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干扰Fas受体表达的串联shRNA表达载体的构建 被引量：6
1
作者 刘明社 王兰 +3 位作者 赵中夫 张国英 张芸 封江南 《世界华人消化杂志》 CAS 北大核心 2006年第22期2174-2179,共6页
目的:利用pEGFP6-1和pGenesil-1质粒构建针对Fas的2个短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)串联表达的栽体．方法:设计表达2个shRNA结构的互补DNA序列,经退火成双链,分别克隆至带有U6启动子的质粒载体pEGFP6-1和pGenesil-1中,构建重组质... 目的:利用pEGFP6-1和pGenesil-1质粒构建针对Fas的2个短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)串联表达的栽体．方法:设计表达2个shRNA结构的互补DNA序列,经退火成双链,分别克隆至带有U6启动子的质粒载体pEGFP6-1和pGenesil-1中,构建重组质粒,转化大肠杆菌DH5α菌株,扩增,提取质粒,酶切鉴定后测序分析．分别用SacI+ SalI双酶切重组质粒,胶回收酶切pEGFP6- 1-siFas1大片段和酶切pGenesil-1-siFas2小片段,T4 DNA Ligase连接酶切大、小片段,得到pEGFP6-1-siFas1+siFas2重组质粒．转化感受态细胞DH5α,扩增,提取串联重组质粒进行酶切鉴定．结果:成功构建靶向Fas的2个shRNA串联重组质粒载体pEGFP6-1-siFas1+siFas2．酶切鉴定和测序分析重组质粒,shRNA编码序列与设计的片段完全一致,经酶切凝胶电泳证实载体构建成功．结论:表达2个靶向Fas的shRNA表达框成功构建在一个重组质粒载体上． 展开更多
关键词 FAS RNAI SHRNA 串联质粒
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短发夹RNA靶向抑制suvivin基因对人胶质瘤U251细胞凋亡和细胞周期的影响 被引量：5
2
作者 徐如祥 涂艳阳 +1 位作者 姜晓丹 封江南 《第四军医大学学报》 北大核心 2006年第10期920-922,共3页
目的构建表达靶向抑制survivin基因的表达短发夹结构(shRNA)的RNA干扰载体,导入人胶质瘤细胞U251中,研究靶向抑制survivin基因对U251细胞的凋亡诱导以及细胞周期阻滞作用.方法在survivin全长序列中选取设计3条含19个核苷酸(19nt)靶序列... 目的构建表达靶向抑制survivin基因的表达短发夹结构(shRNA)的RNA干扰载体,导入人胶质瘤细胞U251中,研究靶向抑制survivin基因对U251细胞的凋亡诱导以及细胞周期阻滞作用.方法在survivin全长序列中选取设计3条含19个核苷酸(19nt)靶序列两条反向重复序列,中间以9个核苷酸的茎环序列,两端分别加上对应的酶切位点,分步酶切连接,构建出含有3条shRNA模板且能独立编码shRNA的重组干扰载体pGenesil-1/survivin;采用Metafectene转染试剂将干扰质粒导入到胶质瘤细胞U251;采用荧光定量PCR以及Westernbloting分别从mRNA和蛋白水平检测干扰效果;采用Annexin-V/PI双色标记的流式细胞仪法检测siRNA诱导的细胞凋亡,PI染色检测细胞周期阻滞.结果实时荧光定量PCR以及Westernblotting检测显示,survivin基因的mRNA转录水平以及蛋白水平的表达均得到显著抑制;流式细胞仪检测分析显示,survivin基因表达被抑制后,U251细胞凋亡率明显增高,细胞周期出现明显的G2/M阻滞.结论靶向survivin基因的重组siRNA干扰载体pGenesi-l/survivin介导的RNAi显著靶向抑制了survivin基因在人胶质瘤细胞U251中的表达,并明显地诱导了U251细胞发生凋亡和G2/M期细胞周期阻滞. 展开更多
关键词 短发卡RNA SURVIVIN 细胞凋亡
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小分子干扰RNA靶向抑制suvivin基因诱导U251细胞凋亡的实验研究 被引量：3
3
作者 徐如祥 涂艳阳 +2 位作者 姜晓丹 封江南 黄俊 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第4期398-401,共4页
目的构建靶向survivin基因的小分子干扰RNA(siRNA)表达载体,导入人胶质瘤细胞U251中,研究siRNA靶向抑制survivin基因对U251细胞的凋亡诱导作用。方法根据siRNA设计原则,在survivin全长序列中选取设计含19个核苷酸(19nt)靶序列两条反向... 目的构建靶向survivin基因的小分子干扰RNA(siRNA)表达载体,导入人胶质瘤细胞U251中,研究siRNA靶向抑制survivin基因对U251细胞的凋亡诱导作用。方法根据siRNA设计原则,在survivin全长序列中选取设计含19个核苷酸(19nt)靶序列两条反向重复序列,间以9个核苷酸的茎环序列,两端分别加上对应的酶切位点,形成siRNA的 DNA模板并克隆到siRNA表达载体pGenesil-1中,获得靶向抑制survivin基因的siRNA表达载体pGenesil-1／survivin; 采用Metafectene转染试剂将干扰质粒导入到胶质瘤细胞U251;分别采用实时荧光定量PCR以及Western bloting从 mRNA和蛋白水平检测干扰效果;采用Annexin-V／PI双色标记的流式细胞仪法检测siRNA诱导的细胞凋亡。结果实时荧光定量PCR以及Western blotting显示:survivin基因的mRNA转录水平以及蛋白水平的表达均得到显著抑制;流式细胞仪检测结果显示:survivin基因表达被抑制后,U251细胞凋亡率明显增高。结论靶向survivin基因的重组siRNA 干扰载体pGenesi-1／survivin介导的RNAi显著靶向抑制了survivin基因在人胶质瘤细胞U251中的表达,并明显诱导了U251细胞发生凋亡。 展开更多
关键词 小分子干扰RNA suvivin基因 胶质瘤 U251细胞 细胞凋亡
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串联表达Fas shRNA腺病毒载体的构建 被引量：2
4
作者 刘明社 赵中夫 +4 位作者 王兰 张国英 张芸 杨慧 封江南 《中国药物与临床》 CAS 2006年第11期826-830,共5页
目的利用串联表达质粒pEGFP6-1-siFas1+siFas2和BDAdeno-X系统构建腺病毒表达Fas-shRNA载体。方法双酶切pEGFP6-1-siFas1+siFas2串联表达质粒和pShuttle2质粒,T4DNA连接酶连接胶回收片段,转化感受态Escherichiacoli(E.coli)DH5α菌株,... 目的利用串联表达质粒pEGFP6-1-siFas1+siFas2和BDAdeno-X系统构建腺病毒表达Fas-shRNA载体。方法双酶切pEGFP6-1-siFas1+siFas2串联表达质粒和pShuttle2质粒,T4DNA连接酶连接胶回收片段,转化感受态Escherichiacoli(E.coli)DH5α菌株,挑取单克隆菌落LB(Luria-Bertani)培养基中扩增培养;小量质粒试剂盒提取pShuttle2-siFas1+siFas2质粒,酶切鉴定;双酶切pShuttle2-siFas1+siFas2质粒,T4DNA连接酶连接酶切产物和腺病毒BDAdeno-XViralDNA。回收连接产物,SwaI酶切去除未重组的腺病毒质粒,再回收酶切产物,转化感受态E.coliDH5α;聚合酶链反应(PCR)筛选鉴定阳性克隆;提取pAdeno-siFas1+siFas2质粒,进一步酶切鉴定;重组腺病毒pAdeno-siFas1+siFas2质粒线性化,经脂质体转染HEK293A细胞;收细胞进行裂解收病毒。结果构建表达2个Fas-shRNA的串联重组腺病毒载体pAdeno-siFas1+siFas2,经酶切鉴定和PCR分析,重组腺病毒质粒构建正确;经HEK293A细胞包装成功。结论成功构建表达2个Fas-shRNA的串联重组腺病毒载体pAdeno-siFas1+siFas2,为进一步转染细胞和感染小鼠抑制Fas基因表达奠定了基础。 展开更多
关键词 抗原 CD95 shRNA(Short HAIRPIN RNA) 腺病毒科
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马立克氏病病毒超强毒UL49基因siRNA表达质粒的构建与鉴定 被引量：2
5
作者 缪德年 王秀花 +4 位作者 封江南 姚惠娟 吴琼杉 樊生超 陈溥言 《南京农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第3期137-139,共3页
以马立克氏病病毒超强毒(RB1B株)UL49为靶基因,利用计算机辅助设计UL49基因特异的siRNA,再定向克隆至pSilencerTM2.1U6neovector载体中构建siRNA表达重组体,转化DH5α菌株,提取质粒酶切鉴定后,进行测序分析,证实为所需序列。以上结果表... 以马立克氏病病毒超强毒(RB1B株)UL49为靶基因,利用计算机辅助设计UL49基因特异的siRNA,再定向克隆至pSilencerTM2.1U6neovector载体中构建siRNA表达重组体,转化DH5α菌株,提取质粒酶切鉴定后,进行测序分析,证实为所需序列。以上结果表明,针对马立克氏病超强毒UL49基因的siRNA表达质粒已构建成功。 展开更多
关键词 马立克氏病 RB1B株 UL49基因 SIRNA 表达质粒
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AFP和IL-18双表达腺病毒转染DC肝癌瘤苗的制备及表达 被引量：1
6
作者 张吉成 王弼 +3 位作者 贾军 封江南 陈涛 陈燕凌 《第四军医大学学报》 CAS 北大核心 2009年第18期1768-1771,共4页
目的:制备IL-18基因修饰的树突状细胞AFP瘤苗,探索增强肝癌树突状细胞免疫治疗效果的新途径.方法:构建和制备rAd-IL18-AFP双基因表达的重组腺病毒,转染DC,应用RT-PCR和Western Blot方法检测IL-18和AFP基因在DC中的蛋白表达.结果:成功制... 目的:制备IL-18基因修饰的树突状细胞AFP瘤苗,探索增强肝癌树突状细胞免疫治疗效果的新途径.方法:构建和制备rAd-IL18-AFP双基因表达的重组腺病毒,转染DC,应用RT-PCR和Western Blot方法检测IL-18和AFP基因在DC中的蛋白表达.结果:成功制备IL-18基因修饰的树突状细胞AFP瘤苗,rAd-IL18-AFP介导的IL-18和AFP基因能够在DC中进行蛋白表达.结论:成功制备IL-18基因修饰的树突状细胞AFP瘤苗,为进一步的肝癌免疫基因治疗研究打下基础. 展开更多
关键词 白细胞介素18 树突状细胞瘤苗 甲胎蛋白 肝癌 基因治疗
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RNAi沉默Fas受体表达的腺病毒载体构建
7
作者 刘明社 赵中夫 +3 位作者 王兰 张国英 张芸 封江南 《长治医学院学报》 2006年第3期161-165,共5页
目的:利用pEGFP6-1和pGenesil-1质粒构建针对小鼠Fas的2个短发卡状RNA(short hairpinRNA,shRNA)串联表达的载体pEGFP6-1-siFas1+siFas2,进一步通过BDAdeno-X系统构建腺病毒表达Fas-shRNA载体。方法:设计表达2个短发卡状RNA结构的互补DN... 目的:利用pEGFP6-1和pGenesil-1质粒构建针对小鼠Fas的2个短发卡状RNA(short hairpinRNA,shRNA)串联表达的载体pEGFP6-1-siFas1+siFas2,进一步通过BDAdeno-X系统构建腺病毒表达Fas-shRNA载体。方法:设计表达2个短发卡状RNA结构的互补DNA序列分别克隆至质粒载体pEGFP6-1和pGenesil-1中,酶切pEGFP6-1-siFas1大片段和酶切pGenesil-1-siFas2小片段,经T4DNALigase连接得到pEGFP6-1-siFas1+siFas2重组质粒。双酶切重组质粒和pShuttle2穿梭质粒,经T4DNA连接酶连接得到pShuttle2-siFas1+siFas2质粒。双酶切重组穿梭质粒,连接酶切产物和腺病毒转化感受态E.coilDH5а,PCR筛选鉴定阳性克隆,进一步线性化重组腺病毒pAdeno-siFas1+siFas2质粒,经脂质体转染HEK293A细胞;收细胞进行裂解收病毒。结果:构建的重组质粒载体经酶切鉴定和测序分析,shRNA编码序列与设计的片段完全一致;重组腺病毒载体经酶切鉴定和PCR分析正确;经HEK293A细胞包装成功,能够表达绿色荧光蛋白。结论:成功构建Fas-shRNA腺病毒串联表达载体。 展开更多
关键词 Fas(CD95) RNAI 腺病毒载 SHRNA 串联
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短发夹RNA靶向抑制suvivin基因在人胶质瘤细胞U251中的表达 被引量：3
8
作者 涂艳阳 徐如祥 +2 位作者 王向宇 姜晓丹 封江南 《中华神经医学杂志》 CAS CSCD 2006年第6期579-582,共4页
目的构建表达靶向抑制survivin基因的三个短发夹结构(shRNA)的RNA干扰载体,使其在胶质瘤细胞发挥干扰效应。方法在survivin全长序列中选取设计3条19个核苷酸靶序列,2条反向重复序列,间以9个核苷酸的茎环序列,加上对应酶切位点,形成3条sh... 目的构建表达靶向抑制survivin基因的三个短发夹结构(shRNA)的RNA干扰载体,使其在胶质瘤细胞发挥干扰效应。方法在survivin全长序列中选取设计3条19个核苷酸靶序列,2条反向重复序列,间以9个核苷酸的茎环序列,加上对应酶切位点,形成3条shRNA的DNA模板,分别克隆到3个干扰载体pG1,pG2和pG3上：采用分布酶切连接的方法,分别将U6启动子以及下游的后2个shRNA模板酶切下来,依次连接到pG1对应酶切位点,构建出含有3条shRNA模板且能独立编码shRNA的重组干扰载体pGenesil-survivin,测序鉴定：将干扰质粒导入到胶质瘤细胞U251,分别采用RT-PCR以及Western Bloting从mRNA和蛋白水平检测干扰后效果。结果重组的干扰载体含有3条正确的shRNA模板；RT-PCR以及Western Blotting检测显示,survivin的mRNA转录水平以及蛋白水平的表达均得到显著抑制。结论编码3条shRNA的干扰载体pGenesil-survivin介导的RNA干扰技术(RNAi)可以显著的靶向抑制survivin基因在人胶质瘤细胞U251中的表达。 展开更多
关键词 短发夹RNA SURVIVIN基因 神经胶质瘤
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