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猪源IKKγ在原核和真核表达系统中的表达及其多克隆抗体制备 被引量：5
1
作者 赵祥秀 黄茂发 +5 位作者 高跃美 唐榕泽 胡仁俊 梁晶晶 李晓宁 罗廷荣 《南方农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第12期3099-3108,共10页
【目的】制备猪源IKKγ多克隆抗体,为进一步研究IKKγ蛋白生物学特性及揭示IKKγ蛋白与猪瘟病毒(CSFV)间相互作用机制打下基础。【方法】利用RT-PCR从猪肾细胞(PK-15)中克隆原核表达的IKKγ基因功能片段(561 bp),与原核表达载体pET-32a... 【目的】制备猪源IKKγ多克隆抗体,为进一步研究IKKγ蛋白生物学特性及揭示IKKγ蛋白与猪瘟病毒(CSFV)间相互作用机制打下基础。【方法】利用RT-PCR从猪肾细胞(PK-15)中克隆原核表达的IKKγ基因功能片段(561 bp),与原核表达载体pET-32a(+)构建原核重组质粒pET-IKKγ,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后进行IPTG诱导表达,表达的融合蛋白经纯化和浓缩后,免疫小鼠制备猪源IKKγ多克隆抗体。同时克隆IKKγ基因全长序列(1356 bp),与真核表达载体pCMV-HA构建真核重组质粒pCMV-HA-IKKγ,分别转染293T细胞和PK-15细胞,检测融合蛋白表达情况。【结果】以原核重组质粒pET-IKKγ转化BL21感受态细胞,经IPTG诱导能表达出约40 kD的融合蛋白,且融合蛋白主要以可溶性蛋白形式进行表达,可通过Ni-NTA亲和层析柱进行纯化,已获得较高纯度的融合蛋白IKKγ。构建的真核重组质粒pCMV-HA-IKKγ能在293T细胞中成功表达出IKKγ蛋白;制备获得的猪源IKKγ多克隆抗体能与293T细胞表达融合蛋白IKKγ发生特异性反应,其抗体效价为1∶16000,与PK-15细胞表达IKKγ蛋白也具有良好的反应性,其中CSFV感染后36 h是IKKγ蛋白表达高峰期。此外,制备获得的猪源IKKγ多克隆抗体能在PK-15细胞中成功检测到IKKγ蛋白,说明猪源IKKγ多克隆抗体与真核细胞瞬时表达的IKKγ蛋白特异性良好。【结论】制备获得的猪源IKKγ多克隆抗体具有效价高、特异性强等特点,可用于检测CSFV感染PK-15细胞中IKKγ蛋白表达水平,为下一步研究IKKγ蛋白生物学特性及揭示NF-κB信号通路转录调节功能机制提供技术支持。 展开更多
关键词 IKKγ 猪瘟病毒(CSFV) 原核表达 真核表达 多克隆抗体
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普通野生稻苗期耐冷性QTLs的互作和聚合效应分析 被引量：4
2
作者 郑加兴 张月雄 +7 位作者 覃宝祥 邱永福 蒙姣荣 刘芳 马增凤 刘驰 李容柏 陈保善 《华南农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第1期29-36,共8页
【目的】普通野生稻Oryza rufipogon Griff.蕴含丰富的遗传多样性,对其进行耐冷性数量性状位点(QTLs)的挖掘和效应分析,可为水稻耐冷性分子育种提供宝贵的基因资源和理论支持.【方法】以籼稻品种9311为受体亲本、普通野生稻品系DP15和D... 【目的】普通野生稻Oryza rufipogon Griff.蕴含丰富的遗传多样性,对其进行耐冷性数量性状位点(QTLs)的挖掘和效应分析,可为水稻耐冷性分子育种提供宝贵的基因资源和理论支持.【方法】以籼稻品种9311为受体亲本、普通野生稻品系DP15和DP30为供体亲本,构建染色体片段代换系,鉴定了18个水稻苗期耐冷QTLs,将其中分别包含4个耐冷QTL且遗传背景一致的4个代换系qSCT-1-CSSL、qSCT-4-CSSL、qSCT-8-CSSL和qSCT-12-CSSL分别两两杂交得到2个聚合系(qSCT-1/qSCT-12)-CSSL和(qSCT-4/qSCT-8)-CSSL,对聚合系中各耐冷QTL的互作效应及聚合效应进行研究.【结果和结论】4个耐冷QTL对水稻耐冷性有加性效应;互作分析显示各耐冷QTL间在聚合系中均存在正向互作.聚合效应在qSCT-4与qSCT-8间表现为QTL间明显的累加效应,而qSCT-1与qSCT-12间聚合的累加效应不明显,表现为qSCT-12对qSCT-1有上位作用. 展开更多
关键词 普通野生稻 耐冷性 数量性状位点(QTLs) 染色体片段代换系 聚合效应
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一个用于黄单胞菌核开关筛选鉴定的GUS报告载体的构建
3
作者 张云帆 王家孟 +3 位作者 詹紫璐 陈泳伶 杨汇瀛 唐东阶 《基因组学与应用生物学》 CAS CSCD 北大核心 2024年第1期117-128,共12页
核开关(riboswitch)是存在于信使RNA(messenger RNA,mRNA)分子的5′非翻译区(5′-untranslated region,5′UTR)的一段具有调控功能的RNA片段,它通过与特定的代谢物分子直接结合来调控所在mRNA自身的表达。核开关广泛存在于细菌中,在调... 核开关(riboswitch)是存在于信使RNA(messenger RNA,mRNA)分子的5′非翻译区(5′-untranslated region,5′UTR)的一段具有调控功能的RNA片段,它通过与特定的代谢物分子直接结合来调控所在mRNA自身的表达。核开关广泛存在于细菌中,在调控细菌的基础代谢以及致病等生理过程中发挥非常重要的作用。尽管目前在大肠杆菌(Escherichia coli)等模式细菌中已经鉴定了许多核开关,然而,至今在重要的植物病原细菌黄单胞菌属(Xanthomonas)细菌中只鉴定了1个核开关。为了实现在全基因组水平上对黄单胞菌的核开关进行高通量筛选鉴定,本研究设计和构建了1个β-葡萄糖苷酸酶(β-glucuronidase,GUS)报告载体pL3-SD^(+)gusA。该载体既适用于在黄单胞菌属细菌中对候选的核开关进行验证,也可以通过构建基因组DNA表达文库而实现对黄单胞菌核开关的高通量筛选鉴定。 展开更多
关键词 黄单胞菌 GUS报告载体 核开关 高通量筛选鉴定
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ISG15蛋白泛素结合酶UBCH6的原核表达及多克隆抗体制备 被引量：4
4
作者 李玉霄 唐榕泽 +5 位作者 高跃美 冯佳佳 李晓泉 梁晶晶 李晓宁 罗廷荣 《动物医学进展》 北大核心 2020年第12期28-33,共6页
通过抽提接毒猪瘟病毒(CSFV)的PK-15细胞RNA,以RT-PCR方法克隆UBCH6基因,并与pMD18-T载体连接,再通过双酶切法将UBCH6基因与原核表达载体pGEX-4T-1、真核表达载体pcDNA3.0连接。重组原核表达载体pGEX-UBCH6用感受态细胞BL21转化,并在低... 通过抽提接毒猪瘟病毒(CSFV)的PK-15细胞RNA,以RT-PCR方法克隆UBCH6基因,并与pMD18-T载体连接,再通过双酶切法将UBCH6基因与原核表达载体pGEX-4T-1、真核表达载体pcDNA3.0连接。重组原核表达载体pGEX-UBCH6用感受态细胞BL21转化,并在低温条件下,用低浓度的IPTG诱导表达UBCH6重组蛋白,经SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色结果显示,在30℃、用0.05 mmol/L IPTG诱导时UBCH6表达效果最好,而且UBCH6重组蛋白主要以可溶性的形式在菌液中表达。UBCH6重组蛋白经过Ni-NTA纯化后与弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂等体积混合乳化并免疫4周龄昆明小鼠,从而制备出UBCH6多克隆抗体,重组真核表达载体pcDNA3.0-UBCH6以化学转染人工脂质体法导入293T细胞中,Western blot检测制备的UBCH6多克隆抗体能与真核表达细胞蛋白发生反应,反应效价可达1∶10000,反应性良好。Western blot检测UBCH6多克隆抗体的特异性,ISG15多克隆抗体、UBCH6多克隆抗体都能与接毒CSFV、转染PolyI:C的PK-15细胞蛋白发生良好反应,且蛋白表达量与时间呈正相关。 展开更多
关键词 ISG15蛋白 UBCH6基因 多克隆抗体 猪瘟病毒 蛋白诱导表达
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猪TNF-α高效表达及其多克隆抗体的制备 被引量：4
5
作者 黄茂发 梁晶晶 +5 位作者 赵祥秀 唐榕泽 高跃美 张文 罗廷荣 李晓宁 《南方农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第9期2572-2581,共10页
【目的】明确猪源肿瘤坏死因子α(TNF-α)多克隆抗体的特异性和反应性,并探索猪瘟病毒(CSFV)感染对PK-15细胞分泌TNF-α的影响,为揭示CSFV的致病机理打下基础。【方法】提取CSFV病料基因组RNA,通过RT-PCR扩增TNF-α基因,构建原核表达载... 【目的】明确猪源肿瘤坏死因子α(TNF-α)多克隆抗体的特异性和反应性,并探索猪瘟病毒(CSFV)感染对PK-15细胞分泌TNF-α的影响,为揭示CSFV的致病机理打下基础。【方法】提取CSFV病料基因组RNA,通过RT-PCR扩增TNF-α基因,构建原核表达载体pGEX-4T-1-TNF-α并转化BL21感受态细胞诱导表达融合蛋白,经纯化和浓缩后免疫SPF级昆明小鼠制备TNF-α多克隆抗体;同时构建真核表达载体pcDNA3.0-TNF-α,分别转染HEK-293T细胞和PK-15细胞表达融合蛋白,通过Western blotting、ELISA和间接免疫荧光分析等方法检测TNF-α多克隆抗体效价、反应性及特异性。【结果】以原核表达载体pGEX-4T-1-TNF-α转化BL21感受态细胞,经IPTG诱导后能表达出约43 kD的融合蛋白,且主要以包涵体形式进行表达。以真核表达载体pcDNA3.0-TNF-α转染HEK-293T细胞可表达出25 kD的融合蛋白,主要在细胞质中表达,且均匀分布。制备获得的TNF-α多克隆抗体能与转染HEK-293T细胞表达的融合蛋白TNF-α及PK-15细胞的内源蛋白TNF-α发生良好反应,即具有较好的反应特异性,其抗体效价高达1∶8000。CSFV能刺激PK-15细胞分泌蛋白TNF-α上调表达,且TNF-α与其下游因子(TRAF1)的表达变化趋势基本一致,即二者间存在一定关联性。【结论】制备获得的TNF-α蛋白抗体具有效价高、反应性好及特异性强的特点,可用于检测CSFV感染后真核细胞中过表达的TNF-α水平。TNF-α可刺激TRAF1产生,参与TRAF1相关信号通路而发挥其生物学功能,CSFV感染PK-15细胞后TNF-α和TRAF1的表达变化趋势基本一致,说明CSFV能刺激TNF-α和TRAF1信号通路,使机体产生炎症反应。 展开更多
关键词 猪 肿瘤坏死因子α(TNF-α) 多克隆抗体 猪瘟病毒(CSFV)
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大肠杆菌转录后调控蛋白CsrA的C末端具有抑制十字花科黑腐病菌胞外蛋白酶活性的功能 被引量：3
6
作者 黄明慧 陈承晓 +3 位作者 覃振萍 唐纪良 唐东阶 晁耐霞 《基因组学与应用生物学》 CAS CSCD 北大核心 2012年第4期341-348,共8页
CsrA(在有些细菌例如十字花科黒腐病菌中也称为RsmA,统称CsrA/RsmA)是一类在细菌中广泛分布而且氨基酸序列非常保守的RNA结合蛋白。研究表明,CsrA/RsmA作为转录后全局调控因子参与了包括细胞碳代谢、次生代谢、运动性、生物被膜形成以... CsrA(在有些细菌例如十字花科黒腐病菌中也称为RsmA,统称CsrA/RsmA)是一类在细菌中广泛分布而且氨基酸序列非常保守的RNA结合蛋白。研究表明,CsrA/RsmA作为转录后全局调控因子参与了包括细胞碳代谢、次生代谢、运动性、生物被膜形成以及动植物病原菌的致病过程等许多细胞过程的调控。CsrA/RsmA在不同的细菌中的生物学功能各有异同。在大肠杆菌中,CsrA的主要功能是控制细胞的碳代谢、运动性和生物被膜形成;而在十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pathovar campestris,Xcc)中,CsrA的同源蛋白RsmA的主要功能除了控制碳代谢、运动性和生物被膜形成外,还控制致病性和胞外酶的产生。大肠杆菌的CsrA(CsrAE.coli)是否具有XccRsmA(RsmAXcc)的功能?为了回答这个问题,我们用大肠杆菌的csrA基因(csrAE.coli)互补Xcc的rsmA基因(rsmAXcc)的缺失突变体DM2506。结果显示,csrAE.coli能够互补DM2506的所有表型,说明CsrAE.coli具有RsmAXcc的全部功能。更重要的是,我们发现,无论是rsmAXcc突变体还是野生型菌株,导入表达CsrAE.coli的质粒后均导致其致胞外蛋白酶活性的严重下降,证明CsrAE.coli具有抑制Xcc胞外蛋白酶活性的作用。进一步的实验证实,CsrAE.coli的C末端第53～61位氨基酸残基具有抑制Xcc胞外蛋白酶活性的功能。 展开更多
关键词 十字花科黑腐病菌Xcc 大肠杆菌 转录后调控蛋白CsrA 胞外蛋白酶
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甘蔗乙烯信号转导途径关键基因CTR1的克隆与表达分析 被引量：2
7
作者 王凡伟 肖冬 +2 位作者 李杨瑞 何龙飞 王爱勤 《分子植物育种》 CAS CSCD 北大核心 2020年第3期827-833,共7页
为了研究CTR1基因与甘蔗糖分积累的关系,本研究利用同源克隆的方法,以甘蔗品种‘桂糖28’(GT28)幼嫩叶片的cDNA为模板,成功克隆得到2103 bp的甘蔗CTR1基因(ScCTR1;GenBank登录号为MK158246)。ScCTR1基因的开放阅读框(ORF)序列长1656 bp... 为了研究CTR1基因与甘蔗糖分积累的关系,本研究利用同源克隆的方法,以甘蔗品种‘桂糖28’(GT28)幼嫩叶片的cDNA为模板,成功克隆得到2103 bp的甘蔗CTR1基因(ScCTR1;GenBank登录号为MK158246)。ScCTR1基因的开放阅读框(ORF)序列长1656 bp,编码551个氨基酸,预测蛋白质的分子质量为62.78 kD。ScCTR1蛋白具有CTR1同源蛋白典型的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域。实时荧光定量PCR结果表明,ScCTR1基因在茎和叶中都有表达,在茎中其表达量呈先增加后降低的趋势,在未成熟叶、成熟叶和老叶中,其基因表达呈降低的趋势。本研究结果对阐明乙烯调控甘蔗茎糖分积累和叶发育的机理提供了重要的参考依据。 展开更多
关键词 甘蔗(Saccharum ssp.Hybrids) CTR1 基因克隆 基因表达
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3种接种方法对十字花科黑腐病菌Xcc8004菌株在拟南芥Col-0上致病力的影响 被引量：1
8
作者 梅雄 李振江 +2 位作者 张慧 唐纪良 唐东阶 《基因组学与应用生物学》 CAS CSCD 北大核心 2011年第4期365-370,共6页
十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pathovar campestris,Xcc)是引起十字花科植物黑腐病的病原菌,也是研究寄主与病原微生物相互作用分子机理的模式菌之一。Xcc可以感染白菜、萝卜和甘蓝等十字花科农作物,也可以感染重要的模式... 十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pathovar campestris,Xcc)是引起十字花科植物黑腐病的病原菌,也是研究寄主与病原微生物相互作用分子机理的模式菌之一。Xcc可以感染白菜、萝卜和甘蓝等十字花科农作物,也可以感染重要的模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)。由于拟南芥的全基因组测序已经完成,因此,拟南芥是研究寄主植物对Xcc浸染的防卫反应的分子机理的最理想的寄主材料。但是,到现在为止,一套完善的在拟南芥上进行Xcc致病检测的实验系统还没有建立。为此,本研究比较了"叶片压渗法"、"剪叶法"和"叶片中脉穿刺法"这3种常用的病原细菌接种方法对Xcc的实验室菌株8004(以下简称Xcc8004)在哥伦比亚生态型拟南芥(A.thanliana ecoype Colombia0,Col-0)上的致病力的影响。结果发现,在拟南芥Col-0叶片上用"叶片压渗法"接种Xcc8004可以引起明显致病症状,而用"剪叶法"和"叶片中脉穿刺法"接种均不能引起病症。这一结果说明,不同的接种方法的对Xcc在拟南芥上的致病力有很大的影响。因此,要在拟南芥Col-0上进行Xcc8004的致病力检测,本研究建议采用"叶片压渗法"而不用"剪叶法"和"叶片中脉穿刺法"。此外,本研究还建立了一套简易的拟南芥试验用苗的栽培方法。 展开更多
关键词 十字花科黑腐病菌Xcc 拟南芥 致病检测 叶片压渗法 剪叶法 叶片中脉穿刺法
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猪STAT-1α基因的原核表达及其多克隆抗体制备 被引量：1
9
作者 李延生 刘诚 +8 位作者 张珂 李晓宁 李晓泉 尹珊 谢琳娟 何晓霞 罗扬 钟桃珍 罗廷荣 《南方农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第1期118-122,共5页
【目的】通过制备STAT-1α多克隆抗体,为进一步研究STAT-1α蛋白的功能特性及探索STAT-1α与猪瘟病毒间的相互作用机制奠定基础。【方法】利用RT-PCR从猪肾PK-15细胞中克隆出STAT-1α基因保守片段,与pET-32a(+)构建原核表达重组质粒,转... 【目的】通过制备STAT-1α多克隆抗体,为进一步研究STAT-1α蛋白的功能特性及探索STAT-1α与猪瘟病毒间的相互作用机制奠定基础。【方法】利用RT-PCR从猪肾PK-15细胞中克隆出STAT-1α基因保守片段,与pET-32a(+)构建原核表达重组质粒,转化原核宿主菌(Rosetta),进行IPTG诱导表达,表达的重组蛋白经纯化和复性浓缩后,免疫小鼠制备STAT-1α多克隆抗体。【结果】STAT-1α基因能与原核表达载体pET-32a(+)构建原核表达重组质粒pET-STAT-1α,转化大肠杆菌Rosetta后的最佳体外诱导条件是IPTG 0.5 mmol/L、诱导时间6 h,其重组蛋白主要以包涵体的形式表达。STAT-1α多克隆抗体具有高效特异性,与真核细胞PK-15细胞作用后,在PK-15细胞内能检测到STAT-1α蛋白表达,可观察到大部分细胞胞浆内有绿色荧光,但胞核内几乎无荧光,即STAT-1α主要定位在正常PK-15细胞的细胞浆内表达。【结论】制备获得的猪STAT-1α多克隆抗体特异性好,既能与原核细胞大肠杆菌(Rosetta)表达的STAT-1α反应,又能与真核细胞PK-15的STAT-1α发生反应。 展开更多
关键词 猪 STAT-1α基因 原核表达 多克隆抗体
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大肠杆菌全局调控蛋白CsrA中抑制十字花科黑腐病菌胞外蛋白酶活性所必需的氨基酸残基的鉴定
10
作者 唐东阶 钟婉莹 +2 位作者 秦春铃 唐纪良 晁耐霞 《基因组学与应用生物学》 CAS CSCD 北大核心 2013年第4期440-448,共9页
CsrA／RsmA蛋白家族是细菌中一类重要的转录后全局调控因子，它们调控细菌的碳代谢、次生代谢、运动、生物被膜形成以及致病等过程。CsrA／RsmA蛋白家族通常由60～72个氨基酸基组成，其中第1至第52位氨基酸高度保守，而第53位以后的氨... CsrA／RsmA蛋白家族是细菌中一类重要的转录后全局调控因子，它们调控细菌的碳代谢、次生代谢、运动、生物被膜形成以及致病等过程。CsrA／RsmA蛋白家族通常由60～72个氨基酸基组成，其中第1至第52位氨基酸高度保守，而第53位以后的氨基酸则高度可变。目前人们认为其氨基酸高度保守性是不同种属细菌CsrA／RsmA功能和作用机理相似的基础，但是其高度可变区与不同种属CsrA／RsmA蛋白功能差异的关系尚不清楚。我们之前的研究显示，大肠杆菌（Escherichiacoli）的CsrA（CsrAE删）蛋白的高度可变区（第53至第61位氨基酸残基）具有强烈的抑制十字花科黑腐病菌（XanthomonztscampeStr／spathovarcampestris，简称‰c）胞外蛋白酶活性的能力。本研究中，我们采用丙氨酸置换方法，确定了CsrA。蒯可变区中抑制xcc胞外蛋白酶活性必需的氨基酸残基。结果显示，CsrAE枷蛋白的第54位赖氨酸（K54）、第60位丝氨酸（S60）和第61位酪氨酸（Y61）置换成丙氨酸后，csrA‰。蛋白丧失了抑制Xcc胞外蛋白酶活性的能力；而其它位点的丙氨酸置换不影响其抑制Xcc胞外蛋白酶活性的能力。这个结果证明K54、S60和Y61是CsrAE.coli抑制Xcc胞外蛋白酶活性所必需的，为揭示大肠杆菌的CsrA。融蛋白抑制Xcc胞外蛋白酶活性的分子机理奠定基础。 展开更多
关键词 十字花科黒腐病菌 胞外蛋白酶 大肠杆菌 CsrA 丙氨酸置换
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十字花科黑腐病菌锌吸收调控蛋白中四个半胱氨酸残基的功能分析
11
作者 唐东阶 张雨 +2 位作者 王谜 唐纪良 臧宁 《基因组学与应用生物学》 CAS CSCD 北大核心 2013年第3期359-366,共8页
细菌锌吸收调控蛋白(Zur)在调控细胞锌离子平衡中起核心作用。研究发现,大肠杆菌的Zur蛋白(ZurE.coli)中半胱氨酸残基Cys93、Cys96、Cys143和Cys146是锌离子结合位点,是感受锌离子浓度和调控锌离子平衡必需的氨基酸残基。本文研究了十... 细菌锌吸收调控蛋白(Zur)在调控细胞锌离子平衡中起核心作用。研究发现,大肠杆菌的Zur蛋白(ZurE.coli)中半胱氨酸残基Cys93、Cys96、Cys143和Cys146是锌离子结合位点,是感受锌离子浓度和调控锌离子平衡必需的氨基酸残基。本文研究了十字花科黒腐病菌(Xanthomonas campestris pathovar campestris,简称Xcc)的Zur蛋白(ZurXcc)。序列分析结果显示,ZurXcc的Cys125、Cys128、Cys165和Cys168是与ZurE.coli的Cys93、Cys96、Cys143和Cys146相对应的半胱氨酸残基,预示它们可能是ZurXcc中的锌离子结合位点。此外,氨基酸置换结果发现,Cys125、Cys128、Cys165和Cys168中任何一个被其它氨基酸置换后,ZurXcc即丧失调控锌离子平衡的能力,证明它们是ZurXcc调控锌离子平衡必不可少的,是可能的锌离子结合位点。胞外多糖(EPS)产量和致病力检测结果还表明,ZurXcc调控锌离子平衡、EPS产生和调控致病在结构和功能上都是可以分开的。 展开更多
关键词 黄单胞菌 锌吸收调控蛋白 氨基酸置换 锌离子结合位点 锌离子平衡
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狂犬病病毒P和M基因重组突变体的生物学特性分析
12
作者 张银 金硕 +7 位作者 栗朵朵 Abraha Bahlbi Kiflu 韩菲 武梦思 凌小清 梁晶晶 李晓宁 罗廷荣 《南方农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第9期2634-2642,共9页
【目的】探索狂犬病病毒(RABV)强毒株P基因替换及P-M基因联合替换至弱毒株获得的重组突变体在宿主细胞内的传播能力、复制与转录能力及致病性,为掌握RABV强毒株P蛋白和M蛋白的生物学特性打下基础。【方法】以RABV广西街毒株GX01为研究对... 【目的】探索狂犬病病毒(RABV)强毒株P基因替换及P-M基因联合替换至弱毒株获得的重组突变体在宿主细胞内的传播能力、复制与转录能力及致病性,为掌握RABV强毒株P蛋白和M蛋白的生物学特性打下基础。【方法】以RABV广西街毒株GX01为研究对象,利用反向遗传技术将其P基因分别替换到弱毒株rRC-HL和r RC-HL(GX01M)株的对应位置,通过间接免疫荧光试验(IFA)及基因测序鉴定拯救的病毒,并测定重组突变体的多步生长曲线、荧光灶面积及N基因表达水平等,同时通过4周龄昆明小鼠攻毒试验验证P基因及P-M基因联合替换后对RABV致病性的影响。【结果】利用反向遗传技术能成功拯救重组突变体rRC-HL(GX01P)和rRC-HL(GX01P-M),通过IFA测定病毒荧光灶面积及多步生长曲线发现,r RC-HL(GX01P-M)株在BSR/T7-9细胞上的生长能力及传播能力均较rRC-HL(GX01P)株和rRC-HL(GX01M)株强。在复制与转录水平上,rRC-HL(GX01P)株的N基因相对表达量高于r RC-HL(GX01M)株,但低于rRC-HL(GX01P-M)株。在昆明小鼠攻毒试验中,重组突变体rRC-HL(GX01P)和rRC-HL(GX01P-M)攻毒后第4 d昆明小鼠开始出现精神不振、行动迟缓等症状,其致病性无明显差异;昆明小鼠体质量均呈一过性减轻,之后恢复正常并呈上升趋势;攻毒15 d内均未见昆明小鼠死亡,即重组突变体rRC-HL(GX01P)和rRCHL(GX01P-M)的致病性较弱。【结论】强毒株GX01的P基因与M基因联合替换可提高病毒传播能力,且二者具有协同性,但对弱毒株rRC-HL的毒力无影响。 展开更多
关键词 狂犬病病毒(RABV) P蛋白 M蛋白 联合替换 生物学特性
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十字花科黑腐病菌中一个与HR反应相关的小RNA的鉴定
13
作者 李良贤 肖波 +1 位作者 黄晓韵 唐东阶 《基因组学与应用生物学》 CAS CSCD 北大核心 2015年第7期1443-1450,共8页
十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv.campertris,简称Xcc)可以引起寄主植物萝卜、白菜、芥菜等十字花科植物的黑腐病,也可以引起非寄主植物辣椒的高敏反应(hypersensitive response,HR)。最近的研究发现,在一些动植物病原细菌... 十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv.campertris,简称Xcc)可以引起寄主植物萝卜、白菜、芥菜等十字花科植物的黑腐病,也可以引起非寄主植物辣椒的高敏反应(hypersensitive response,HR)。最近的研究发现,在一些动植物病原细菌中,除蛋白外,小RNA也在致病和HR反应中起关键的作用。但是,到目前为止,小RNA是否在Xcc的致病和HR反应中起重要作用尚不清楚。在前期工作中,我们采用RNA深度测序(RNA-Seq)方法,在Xcc中鉴定了五百多个候选小RNA,但它们的功能还不清楚。在本研究中,我们对小RNA s RXcc52的生物学功能进行了研究,结果发现,小RNA s RXcc52的过量表达株(OE52)在辣椒上引起HR反应的时间比带有一个空的过量表达载体质粒的野生型菌株(WT/p BBad)的时间提前了2 h。这个结果表明,s RXcc52与Xcc的HR反应有关。我们的结果为深入研究小RNA在Xcc的HR反应中的作用打下了基础。 展开更多
关键词 十字花科黑腐病菌 小RNA 过量表达 HR反应
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十字花科黑腐病菌中存在tRNA衍生片段(tRF)的证据
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作者 刘金阳 黄小英 +1 位作者 陈妍妙 唐东阶 《基因组学与应用生物学》 CAS CSCD 北大核心 2021年第1期264-269,共6页
tRNA衍生片段(tRNA-derived fragment, tRF)是一种由内切核糖核酸酶将初级tRNA (primary tRNA)或成熟tRNA分子剪切后形成的长度为14~30 nt (核苷酸)的稳定的RNA片段。研究表明,tRF广泛存在于各种真核生物中,它们既可以作为信号分子,又... tRNA衍生片段(tRNA-derived fragment, tRF)是一种由内切核糖核酸酶将初级tRNA (primary tRNA)或成熟tRNA分子剪切后形成的长度为14~30 nt (核苷酸)的稳定的RNA片段。研究表明,tRF广泛存在于各种真核生物中,它们既可以作为信号分子,又可以作为基因表达的调控因子,在细胞的各种生理过程中发挥重要的调控作用。但至今除了在大肠杆菌(Escherichia coli)和沃氏富盐菌(Haloferax volcanii)中发现了tRF外,在其他原核生物中未见有关tRF的报道。本研究采用高灵敏度的Northern杂交技术对十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv. campestris, Xcc)的苏氨酸-tRNA (threonine-tRNA, tRNAThr)和甲硫氨-tRNA (methionine-tRNA, tRNAMet)进行了检测。结果显示,除了检测到全长的成熟tRNAThr和tRNAMet外,还检测到多个丰度各异的稳定的tRF,而且一些tRF的产生受营养胁迫的诱导。此外,我们还发现,编码tRNAMet的基因XC4381已经退化为非编码RNA基因。本研究证明了tRF在Xcc中的存在,为深入研究tRF的功能,特别是在Xcc致病中的作用奠定了基础。 展开更多
关键词 十字花科黑腐病菌 tRNA衍生片段 高灵敏度Northern杂交 tRNA基因退化
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低温胁迫对不同抗寒性甘蔗品种幼苗叶绿体生理代谢的影响 被引量：58
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作者 孙富 杨丽涛 +2 位作者 谢晓娜 刘光玲 李杨瑞 《作物学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第4期732-739,共8页
土培桶栽抗寒品种GT28与不抗寒品种ROC22,测定正常(28℃)和低温(4℃)条件下甘蔗幼苗叶片的质膜透性、叶绿素荧光参数等相关生理指标。结果表明,低温与正常条件下相比,两品种幼苗叶片的膜透性显著增大,且ROC22增幅较大;初始荧光(Fo)、非... 土培桶栽抗寒品种GT28与不抗寒品种ROC22,测定正常(28℃)和低温(4℃)条件下甘蔗幼苗叶片的质膜透性、叶绿素荧光参数等相关生理指标。结果表明,低温与正常条件下相比,两品种幼苗叶片的膜透性显著增大,且ROC22增幅较大;初始荧光(Fo)、非光化学猝灭系数(NPQ)显著上升,最大光能转化效率(Fv/Fm)、反应中心激发能捕获效率(Fv'/Fm')、光化学猝灭系数(qP)、PSII实际量子效率(ΦPSII)均下降,以ROC22降幅较大;叶绿体希尔反应活力、Mg2+-ATPase、Ca2+-ATPase活性下降,叶绿体中丙二醛(MDA)含量增加,以ROC22变幅较大;超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、谷胱甘肽还原酶(GR)活性均上升,GT28的增幅比ROC22显著。上述参数与品种抗寒性密切相关,GT28比ROC22抗寒性更强。 展开更多
关键词 甘蔗 低温胁迫 叶绿体 叶绿素荧光 ATP酶 活性氧
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低温胁迫下外源ABA对甘蔗幼苗抗寒性及内源激素的影响 被引量：56
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作者 黄杏 陈明辉 +2 位作者 杨丽涛 张保青 李杨瑞 《华中农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第4期6-11,共6页
为探讨外施ABA(脱落酸)对甘蔗抗寒性的影响,以抗寒性强的甘蔗品种桂糖28号和抗寒性弱的甘蔗品种园林6号为材料,喷施100μmol/L ABA于甘蔗幼苗叶片,12 h后进行低温胁迫,然后于不同时间采叶样,研究甘蔗幼苗在低温胁迫和ABA处理下叶片细胞... 为探讨外施ABA(脱落酸)对甘蔗抗寒性的影响,以抗寒性强的甘蔗品种桂糖28号和抗寒性弱的甘蔗品种园林6号为材料,喷施100μmol/L ABA于甘蔗幼苗叶片,12 h后进行低温胁迫,然后于不同时间采叶样,研究甘蔗幼苗在低温胁迫和ABA处理下叶片细胞膜透性、丙二醛(MDA)、脯氨酸及内源激素含量的变化。结果表明:低温胁迫下,甘蔗幼苗细胞膜受破坏,GA3(赤霉素)含量下降;丙二醛、脯氨酸、ABA含量及相对电导率、ABA/GA3、ABA/IAA和ABA/ZR升高。外施ABA能有效缓解低温胁迫对细胞膜的影响,降低MDA、GA3含量,提高脯氨酸、ABA含量及ABA/GA3,从而提高甘蔗幼苗的抗寒性。低温胁迫下,植株体内低MDA、GA3含量,高脯氨酸、ABA含量及高ABA/GA3值是甘蔗高抗寒性的重要生理基础。 展开更多
关键词 ABA 低温胁迫 甘蔗 细胞膜 内源激素 丙二醛 脯氨酸
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利用SSR与RAPD分子标记评估甘蔗品种的遗传多样性 被引量：48
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作者 胡杨 李赟 +1 位作者 黄有总 刘平武 《基因组学与应用生物学》 CAS CSCD 北大核心 2016年第9期2494-2503,共10页
利用SSR与RAPD两种分子标记对美国、中国台湾以及中国大陆不同甘蔗育种单位选育的甘蔗品种或亲本材料的遗传多样性进行评估。其中19对SSR引物共扩增出87条带,多态性带为84条,多态性比例为96.55%,扩增出的条带数范围为2~8条,平均每对引... 利用SSR与RAPD两种分子标记对美国、中国台湾以及中国大陆不同甘蔗育种单位选育的甘蔗品种或亲本材料的遗传多样性进行评估。其中19对SSR引物共扩增出87条带,多态性带为84条,多态性比例为96.55%,扩增出的条带数范围为2~8条,平均每对引物扩增出4.58条带,引物的PIC值范围为0.34~0.93,平均0.64。21条RAPD引物共扩增出184条带,扩增条带数范围为3~16,平均每条引物扩增8.76条带,其中多态性带为184,多态性比例为100%,引物PIC范围为0.53~0.97,平均0.86。结果表明,两种分子标记都能较好的评估甘蔗品种的遗传多样性。 展开更多
关键词 甘蔗 SSR RAPD 遗传多样性 聚类分析
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甘蔗苯丙氨酸解氨酶基因(PAL)的克隆和表达分析 被引量：32
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作者 宋修鹏 黄杏 +4 位作者 莫凤连 田丹丹 杨丽涛 李杨瑞 陈保善 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2013年第14期2856-2868,共13页
【目的】克隆甘蔗的苯丙氨酸解氨酶基因(PAL),分析其序列特征及其在不同组织和5种胁迫条件下的表达情况,为此基因在甘蔗抗逆育种中的应用提供理论支撑。【方法】利用串联飞行时间质谱仪对差异表达蛋白质进行质谱鉴定分析,通过RT-PCR和R... 【目的】克隆甘蔗的苯丙氨酸解氨酶基因(PAL),分析其序列特征及其在不同组织和5种胁迫条件下的表达情况,为此基因在甘蔗抗逆育种中的应用提供理论支撑。【方法】利用串联飞行时间质谱仪对差异表达蛋白质进行质谱鉴定分析,通过RT-PCR和RACE技术从甘蔗品种新台糖22号(ROC22)中克隆PAL,以生物信息学方法对其序列进行预测分析,利用real-time PCR分析PAL在不同组织和不同胁迫条件下的表达特性。【结果】克隆获得甘蔗PAL,命名为ScPAL,GenBank登录号为KC172559。该cDNA全长2 590 bp,含有1个2 115 bp的完整开放阅读框(ORF),编码704个氨基酸。序列分析表明,其包含典型的PAL酶活性中心序列(GTITASGDLVPLSYIA),与其它植物的PAL蛋白有很高的相似性。系统进化树分析显示,甘蔗ScPAL与高粱的PAL蛋白亲缘关系较近。real-time PCR分析表明PAL为组成型表达,在根中的表达量最高,是叶中表达量的66倍。其在低温(4℃)、聚乙二醇(PEG)、NaCl和H2O2四种外源胁迫下均诱导表达,但表达模式不同。【结论】从甘蔗品种ROC22中克隆获得苯丙氨酸解氨酶基因(ScPAL),是典型的PAL家族成员,推测其参与了甘蔗抗黑穗病过程,且在甘蔗抗寒、抗旱和抗盐胁迫过程也起到某种作用。 展开更多
关键词 甘蔗 苯丙氨酸解氨酶 基因克隆 表达分析
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干旱胁迫下不同甘蔗品种叶片抗氧化酶活性和渗透调节物质含量的变化 被引量：25
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作者 Do Thanh Trung 李健 +4 位作者 张风娟 邢永秀 杨丽涛 李杨瑞 Nguyen Thi Hanh 《热带作物学报》 CSCD 北大核心 2018年第5期858-866,共9页
我国80%以上的甘蔗种植在旱地,干旱缺水是影响甘蔗生产的主要因子。研究不同甘蔗品种的抗旱生理生化特性对于抗旱甘蔗品种选育和抗旱栽培技术研发具有重要意义。本研究采用桶栽方式,对抗旱性有差异的F172(抗旱性强)和YL6(不抗旱)2个甘... 我国80%以上的甘蔗种植在旱地,干旱缺水是影响甘蔗生产的主要因子。研究不同甘蔗品种的抗旱生理生化特性对于抗旱甘蔗品种选育和抗旱栽培技术研发具有重要意义。本研究采用桶栽方式,对抗旱性有差异的F172(抗旱性强)和YL6(不抗旱)2个甘蔗品种在苗期及伸长期分别进行不同程度的干旱胁迫及复水处理,探讨了不同甘蔗品种抗旱性与叶片抗氧化酶活性和渗透调节物质含量的关系。结果表明:抗旱性较强的甘蔗品种F172在干旱胁迫条件下叶片中氧自由基清除酶系中的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和抗氧化保护酶过氧化氢酶(CAT)活性及非可溶性蛋白(ISP)、可溶性糖(SS)含量显著提高;与不抗旱甘蔗品种YL6相比,甘蔗品种F172叶片中丙二醛(MDA)、非可溶性糖(ISS)含量相对比较稳定;而不抗旱甘蔗品种YL6在干旱胁迫条件下叶片中氧自由基清除酶反应较迟钝,MDA和ISS含量上升幅度相对较大,而可溶性蛋白(SP)、ISP含量下降。说明甘蔗叶片抗氧化酶活性和渗透调节物质含量的差异是品种耐干旱胁迫存在差异的生理基础。 展开更多
关键词 甘蔗 干旱胁迫 氧化酶 渗透调节物质
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甘蔗幼苗根系形态结构及保护系统对低温胁迫的响应 被引量：23
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作者 孙波 刘光玲 +1 位作者 杨丽涛 李杨瑞 《中国农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第6期71-80,共10页
为探明低温对甘蔗根系的影响,本研究采取水培试验的方法,选用不抗寒品种ROC22和抗寒品种GT28的完整根系为供试材料,测定常温(25℃)与低温(4℃)条件下甘蔗幼苗根系的根长、根体积、根细胞排列、根系活力、丙二醛(MDA)、脯氨酸、可溶性糖... 为探明低温对甘蔗根系的影响,本研究采取水培试验的方法,选用不抗寒品种ROC22和抗寒品种GT28的完整根系为供试材料,测定常温(25℃)与低温(4℃)条件下甘蔗幼苗根系的根长、根体积、根细胞排列、根系活力、丙二醛(MDA)、脯氨酸、可溶性糖与可溶性蛋白质含量以及过氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)活性相关指标。结果表明:在低温胁迫下,GT28根长、根体积均大于ROC22,但都显著低于常温生长;低温胁迫3d后,根系细胞膨大变形,细胞结构散乱,以ROC22更为明显;随着低温时间的延长,2个品种根系活力均显著降低,而ROC22的降幅更大;在低温持续胁迫下,根系MDA、脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白含量以及POD和SOD活性等指标均高于常温生长,呈先上升后降低趋势,抗寒品种GT28的可溶性糖含量、脯氨酸含量、POD和SOD酶活性均高于不抗寒品种ROC22。结论:在低温胁迫下根系生长和生理生化代谢的差异是不同品种抗寒能力的生理基础。 展开更多
关键词 甘蔗 根 低温胁迫
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