孙新 +5 位作者 夏惠 徐胜贵 胡守锋 杨小迪 陈兴智 王雪梅 《蚌埠医学院学报》 CAS 2006年第4期334-335,共2页
目的构建表达猪带绦虫六钩蚴期特异性抗原基因TSO45-4B的真核表达质粒pcDNA3.1/TSO45-4B。方法全基因合成TSO45-4B的基因序列,并利用PCR扩增该基因序列,将其插入真核表达载体pcDNA3.1,经酶切、测序鉴定。结果经酶切和测序鉴定表明所构... 目的构建表达猪带绦虫六钩蚴期特异性抗原基因TSO45-4B的真核表达质粒pcDNA3.1/TSO45-4B。方法全基因合成TSO45-4B的基因序列,并利用PCR扩增该基因序列,将其插入真核表达载体pcDNA3.1,经酶切、测序鉴定。结果经酶切和测序鉴定表明所构建的重组表达质粒中含有TSO45-4B基因。结论成功构建pcDNA3.1/TSO45-4B重组质粒。 展开更多
关键词 带绦虫 六钩蚴 TSO45-4B 重组质粒
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C-反应蛋白基因过表达诱导SD大鼠血压升高的实验研究 被引量：3
4
作者 侯津杰 唐家荣 +4 位作者 肖斌 周昌清 侯凌波 晏小妮 汪道文 《医学分子生物学杂志》 CAS CSCD 2008年第2期114-118,共5页
目的研究C-反应蛋白(C-reactive protein,CRP)重组质粒过表达诱导SD大鼠发生高血压,继而引起心血管功能障碍和重塑。方法18只SD大鼠随机分为3组,每组6只,分别给予尾静脉注射pcD-NA3·1-CRP重组质粒、pcDNA3·1空质粒及生理盐水... 目的研究C-反应蛋白(C-reactive protein,CRP)重组质粒过表达诱导SD大鼠发生高血压,继而引起心血管功能障碍和重塑。方法18只SD大鼠随机分为3组,每组6只,分别给予尾静脉注射pcD-NA3·1-CRP重组质粒、pcDNA3·1空质粒及生理盐水。定期检测尾动脉血压,28d后处死动物,并于处死动物前进行心脏血流动力学、血管张力及心血管系统重塑分析。结果实现C-反应蛋白在大鼠体内的过表达。与两个对照组相比较,pcDNA3·1-CRP组血压升高的同时,伴有心脏收缩与舒张功能的显著障碍,胸主动脉舒张功能显著降低,心血管系统重塑。结论炎性因子C-反应蛋白可以引起血压升高。 展开更多
关键词 C-反应蛋白 高血压 重组质粒 基因表达与调控
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人谷胱甘肽硫转移酶Pi基因的克隆及表达 被引量：1
5
作者 王智慧 吴逸明 吴拥军 《医药论坛杂志》 2004年第11期6-8,共3页
目的　克隆并表达人谷胱甘肽硫转移酶Pi(GSTPi)基因 ,为毒理学、遗传药理学及肿瘤的化学预防研究提供应用基础。方法　用RT -PCR技术从人胎盘 /肺脏组织获取GSTPi基因的cDNA序列 ,将其扩增产物GSTPi基因插入到原核表达载体pMAL -c2x中 ... 目的　克隆并表达人谷胱甘肽硫转移酶Pi(GSTPi)基因 ,为毒理学、遗传药理学及肿瘤的化学预防研究提供应用基础。方法　用RT -PCR技术从人胎盘 /肺脏组织获取GSTPi基因的cDNA序列 ,将其扩增产物GSTPi基因插入到原核表达载体pMAL -c2x中 ,鉴定重组表达质粒 ,并进行诱导表达。结果　构建了原核表达载体pMAL -c2x -GSTPi,通过诱导 ,在 85kDa的表达量约达到 35 %。结论　　实现了解毒酶基因GSTPi的克隆和高效表达菌株的构建。 展开更多
关键词 人谷胱甘肽硫转移酶Pi 基因克隆 基因表达 重组质粒 鉴定
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白念珠菌天冬氨酸蛋白酶基因SAP2在大肠杆菌中的表达及产物纯化 被引量：1
6
作者 李蕾 仇萌 邹先彪 《中国真菌学杂志》 CSCD 2013年第1期14-19,共6页
目的构建SAP 2重组原核表达载体并表达、纯化出可溶性的蛋白,为抗体制备及Sap2抗原检测奠定基础。方法提取白念珠菌基因组DNA为模板,经PCR方法获取SAP 2目的基因。双酶切SAP 2基因与原核表达载体pMAL-c2x(+),连接酶切产物,转化大肠杆菌T... 目的构建SAP 2重组原核表达载体并表达、纯化出可溶性的蛋白,为抗体制备及Sap2抗原检测奠定基础。方法提取白念珠菌基因组DNA为模板,经PCR方法获取SAP 2目的基因。双酶切SAP 2基因与原核表达载体pMAL-c2x(+),连接酶切产物,转化大肠杆菌TOP10感受态细菌,筛选菌落和测序鉴定。将pMAL-c2x/SAP2重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达出可溶性的融合蛋白,经直链淀粉树脂亲和层析、蛋白酶Factor Xa切割标签获得纯化的Sap2蛋白。结果经PCR扩增获得正确的SAP 2序列并定向插入原核表达载体pMAL-c2x(+)中。重组原核表达载体pMAL-c2x/SAP2经IPTG诱导14 h后表达出可溶性的融合蛋白,并经纯化、切除标签后得到目的蛋白。结论成功构建了白念珠菌天冬氨酸蛋白酶原核表达质粒pMAL-c2x/SAP2,该质粒在BL21(DE3)中可获得高效融合表达,通过亲和层析纯化及标签切割得到了氨基酸序列同天然蛋白一致的目的蛋白。 展开更多
关键词 白念珠菌 分泌型天冬氨酸蛋白酶 SAP2基因 重组质粒
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TNFR1及其突变体重组质粒的构建及肿瘤生物学功能的研究
7
作者 陈克清 于敏 +5 位作者 胡雪娜 冯玮 姜晓丹 尹丙姣 李卓娅 王晶 《中国肿瘤》 CAS 2011年第12期923-928,共6页
[目的]构建TNFR1及其突变体重组质粒,研究TNFR1胞浆段结构域与sTNF-α肿瘤生物学功能的关系。[方法]通过RT-PCR和重叠PCR,构建TNFR1-pEGFP-N1,Y236A-TNFR1-pEGFP-N1、ΔNSD-TNFR1-pEGFP-N1和ΔDD-TNFR1-pEGFP-N1。采用荧光显微镜观察TN... [目的]构建TNFR1及其突变体重组质粒,研究TNFR1胞浆段结构域与sTNF-α肿瘤生物学功能的关系。[方法]通过RT-PCR和重叠PCR,构建TNFR1-pEGFP-N1,Y236A-TNFR1-pEGFP-N1、ΔNSD-TNFR1-pEGFP-N1和ΔDD-TNFR1-pEGFP-N1。采用荧光显微镜观察TNFR1内吞、流式细胞术检测表达率、MTT比色法检测胞毒。[结果]获得了TNFR1全长基因及相关突变体的重组质粒,无任何其他点突变,移码及缺失突变。以这些质粒为工具进行生物学检测,提示野生型TNFR1可以介导sTNF-α内化,Y236A-TNFR1却不能,ΔNSD-TNFR1和ΔDD-TNFR1同样影响sTNF-α对靶细胞的胞毒作用。[结论]TNFR1内化结构域、NSD和DD功能域对sTNF-α杀伤肿瘤细胞的功能起着重要的作用。该研究有助于进一步认识sTNF-α介导的杀瘤效应与TNFR1的关系,并为深入研究tmTNF-α通过TNFR1介导的杀瘤机制提供重要的实验工具,从而为肿瘤基因治疗提供新的靶点。 展开更多
关键词 肿瘤坏死因子受体1(TNFR1) 分泌型肿瘤坏死因子(sTNF-α) 内吞 胞毒 重组质粒
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构建表达IL-10的重组乳酸杆菌
8
作者 邱志兵 钟良 +2 位作者 陈佳婕 戎兰 陈坚 《复旦学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2011年第2期163-167,共5页
目的构建表达IL-10的重组乳酸杆菌。方法人工合成信号肽系列后与IL-10基因连接后克隆到干酪乳酸杆菌(Lactobacillus casei,L.casei)整合型表达载体pIlac的lac启动子下游,得到重组质粒pIlac-sp-IL10,电穿孔转化L.caseiCECT 5276。挑选转... 目的构建表达IL-10的重组乳酸杆菌。方法人工合成信号肽系列后与IL-10基因连接后克隆到干酪乳酸杆菌(Lactobacillus casei,L.casei)整合型表达载体pIlac的lac启动子下游,得到重组质粒pIlac-sp-IL10,电穿孔转化L.caseiCECT 5276。挑选转化后的耐药菌落在含红霉素的培养基中培养,抽提染色体DNA,PCR及测序鉴定证实IL-10基因是否整合到L.casei的基因组中,Western blot检测重组蛋白表达。结果 IL-10基因整合到干酪乳酸杆菌的基因组中;重组L.casei产生的目的蛋白部分分泌进入培养上清。结论 IL-10在L.caseiCECT 5276中得到了分泌表达。 展开更多
关键词 干酪乳酸杆菌 IL-10 信号肽 重组质粒 目的蛋白
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人I型干扰素受体亚基表达对IFN-α抑制HBV复制水平的影响
9
作者 李多云 邓名贵 +7 位作者 郑金鑫 刘晓军 杨唯枝 王红燕 陈重 邓启文 邓向斌 余治健 《中国热带医学》 CAS 2015年第9期1044-1046,共3页
目的探讨人I型干扰素受体亚基(IFNAR1)不同表达水平对IFN-α抑制HBV复制的影响。方法扩增在前期构建的IFNAR1不同表达水平稳定Hep G2细胞(R1/H1、R1/H2、R1/H3株和对照细胞PS1、PGFP细胞),分别以瞬时转染HBV表达质粒pUC19-1.24HBV和对... 目的探讨人I型干扰素受体亚基(IFNAR1)不同表达水平对IFN-α抑制HBV复制的影响。方法扩增在前期构建的IFNAR1不同表达水平稳定Hep G2细胞(R1/H1、R1/H2、R1/H3株和对照细胞PS1、PGFP细胞),分别以瞬时转染HBV表达质粒pUC19-1.24HBV和对照质粒,培养24h后加入IFN-α,48h后收集细胞采用Southern blot检测HBVD-NA,荧光定量PCR检测细胞和上清HBVDNA水平。结果 Southern blot检测提示IFN-α干预后HBV复制水平在R1/H1和R1/H2细胞及R1/H3株中IFN-α抑制细胞内核壳颗粒HBVDNA活性显著高于PS1和PGFP细胞;荧光定量PCR结果提示R1/H3细胞中细胞和上清HBVDNA水平较R1/H1、R1/H2细胞系无显著下降。结论 IFNAR1蛋白表达水平不同可能导致IFN-α抑制HBV复制效应的差异。 展开更多
关键词 人I型干扰素受体亚基 IFNAR1基因 重组质粒 稳定表达细胞
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DXS8378基因座等位基因分型标准物的制备及其遗传多态性
10
作者 沈靓 魏曙光 +2 位作者 王科 李正堃 赖江华 《西安交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2008年第3期252-255,共4页
目的采用分子克隆技术制备X染色体DXS8378位点等位基因分型标准物,了解该STR位点在中国云南傈僳、普米、德昂三个群体的遗传多态性及其法医学应用价值。方法用PCR扩增和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术,分离各等位基因片段,回收纯化后进行... 目的采用分子克隆技术制备X染色体DXS8378位点等位基因分型标准物,了解该STR位点在中国云南傈僳、普米、德昂三个群体的遗传多态性及其法医学应用价值。方法用PCR扩增和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术,分离各等位基因片段,回收纯化后进行二次扩增,分别插入到pGEM(-T Easy质粒载体中,DNA测序证实插入片段的大小和结构,等位基因片段按国际标准进行命名后,经转化、扩大培养、扩增及再鉴定后制备出该位点的等位基因分型标准物,进行群体遗传学研究。结果得到DXS8378位点分型标准物,应用此分型标准物研究中国云南傈僳、普米、德昂族人群中基因型分布频率。结论该法制备的STR位点等位基因分型标准物适用于法医学鉴定实践,具有较高的应用价值,适合于群体遗传学的分析。 展开更多
关键词 分型标准物 短串联重复序列 重组质粒 遗传多态性 DXS8378
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高产稳产聚羟基烷酸的重组大肠杆菌的构建 被引量：10
11
作者 田杰生 宋海琛 +2 位作者 吴柏和 王珍芳 李季伦 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2000年第1期26-31,共6页
重组大肠杆菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉＨＭＳ１７４（ｐＴＺ１８ＵＰＨＢ） 含有携带聚羟基烷酸（ＰＨＡ） 合成基因（ ｐｈａＣＡＢ）＊＊ 的质粒ｐＴＺ１８ＵＰＨＢ，是很有潜力的ＰＨＡ 生产菌，但存在着质粒不稳定和不... 重组大肠杆菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉＨＭＳ１７４（ｐＴＺ１８ＵＰＨＢ） 含有携带聚羟基烷酸（ＰＨＡ） 合成基因（ ｐｈａＣＡＢ）＊＊ 的质粒ｐＴＺ１８ＵＰＨＢ，是很有潜力的ＰＨＡ 生产菌，但存在着质粒不稳定和不能合成３羟基丁酸（３ＨＢ） 与３羟基戊酸（３ＨＶ） 共聚物［Ｐ（３ＨＢｃｏ３ＨＶ）］ 的缺陷。将ＲＫ２ 质粒上的ｐａｒ ＤＥ 基因引入ｐＴＺ１８ＵＰＨＢ 构成质粒ｐＪＭＣ２ ，该质粒可以在宿主Ｅ．ｃｏｌｉＨＭＳ１７４ 中稳定遗传。将培养基中的磷酸盐浓度降至１８ ｍ ｍｏｌ／Ｌ，发现Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＭＳ１７４（ｐＪＭＣ２） 能够以丙酸为前体合成Ｐ（３ＨＢｃｏ３ＨＶ） ，其中３ＨＶ 在共聚物中的含量为５ ％ ～８ ％ 。在５Ｌ自动发酵罐中分批补料培养Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＭＳ１７４（ｐＪＭＣ２） ，培养基初始磷酸盐浓度为１５ ｍ ｍｏｌ／Ｌ，３０ ｈ 后每升培养液中干菌体可达４２－５ ｇ，Ｐ（３ＨＢｃｏ３ＨＶ） 占干重的７０ ％ ，其中３ＨＶ 在共聚物中的含量为４－９ ％ 。 展开更多
关键词 聚羟基烷酸 重组大肠杆菌 可降解塑料 发酵法
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葡萄病毒B的RT-PCR检测技术研究 被引量：5
12
作者 杨相昆 田海燕 +2 位作者 牛建新 王林 代永欣 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第5期97-100,106,共5页
旨在建立适合葡萄的葡萄病毒B的RT-PCR检测技术。从感染葡萄病毒B的葡萄皮层中提取总RNA,以其为模板合成cDNA第一链,并利用两对引物分别进行PCR扩增;回收PCR特异扩增产物,与pUCm-T载体连接,并进行转化、重组克隆的筛选、重组质粒的酶切... 旨在建立适合葡萄的葡萄病毒B的RT-PCR检测技术。从感染葡萄病毒B的葡萄皮层中提取总RNA,以其为模板合成cDNA第一链,并利用两对引物分别进行PCR扩增;回收PCR特异扩增产物,与pUCm-T载体连接,并进行转化、重组克隆的筛选、重组质粒的酶切鉴定和序列测定。结果显示,两对引物均能获得与预期片段大小一致长约460 bp和470 bp的扩增产物扩增片段序列与已报道GVB序列(序列号:X75448)的核苷酸同源性均为81%,经反复多次试验证实,利用总RNA为模板合成cDNA并进行PCR扩增检测GVB是准确、可靠的。 展开更多
关键词 葡萄病毒B 检测 重组质粒 序列 同源性
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D7S817、D10S1432、D10S1213及D18S865分型标准物的制备及其遗传多态性研究 被引量：2
13
作者 贾怡 饶莉 +3 位作者 周斌 陈国弟 廖淼 张林 《四川大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2003年第4期610-613,共4页
目的　利用重组质粒制备四个新的 STR基因座 (D7S817、D10 S14 32、D10 S12 13及 D18S86 5 )的分型标准物 ,并进行群体遗传学研究。方法　从聚丙烯酰胺凝胶中分离出经 PCR扩增后的等位基因片段 ,二次扩增后纯化的等位基因片段被分别插入... 目的　利用重组质粒制备四个新的 STR基因座 (D7S817、D10 S14 32、D10 S12 13及 D18S86 5 )的分型标准物 ,并进行群体遗传学研究。方法　从聚丙烯酰胺凝胶中分离出经 PCR扩增后的等位基因片段 ,二次扩增后纯化的等位基因片段被分别插入到 PU C质粒载体中。利用 DNA测序证实插入片段大小及结构的正确性后 ,用国际标准将插入的等位基因片段进行命名。再转染到适当的 E.coli DH5αTM细胞内选择培养 ,以纯化质粒为模板 ,扩增出各基因座的等位基因片段后混合。结果　得到四个 STR基因座 (D7S817、D10 S14 32、D10 S12 13及 D18S86 5 )分型标准物 ,应用所制备的分型标准物研究汉族和东乡族群体中的基因型分布频率。结论　制备出的四个 STR基因座的分型标准物在法科学领域中有很高的应用价值 。 展开更多
关键词 法医学 分型标准物 重组质控 短串联重复序列 遗传多态性
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重组干扰质粒对多药抗性Acc-3细胞Bcl-2基因表达作用实验研究
14
作者 张福军 季平 +1 位作者 李庆姝 张劲松 《医学研究杂志》 2007年第5期37-40,共4页
目的探讨重组干扰质粒对口腔腺样囊性癌多药抗性细胞株(Acc-3/CDDP)细胞中Bcl-2基因表达的干扰效率。方法按siRNA设计原则设计针对Bcl-2基因的Oligo DNA,体外化学合成Oligo DNA,Oligo DNA退火、连接、转化、筛选克隆,构建针对Bcl-2基因... 目的探讨重组干扰质粒对口腔腺样囊性癌多药抗性细胞株(Acc-3/CDDP)细胞中Bcl-2基因表达的干扰效率。方法按siRNA设计原则设计针对Bcl-2基因的Oligo DNA,体外化学合成Oligo DNA,Oligo DNA退火、连接、转化、筛选克隆,构建针对Bcl-2基因的表达重组RNA干扰质粒(psiB1、psiB2、psiB3),细胞脂质体转染多药抗性Acc-3/CDDP细胞,Real-time RT-PCR的标准曲线、扩增曲线和熔解曲线的数据收集处理,采用荧光定量RT-PCR方法检测重组干扰质粒对多药抗性Acc-3/CDDP细胞中Bcl-2基因表达的干扰效率。结果实时荧光定量RT-PCR方法检测psiB1、psiB2、psiB3质粒脂质体转染后Bcl-2基因的表达情况结果显示:psiB1、psiB3相对于对照组无明显干扰效果,psiB2的干扰程度达66.20%。结论针对Bcl-2基因的表达重组RNA干扰质粒psiB2(CCgggAgATAgTgATgAA)能有效沉默多药抗性Acc-3/CDDP细胞中Bcl-2基因的表达。 展开更多
关键词 重组干扰质粒 脂质体转染 基因表达 实时荧光定量RT-PCR
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μ型阿片受体的克隆及序列分析
15
作者 孙巧玲 陈京 白波 《泰山医学院学报》 CAS 2005年第1期1-3,共3页
目的　为实现人μ型阿片受体在哺乳动物细胞中的表达以及研究其生物学特性、下游基因表达及功能研究,克隆了人全长μ型受体cDNA。方法　从人脑组织中提取总RNA ,通过逆转录巢式PCR ,扩增μ受体全长cDNA。克隆至pMD1 8 -T载体中,并进行... 目的　为实现人μ型阿片受体在哺乳动物细胞中的表达以及研究其生物学特性、下游基因表达及功能研究,克隆了人全长μ型受体cDNA。方法　从人脑组织中提取总RNA ,通过逆转录巢式PCR ,扩增μ受体全长cDNA。克隆至pMD1 8 -T载体中,并进行了酶切、PCR鉴定及测序分析。结果　获得大小1 2 2 9bp大小的μ受体全长cDNA基因,并构建到载体中,为研究受体信号转导下游基因的表达奠定理论基础。结论　利用巢式RT PCR法成功克隆了的μ受体全长cDNA序列,构建了pT -MD/hμR质粒。 展开更多
关键词 μ型阿片受体cDNA 巢式PCR 重组pT-MD/hμR质粒
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布鲁氏菌分子标记、毒力缺失疫苗株△S19-2的构建 被引量：17
16
作者 闫广谋 王兴龙 +5 位作者 任林柱 刘锴 高建勇 王学理 张辉 李晓燕 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第5期690-694,699,共6页
通过构建自杀质粒,用定向同源重组的方法,把改造的萤火虫萤光素酶报告基因Luc NF+替换布鲁氏菌S19疫苗株Bp26基因部分片段,构建出布鲁氏菌Bp26基因缺失突变株△S19-1。在此基础上,用同样的方法,敲除△S19-1上的毒力基因Bmp18,构建成△S1... 通过构建自杀质粒,用定向同源重组的方法,把改造的萤火虫萤光素酶报告基因Luc NF+替换布鲁氏菌S19疫苗株Bp26基因部分片段,构建出布鲁氏菌Bp26基因缺失突变株△S19-1。在此基础上,用同样的方法,敲除△S19-1上的毒力基因Bmp18,构建成△S19-2。用PCR与萤光素酶报告基因在布鲁氏菌中表达的方法进行验证,结果表明Bp26基因与Bmp18基因改造成功,△S19-2具有Bp26基因分子标记、Bmp18毒力基因缺失的特点。 展开更多
关键词 布鲁氏菌 Bp26 分子标记 Bmp18 毒力缺失 同源重组 自杀质粒 LucNF+ sacB
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重组水蛭素Ⅲ工程菌菌种稳定性考察 被引量：5
17
作者 韦利军 阮期平 +1 位作者 郭海 吴梧桐 《药物生物技术》 CAS CSCD 2004年第2期86-90,共5页
研究基因工程菌E .coliAS1.35 7在LB培养基中传代 5 0代过程中菌种的稳定性。以菌体和菌落的形态、质粒稳定性 (ST)、质粒酶切图谱和水蛭素的表达量以及比活等方面进行考察 ,以评价工程菌的稳定性。重组水蛭素Ⅲ工程菌在传代 5 0代的过... 研究基因工程菌E .coliAS1.35 7在LB培养基中传代 5 0代过程中菌种的稳定性。以菌体和菌落的形态、质粒稳定性 (ST)、质粒酶切图谱和水蛭素的表达量以及比活等方面进行考察 ,以评价工程菌的稳定性。重组水蛭素Ⅲ工程菌在传代 5 0代的过程中质粒稳定性高 ,传代 10代内质粒稳定性 (ST)为 98% ,且表达稳定 ,表达产物可达发酵液可溶性蛋白总量的 6 0 % ,产物的抗凝血酶活力大于 2 .0× 10 3 ATU/ml,传代 5 0代的菌体与菌落呈典型的大肠杆菌形态。重组水蛭素Ⅲ工程菌菌种稳定。 展开更多
关键词 重组水蛭素 质粒稳定性 工程菌稳定性
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变形链球菌AI-2活性测定及luxS基因同源重组质粒的构建 被引量：8
18
作者 于丹妮 韩育植 +1 位作者 韩福胜 陈杰 《中华口腔医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第1期37-40,共4页
目的构建用于转化变形链球菌的luxS基因缺失的同源重组克隆载体。方法利用哈氏弧菌（Vibrio harveyi）BB170作为报告菌株，对变形链球菌在不同生长时期诱导生物发光的能力进行测定，然后分别PCR扩增变链菌luxS基因上下游片段及质粒PJT1... 目的构建用于转化变形链球菌的luxS基因缺失的同源重组克隆载体。方法利用哈氏弧菌（Vibrio harveyi）BB170作为报告菌株，对变形链球菌在不同生长时期诱导生物发光的能力进行测定，然后分别PCR扩增变链菌luxS基因上下游片段及质粒PJT10的红霉素抗性基因片段，采用分子克隆技术将基因片段依次双酶切后连接人载体pUC19，构建luxS基因缺失的重组质粒，转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞经筛选后，抽提重组质粒，进行酶切鉴定。结果变链菌国际标准株可诱导哈氏弧菌BB170的生物发光现象，提示变链菌中存在AI-2数量感应通路。构建的重组质粒pUCluxKO经PstI-BamHI双酶切，产物电泳在大约1000bp和5000bp处各见一条特异条带；经BamHI—KpnI双酶切，产物电泳在大约1500bp和4500bp处各见一条特异条带；经KpnI—EcoRI双酶切后，产物电泳在大约1000bp和5000bp处各见一条特异条带。结论变链菌luxS基因同源重组质粒构建成功，为进一步通过同源重组法构建变链菌luxS基因缺陷株奠定基础。 展开更多
关键词 链球菌 变异 自身分泌性细胞间通讯 基因 重组质粒
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碱裂解法提取重组质粒DNA及PCR验证 被引量：7
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作者 都艳霞 沙伟 张梅娟 《生物技术》 CAS CSCD 北大核心 2009年第2期35-37,共3页
目的:筛选获得高质量质粒,为进一步克隆、测序奠定基础。方法:采用常规的碱裂解法从大肠杆菌重组质粒中提取质粒DNA,核酸检测仪测定提取质粒DNA产量和纯度,并用前期DDRT-PCR时采用的引物进行PCR验证性实验,琼脂糖凝胶电泳检测,并对电泳... 目的:筛选获得高质量质粒,为进一步克隆、测序奠定基础。方法:采用常规的碱裂解法从大肠杆菌重组质粒中提取质粒DNA,核酸检测仪测定提取质粒DNA产量和纯度,并用前期DDRT-PCR时采用的引物进行PCR验证性实验,琼脂糖凝胶电泳检测,并对电泳图谱加以分析和鉴定。结果:利用常规的碱裂解法提取重组质粒,通过酚和氯仿的抽提,可以有效地去除蛋白质杂质,用含有RNase抑制剂的无菌水溶解质粒提取效果最好,得到的质粒DNA无RNA污染,纯度比较高,OD260/OD280比值介于1.8～2.0之间,OD260/OD230比值大于2.0,经PCR反应验证后与预计相符。结论:通过该方法获得的重组质粒纯度和浓度都比较高,且PCR验证与预计相一致,可以满足后续分子生物学实验的要求。 展开更多
关键词 碱裂解法 重组质粒 PCR 琼脂糖凝胶电泳
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丙二酸盐克罗诺杆菌rpoS基因突变株与回补株的构建
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作者 姚悦 叶应旺 +2 位作者 凌娜 王洋 李杨 《合肥工业大学学报（自然科学版）》 CAS 北大核心 2024年第5期673-677,共5页
丙二酸盐克罗诺杆菌(Cronobacter malonaticus)在面对环境胁迫时,通过自身调节机制适应压力。rpoS基因作为一种稳定期σ因子和压力应答过程中的主要调节因子,在细菌抵抗或耐受环境胁迫压力中发挥重要作用。文章运用red同源重组技术和质... 丙二酸盐克罗诺杆菌(Cronobacter malonaticus)在面对环境胁迫时,通过自身调节机制适应压力。rpoS基因作为一种稳定期σ因子和压力应答过程中的主要调节因子,在细菌抵抗或耐受环境胁迫压力中发挥重要作用。文章运用red同源重组技术和质粒表达系统,构建C.malonaticus G362的rpoS基因缺失株ΔrpoS和回补菌株ΔrpoS-com,为研究丙二酸盐克罗诺杆菌中rpoS基因的功能提供遗传材料。生长曲线测定结果表明,rpoS基因缺失未对正常培养条件下细菌生长产生显著影响。 展开更多
关键词 丙二酸盐克诺罗杆菌 同源重组 质粒表达 rpoS基因
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