摘要
目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5ATP1反式激活的相关基因,从分子生物学的角度研究HCV致病机制。方法:以NS5ATP1表达质粒pcDNA3.1(-)-NS5ATP1转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)转染的HepG2细胞为对照组,从中分别提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaⅠ酶切后将实验组cDNA分成2组,分别与2种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行2次消减杂交及2次抑制性聚合酶链反应(PCR)扩增,将产物与pGEM-Teasy载体连接,构建cDNA消减文库,并转化大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆经PCR扩增后进行测序及生物信息学分析。结果:成功构建NS5ATP1反式激活基因差异表达的cDNA消减文库。文库扩增后将阳性克隆经菌落PCR分析,得到90个200～1000bp的插入片断。挑选含插入片段的30个克隆进行测序,通过生物信息学分析得到3种已知序列的基因(Ras癌基因家族成员RAN、DNA依赖的RNA聚合酶Ⅱ多肽C、核糖体蛋白L2)和1个未知功能的序列(推测为新基因)。结论:筛选得到的cDNA基因全长序列包括一些与细胞基因表达及恶性转化相关的蛋白质编码基因,为HCVNS5A可能存在的调控机制提供新的线索。
Aim:To screen and clone the target genes transactivated by HCV NS5ATP1 gene by using suppression subtractive hybridization(SSH)technique.Methods:The mRNA was isolated from HepG2 transfected by pcDNA3.1(-)-NS5ATP1 and pcDNA3.1(-)empty vector,respectively.And SSH method was employed to analyze the differentially expressed DNA sequence between the two groups.After restriction enzyme RsaⅠ digestion,small size cDNAs were obtained.The tester cDNA was divided into two groups and ligated to the specific adaptor 1 a...
出处
《郑州大学学报（医学版）》
CAS
北大核心
2007年第4期638-641,共4页
Journal of Zhengzhou University(Medical Sciences)
基金
国家自然科学基金资助项目C03011402
C30070689
军队"九五"科技攻关基金资助项目98D063
军队回国留学人员启动基金资助项目98H038
军队"十五"科技攻关青年基金资助项目01Q138
军队"十五"科技攻关基金资助项目01MB135
