目的构建人源性老年痴呆(AD)单链噬菌体抗体库,为进一步筛选AD相关抗原的人源性抗体奠定基础。方法从200 ml AD病人的外周血中分离B淋巴细胞,提取总RNA,经逆转录合成总cDNA。以PCR技术,利用特定的引物分别扩增出人抗体的重链和轻链可变...目的构建人源性老年痴呆(AD)单链噬菌体抗体库,为进一步筛选AD相关抗原的人源性抗体奠定基础。方法从200 ml AD病人的外周血中分离B淋巴细胞,提取总RNA,经逆转录合成总cDNA。以PCR技术,利用特定的引物分别扩增出人抗体的重链和轻链可变区基因片段(VH、VL),并分别克隆入噬菌粒pDAN5中,构建出含人单链抗体可变区(scFv)基因序列的pDAN5克隆载体,电转化感受态大肠杆菌XLI-Blue后,经辅助噬菌体M13KO7超感染后回收全部重组噬菌体,构建成初级噬菌体抗体库。从抗体库中随机挑选数个克隆,提取质粒,PCR扩增目的片段后,用内切酶BstNⅠ消化,每个克隆经消化后的DNA指纹印迹用琼脂糖凝胶电泳分析,评价抗体库的多样性。结果所有抗体VH和VL基因片段均得到了扩增并成功克隆及转化,经辅助噬菌体感染后,构建成初级抗体库。BstNⅠ消化后的DNA指纹图谱显示各克隆抗体基因各不相同,经计算构建的噬菌体抗体库容量为1.5×106。结论利用噬菌体抗体库技术成功构建了AD病人的单链可变区噬菌体抗体库。展开更多
文摘目的构建人源性老年痴呆(AD)单链噬菌体抗体库,为进一步筛选AD相关抗原的人源性抗体奠定基础。方法从200 ml AD病人的外周血中分离B淋巴细胞,提取总RNA,经逆转录合成总cDNA。以PCR技术,利用特定的引物分别扩增出人抗体的重链和轻链可变区基因片段(VH、VL),并分别克隆入噬菌粒pDAN5中,构建出含人单链抗体可变区(scFv)基因序列的pDAN5克隆载体,电转化感受态大肠杆菌XLI-Blue后,经辅助噬菌体M13KO7超感染后回收全部重组噬菌体,构建成初级噬菌体抗体库。从抗体库中随机挑选数个克隆,提取质粒,PCR扩增目的片段后,用内切酶BstNⅠ消化,每个克隆经消化后的DNA指纹印迹用琼脂糖凝胶电泳分析,评价抗体库的多样性。结果所有抗体VH和VL基因片段均得到了扩增并成功克隆及转化,经辅助噬菌体感染后,构建成初级抗体库。BstNⅠ消化后的DNA指纹图谱显示各克隆抗体基因各不相同,经计算构建的噬菌体抗体库容量为1.5×106。结论利用噬菌体抗体库技术成功构建了AD病人的单链可变区噬菌体抗体库。
