大规模蛋白质相互作用研究方法进展 被引量：13

1

作者 关薇 王建 贺福初 《生命科学》 CSCD 2006年第5期507-512,共6页

随着2000年酵母大规模蛋白质相互作用网络图谱的成功描绘,蛋白质相互作用特别是大规模蛋白质相互作用研究成为生命科学领域的又一个研究热点。酵母、果蝇、线虫以及人类蛋白的大规模相互作用图谱的相继完成,不仅对系统研究细胞内各种生... 随着2000年酵母大规模蛋白质相互作用网络图谱的成功描绘,蛋白质相互作用特别是大规模蛋白质相互作用研究成为生命科学领域的又一个研究热点。酵母、果蝇、线虫以及人类蛋白的大规模相互作用图谱的相继完成,不仅对系统研究细胞内各种生命活动有着重要意义,也标志着蛋白质相互作用研究方法的不断发展和完善。本文综述了当前大规模研究蛋白质相互作用的技术方法并进行了比较分析。每种技术都有其各自的优缺点,在实验中要根据不同的要求和目的选择适宜的方法。 展开更多

关键词 蛋白质相互作用 酵母双杂交 串联亲和纯化

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蛋白质相互作用研究的常用方法进展及比较 被引量：7

2

作者 涂占晗 林旭 《中国当代医药》 2012年第14期18-20,共3页

如今蛋白质间的相互作用已成为生命科学领域研究的重点,而各种蛋白质间相互作用的研究方法的飞速发展成为蛋白质研究的重点。本综述中将着眼于酵母双杂交方法新进发展与Sos系统、噬菌体展示、GST-pull down、免疫共沉淀、串联亲和纯化... 如今蛋白质间的相互作用已成为生命科学领域研究的重点,而各种蛋白质间相互作用的研究方法的飞速发展成为蛋白质研究的重点。本综述中将着眼于酵母双杂交方法新进发展与Sos系统、噬菌体展示、GST-pull down、免疫共沉淀、串联亲和纯化等蛋白质相互作用研究方法做一比较分析。以便在未来的研究中,根据不同方法的优缺点选择合适的研究技术。 展开更多

关键词 酵母双杂交 Sos系统 噬菌体展示 GST pull-down 免疫共沉淀 串联亲和纯化

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蛋白质相互作用实验技术的最新进展 被引量：7

3

作者 王明强 武金霞 +3 位作者 张玉红 韩凝 边红武 朱睦元 《遗传》 CAS CSCD 北大核心 2013年第11期1274-1282,共9页

蛋白质相互作用的研究,是揭示生物体正常生长发育及其应对各种生物或(和)非生物胁迫的分子机制及其调控网络的重要途径。文章综述了近年来发展起来的研究蛋白质相互作用的常用实验性方法,如酵母双杂交系统、串联亲和纯化、免疫共沉淀、G... 蛋白质相互作用的研究,是揭示生物体正常生长发育及其应对各种生物或(和)非生物胁迫的分子机制及其调控网络的重要途径。文章综述了近年来发展起来的研究蛋白质相互作用的常用实验性方法,如酵母双杂交系统、串联亲和纯化、免疫共沉淀、GST Pull-down、双分子荧光互补、荧光共振能量转移、表面等离子共振分析,介绍了其原理、发展进程,并分析了其优缺点。 展开更多

关键词 蛋白质相互作用 酵母双杂交系统 串联亲和纯化 免疫共沉淀 GST Pull—down 双分子荧光互补 荧光共振能量转移 表面等离子共振分析

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串联亲和纯化技术筛选肠病毒71型3D聚合酶的相互作用蛋白 被引量：5

4

作者 江月 丛浩龙 +1 位作者 王健 李梨 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第6期526-529,共4页

目的利用串联亲和纯化技术筛选与肠病毒71型3D聚合酶相互作用的宿主细胞蛋白。方法利用RT-PCR方法从EV71BrCr株全基因组中获得3D聚合酶全长基因,构建pcDNA3.0-3D-Flag-HA真核表达载体并转染RD细胞,48 h后收集细胞。用Western blot方法检... 目的利用串联亲和纯化技术筛选与肠病毒71型3D聚合酶相互作用的宿主细胞蛋白。方法利用RT-PCR方法从EV71BrCr株全基因组中获得3D聚合酶全长基因,构建pcDNA3.0-3D-Flag-HA真核表达载体并转染RD细胞,48 h后收集细胞。用Western blot方法检测3D蛋白在RD细胞内的表达情况。串联亲和纯化技术筛选与3D聚合酶相互作用的宿主蛋白并进行质谱分析,确定与3D聚合酶相互作用的蛋白或多肽。并采用免疫共沉淀实验,对候选蛋白CyclinG1与3D的相互作用进行验证。结果成功构建了pcDNA3.0-3D-Flag-HA载体,在RD细胞内检测到3D蛋白的表达。经串联亲和纯化和质谱分析得到LATS2、Nek2、APC5、CyclinG1、PI3K等一系列参与细胞凋亡及细胞周期调控的蛋白。免疫共沉淀实验证实3D蛋白与CyclinG1的相互作用。结论 3D聚合酶可能与宿主细胞内蛋白相互作用,引起细胞凋亡及细胞周期改变。 展开更多

关键词 肠道病毒71型 3D聚合酶 串联亲和纯化 液相色谱-质谱分析法

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串联亲和纯化技术及其应用 被引量：3

5

作者 洪奇华 陈安国 《细胞生物学杂志》 CSCD 2006年第5期694-698,共5页

串联亲和纯化(tandemaffinitypurification,TAP)是一种能快速研究体内蛋白质相互作用的新技术,经过两步特异性亲和纯化,可快速得到生理条件下与靶蛋白质存在真实相互作用的蛋白质。TAP方法最初用于酵母中,因其具通用性、高效性、高纯度... 串联亲和纯化(tandemaffinitypurification,TAP)是一种能快速研究体内蛋白质相互作用的新技术,经过两步特异性亲和纯化,可快速得到生理条件下与靶蛋白质存在真实相互作用的蛋白质。TAP方法最初用于酵母中,因其具通用性、高效性、高纯度及假阳性低等特点得到了快速发展,至今已成功运用于许多其他生物。现主要介绍TAP方法的原理、TAP标签及其在不同物种中的应用。 展开更多

关键词 蛋白质相互作用 串联亲和纯化 标签 应用

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携带TAP标签的重组甲型流感病毒的构建与鉴定

6

作者 谭琳 张文钰 +3 位作者 潘明磊 张磊 曹萌萌 邓涛 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第2期601-609,共9页

【目的】将TAP标签构建到WSN病毒基因组上,得到含有TAP标签的重组流感病毒,以便进行后续的病毒追踪。【方法】利用反向遗传学技术,对甲型流感病毒A/WSN/33(H1N1)的PA片段进行改造来插入TAP(tandemaffinitypurification)标签序列。通过... 【目的】将TAP标签构建到WSN病毒基因组上,得到含有TAP标签的重组流感病毒,以便进行后续的病毒追踪。【方法】利用反向遗传学技术,对甲型流感病毒A/WSN/33(H1N1)的PA片段进行改造来插入TAP(tandemaffinitypurification)标签序列。通过病毒拯救得到表达外源标签TAP的重组流感病毒WSNPA-TAP,并对拯救出的重组病毒进行生物学鉴定。【结果】成功拯救出重组流感病毒并命名为WSN PA-TAP。重组病毒基因组测序表明重组病毒的序列正确,利用RNA银染技术观察到重组病毒的全基因组片段。重组流感病毒WSN PA-TAP在MDCK细胞上测定生长曲线,发现该重组病毒的复制能力比野生型WSN弱;Westernblotting检测到PA-TAP融合蛋白的表达,其分子质量为96 kDa。【结论】成功拯救出能够表达外源标签TAP的重组流感病毒WSN PA-TAP,为筛选与甲型流感病毒聚合酶有关的宿主蛋白的研究提供了新思路,同时也为以甲型流感病毒为载体携带外源基因的探索提供了重要依据。 展开更多

关键词 甲型流感病毒 串联亲和纯化 反向遗传学

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重组人肿瘤坏死因子蛋白TNF-α的纯化与功能鉴定 被引量：3

7

作者 孔超 李丹 +1 位作者 袁晓君 李斌 《科技导报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第8期70-74,共5页

串联亲和纯化系统(TAP)是近年来广泛使用的一种可在接近于生理条件下探究蛋白间相互作用的生化纯化方法。目前许多关于TAP的研究报道均使用细胞内转录因子为目标蛋白,探索细胞内与其相互作用的蛋白分子。本文尝试建立一种细胞外配体-受... 串联亲和纯化系统(TAP)是近年来广泛使用的一种可在接近于生理条件下探究蛋白间相互作用的生化纯化方法。目前许多关于TAP的研究报道均使用细胞内转录因子为目标蛋白,探索细胞内与其相互作用的蛋白分子。本文尝试建立一种细胞外配体-受体刺激介导的信号转导初始复合体的纯化体系,为此选择了一种多功能的免疫分子配体蛋白——肿瘤坏死因子蛋白超家族(TNFSF)中的核心成员TNF-α。TNF-α是一个强效促炎因子,可介导炎症反应、细胞凋亡和激活等生理效应,是至今研究最多的TNFSF成员。利用原核表达系统纯化出了一种带有多个标签的重组人源TNF-α蛋白,通过检测其受体下游信号通路鉴定该蛋白与天然TNF-α蛋白的生理活性相似,从而证明该蛋白可以用于胞外TAP系统探究TNFR下游信号通路,为配体-受体刺激介导的信号转导初始复合体的胞外串联亲和纯化系统的建立奠定了基础。 展开更多

关键词 串联亲和纯化 肿瘤坏死因子 蛋白纯化

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重组蛋白质亲和标签的选择与串联亲和纯化的应用进展 被引量：2

8

作者 占艺 张金钟 王丽芬 《现代生物医学进展》 CAS 2009年第9期1757-1760,1738,共5页

重组蛋白质技术作为蛋白质研究的重要手段之一,在生物化学与生物物理学研究领域,扮演着极其重要的角色。亲和纯化作为最为方便与快捷的重组蛋白质纯化手段,日益得到广泛的应用。由于各种亲和标签,纯化介质层出不穷,性质各异。应根据自... 重组蛋白质技术作为蛋白质研究的重要手段之一,在生物化学与生物物理学研究领域,扮演着极其重要的角色。亲和纯化作为最为方便与快捷的重组蛋白质纯化手段,日益得到广泛的应用。由于各种亲和标签,纯化介质层出不穷,性质各异。应根据自身研究对象具体情况选择合适的亲和纯化标签。近年双亲和标签进行串联亲和纯化日益成为蛋白质相互作用研究的重要方法。多种亲和标签的搭配已得到成功应用,部分已进入商业化,并在各种模式生物中得到广泛的应用,本文就重组蛋白质亲和标签的选择与串联亲和纯化作一综述。 展开更多

关键词 重组融合蛋白质 亲和标签 串联亲和纯化

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流感病毒RNA聚合酶串联亲和纯化方法的建立 被引量：2

9

作者 李印 邓国华 +3 位作者 崔佳莹 于洋 丁晴薇 陈化兰 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第11期841-844,共4页

为建立流感病毒RNA聚合酶的串联亲和纯化方法,本实验由鸡胚尿囊液中提取病毒核酸,经过RT-PCR和常规PCR方法扩增禽流感病毒株A/Duck/Guangxi/35/01(H5N1)的PB1、PB2和PA的cDNA。分别将PB2基因连接于pcDNATAP载体中,PB1和PA基因连接于pcDN... 为建立流感病毒RNA聚合酶的串联亲和纯化方法,本实验由鸡胚尿囊液中提取病毒核酸,经过RT-PCR和常规PCR方法扩增禽流感病毒株A/Duck/Guangxi/35/01(H5N1)的PB1、PB2和PA的cDNA。分别将PB2基因连接于pcDNATAP载体中,PB1和PA基因连接于pcDNA3A载体中构建了pcDNA-35PB2TAP、pcDNA-35PB1和pcDNA-35PA重组质粒。将构建的真核表达重组质粒共转染293T细胞,经过串联亲和纯化方法获得流感病毒依赖RNA的RNA聚合酶复合体(RdRp)。利用RNA体外合成试验验证获得的RdRp具有生物学活性。 展开更多

关键词 H5亚型禽流感病毒 RNA聚合酶复合体 串联亲和纯化

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TAP亲和标签选择及其在植物蛋白互作研究中的应用 被引量：1

10

作者 张志飞 赵志丽 文昭竹 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第8期23-27,共5页

串联亲和纯化法(TAP)是一种纯化生理条件下蛋白复合物的技术,已广泛应用于鉴定蛋白相互作用和揭示蛋白复合物互作网络。近年来,随着TAP新型标签的不断出现以及与其他技术的联用,TAP技术正逐渐应用于植物蛋白质互作研究中。综述了TAP亲... 串联亲和纯化法(TAP)是一种纯化生理条件下蛋白复合物的技术,已广泛应用于鉴定蛋白相互作用和揭示蛋白复合物互作网络。近年来,随着TAP新型标签的不断出现以及与其他技术的联用,TAP技术正逐渐应用于植物蛋白质互作研究中。综述了TAP亲和标签选择,并介绍其在植物蛋白互作研究中的成功应用。 展开更多

关键词 串联亲和纯化 亲和标签 植物 蛋白质相互作用

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胃癌细胞中Rab25相互作用蛋白的鉴定及功能学研究 被引量：1

11

作者 王一丞 李园园 《武警医学》 CAS 2017年第7期719-723,共5页

目的通过串联亲和纯化联合质谱技术(TAP-MS)筛选胃癌细胞中Rab25相互作用蛋白。方法利用慢病毒转染技术构建稳定表达Strep II-6His-EGFP-Rab25融合蛋白的SGC7901细胞系;通过Strep II-6His标签进行串联亲和纯化获得与Rab25相互作用的蛋... 目的通过串联亲和纯化联合质谱技术(TAP-MS)筛选胃癌细胞中Rab25相互作用蛋白。方法利用慢病毒转染技术构建稳定表达Strep II-6His-EGFP-Rab25融合蛋白的SGC7901细胞系;通过Strep II-6His标签进行串联亲和纯化获得与Rab25相互作用的蛋白复合物,并通过质谱检测蛋白复合物的组成;随后构建了Rab25蛋白质相互作用网络,并通过免疫共沉淀技术验证其在胃癌细胞中相互作用的真实性。结果通过TAP-MS技术共鉴定出26个Rab25的相互作用蛋白,主要参与癌症通路、微管运动、细胞凋亡、NOTCH通路等过程;运用免疫共沉淀方法验证了Itgb1与Rab25相互作用的真实性,并通过Transwell试验证实Rab25和Itgb1协同促进SGC7901细胞的侵袭。结论通过鉴定胃癌细胞中Rab25的相互作用蛋白网络,为胃癌的治疗提供一个新的线索。 展开更多

关键词 胃癌 RAB25 蛋白质相互作用 串联亲和纯化 质谱

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串联亲和纯化的应用及发展 被引量：1

12

作者 闫昭骐 窦岩梅 杜宏武 《生命的化学》 CAS CSCD 北大核心 2009年第4期581-587,共7页

串联亲和纯化(tandem affinity purification,TAP)最早作为一种研究酵母细胞内天然状态下蛋白质相互作用的工具,目前不仅在多个技术领域已成为筛选鉴定新蛋白质复合体的重要工具,并且将成为系统生物学研究的一项关键技术,在探索和绘制... 串联亲和纯化(tandem affinity purification,TAP)最早作为一种研究酵母细胞内天然状态下蛋白质相互作用的工具,目前不仅在多个技术领域已成为筛选鉴定新蛋白质复合体的重要工具,并且将成为系统生物学研究的一项关键技术,在探索和绘制生理条件下多细胞生物蛋白质相互作用网络图谱中发挥主导作用。本文就TAP近些年来的研究进展进行了概括,并对其常见问题与改进策略进行了总结。TAP技术的不断完善,必将使其在蛋白质相互作用领域发挥更重要的作用。 展开更多

关键词 串联亲和纯化 蛋白质复合体 标签

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串联亲和纯化技术及其在植物蛋白质组研究中的应用 被引量：1

13

作者 王丰青 吴为人 +3 位作者 陈新建 李娟 周艳 张重义 《生命科学》 CSCD 2013年第6期632-638,共7页

串联亲和纯化(TAP)是一项新颖的蛋白质复合物纯化技术,已被广泛应用于鉴定或验证蛋白质间的相互作用以及建立蛋白质互作网络,其基本原理是,将TAP标签融合到目标蛋白上,然后经过两步亲和纯化,获得融合蛋白及其结构关联蛋白。TAP技术最初... 串联亲和纯化(TAP)是一项新颖的蛋白质复合物纯化技术,已被广泛应用于鉴定或验证蛋白质间的相互作用以及建立蛋白质互作网络,其基本原理是,将TAP标签融合到目标蛋白上,然后经过两步亲和纯化,获得融合蛋白及其结构关联蛋白。TAP技术最初主要在动物和微生物中应用。近几年来,随着新型标签的出现和方法的改进,TAP技术在植物中的应用逐渐增多,为植物蛋白质组学的研究提供了一个有效的手段。简要介绍TAP方法在植物中的应用情况,并对TAP方法应用的限制因素进行分析。 展开更多

关键词 串联亲和纯化 标签 植物 蛋白质组

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串联亲和纯化技术筛选Bat3的相互作用蛋白质 被引量：1

14

作者 吴为 李琴山 +2 位作者 宋伟 缪时英 王琳芳 《中国医学科学院学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第1期1-4,共4页

目的寻找与Bat3结合的蛋白质。方法采用串联亲和纯化技术,在Bat3编码序列羧基端融合Strep2和FLAG 2个分子标签,以此为诱饵筛选与其特异结合的蛋白质,最后进行质谱鉴定。结果筛选到1种蛋白质分子,命名为Ubl4A,免疫共沉淀结果显示Ubl4A可... 目的寻找与Bat3结合的蛋白质。方法采用串联亲和纯化技术,在Bat3编码序列羧基端融合Strep2和FLAG 2个分子标签,以此为诱饵筛选与其特异结合的蛋白质,最后进行质谱鉴定。结果筛选到1种蛋白质分子,命名为Ubl4A,免疫共沉淀结果显示Ubl4A可与Bat3相互结合。结论成功建立了串联亲和纯化技术平台,分离出可与Bat3相互作用的蛋白质Ubl4A。 展开更多

关键词 Bat3 凋亡 串联亲和纯化

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SARS病毒刺突蛋白与TAP标签在Vero细胞内的融合表达研究 被引量：1

15

作者 郭岚 王健伟 +2 位作者 韩金祥 于修平 洪涛 《山东大学学报（医学版）》 CAS 北大核心 2005年第8期661-666,共6页

目的:探讨SARS冠状病毒(SARS-CoV)刺突蛋白(Spikeprotein,S蛋白)与钙调蛋白结合肽(calmodulinbindingpeptide,CBP)-蛋白A串连亲和纯化(tandemaffinitypurification,TAP)标签在Vero细胞内的融合表达及亚细胞定位,为其细胞结合蛋白的筛选... 目的:探讨SARS冠状病毒(SARS-CoV)刺突蛋白(Spikeprotein,S蛋白)与钙调蛋白结合肽(calmodulinbindingpeptide,CBP)-蛋白A串连亲和纯化(tandemaffinitypurification,TAP)标签在Vero细胞内的融合表达及亚细胞定位,为其细胞结合蛋白的筛选奠定基础。方法:从质粒pGEM-4Z-S中扩增S片段,在5'端加入Kozak序列,并与TAP标签基因共同插入pcDNA3.1(-)中,构建出真核表达载体pcDNA3.1-S-TAP(C)。将构建好的质粒瞬时转染Vero细胞,并共感染重组痘苗病毒vTF7-3,用间接免疫荧光及Western-blotting技术检测融合蛋白的表达及亚细胞定位。结果:成功构建出真核表达载体pcD-NA3.1-S-TAP(C),瞬时转染Vero细胞后S-CBP-蛋白A融合蛋白[S-TAP(C)]得到表达,重组痘苗病毒vTF7-3可有效增强该融合蛋白的表达水平,且检测到S-TAP(C)融合蛋白表达于细胞膜上。结论:S蛋白与TAP标签融合蛋白表达于细胞膜上,且vTF7-3的感染有助于靶蛋白表达水平的提高。 展开更多

关键词 SARS冠状病毒 刺突蛋白 TAP标签 VERO细胞 表达

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CUL4A-DDB1细胞稳定株筛选及DNA双链断裂模型构建 被引量：1

16

作者 黄思斯 焦杨 +2 位作者 谢萍 王青 张令强 《军事医学》 CAS CSCD 北大核心 2012年第7期520-523,共4页

目的为了鉴定并验证CUL4A-DDB1泛素连接酶复合体中参与DNA损伤修复反应过程的1～2种关键成分在损伤识别、早期及晚期修复中的动态变化,拟构建含有串联亲和纯化(TAP)标签载体并筛选高表达CUL4A/DDB1的细胞株,建立DNA双链断裂模型。方法利... 目的为了鉴定并验证CUL4A-DDB1泛素连接酶复合体中参与DNA损伤修复反应过程的1～2种关键成分在损伤识别、早期及晚期修复中的动态变化,拟构建含有串联亲和纯化(TAP)标签载体并筛选高表达CUL4A/DDB1的细胞株,建立DNA双链断裂模型。方法利用PCR获得CUL4A/DDB1基因,构建重组表达载体pNTAP-A-CUL4A/DDB1;使用顺铂和电离辐射刺激等外界刺激建立合适的DNA双链断裂细胞模型,使用G418筛选稳定表达CUL4A/DDB1的细胞株。结果与结论成功构建pNTAP-A-CUL4A/DDB1表达载体,建立合适的DNA双链断裂细胞模型,筛选得到稳定表达CUL4A/DDB1的细胞稳定株,为下一步质谱分析CUL4A-DDB1泛素连接酶在DNA损伤修复过程中的新功能打下基础。 展开更多

关键词 DNA损伤 CUL4A-DDB1 串联亲和纯化

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串联亲和标签LOX蛋白慢病毒表达载体的构建及在乳腺癌细胞中的表达 被引量：1

17

作者 刘侠 刘剑仑 +3 位作者 蒋奕 唐玮 杨华伟 韦薇 《现代生物医学进展》 CAS 2015年第29期5613-5616,共4页

目的:为了研究赖氨酰氧化酶(Lysyl Oxidase,LOX)及其相互作用蛋白质在乳腺癌中的功能,构建带StrepⅡ/FLAG串联亲和标签的重组LOX蛋白慢病毒表达载体并在乳腺癌细胞MDA-MB-231中表达。方法:设计引物通过聚合酶链式反应获得带StrepⅡ/FLA... 目的:为了研究赖氨酰氧化酶(Lysyl Oxidase,LOX)及其相互作用蛋白质在乳腺癌中的功能,构建带StrepⅡ/FLAG串联亲和标签的重组LOX蛋白慢病毒表达载体并在乳腺癌细胞MDA-MB-231中表达。方法:设计引物通过聚合酶链式反应获得带StrepⅡ/FLAG串联亲和标签的LOX蛋白(LOX-SF)的亲本质粒,双酶切后鉴定测序克隆至GV303表达载体,连同慢病毒包装质粒共同转染293T得到GV303/LOX-SF慢病毒,将其转染MDA-MB-231细胞,使用荧光定量PCR和蛋白质印迹实验对细胞中重组蛋白LOX-SF进行检测。结果:通过串联亲和纯化获得LOX-SF重组蛋白,使用标签抗体成功鉴定到LOX-SF重组蛋白在MDA-MB-231细胞内稳定表达。结论:GV303/LOX-SF的构建,使带StrepⅡ/FLAG融合标签的LOX蛋白在MDA-MB-231中成功表达及纯化,为筛选和研究LOX及其相互作用蛋白在乳腺癌细胞内的功能奠定了实验基础。 展开更多

关键词 串联亲和纯化 标签 赖氨酰氧化酶 慢病毒载体 相互作用蛋白质

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与结核分枝杆菌PE25/PPE41和PE35/PPE68相互作用的宿主蛋白的筛选 被引量：1

18

作者 李田田 陈利苹 刘思国 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第6期504-507,共4页

为筛选与结核分枝杆菌(MTB)的PE25/PPE41和PE35/PPE68两对异源二聚体相互作用的宿主蛋白,本研究以这两对异源二聚体为诱饵蛋白筛选与其相互作用的宿主蛋白。首先将PCR扩增的PE25/PPE41或PE35/PPE68基因串联克隆于改造的pc DNA3.1(+)中(... 为筛选与结核分枝杆菌(MTB)的PE25/PPE41和PE35/PPE68两对异源二聚体相互作用的宿主蛋白,本研究以这两对异源二聚体为诱饵蛋白筛选与其相互作用的宿主蛋白。首先将PCR扩增的PE25/PPE41或PE35/PPE68基因串联克隆于改造的pc DNA3.1(+)中(在5'端引入了以编码烟草蚀纹病毒蛋白酶切位点的序列连接的ZZ和Flag标签序列),构建诱饵重组质粒pcDNA-PE25-PPE41和pc DNA-PE35-PPE68。分别将构建的诱饵重组质粒转染293T细胞后提取细胞总蛋白,经ZZ和Flag标签蛋白两步串联亲和层析钓取宿主蛋白,SDS-PAGE电泳分离后切取差异蛋白胶条进行质谱分析,结果显示,PE25/PPE41鉴定到15个差异蛋白,PE35/PPE68鉴定到29个差异蛋白,并分别挑选了与PE25/PPE41和PE35/PPE68相互作用的3个和7个差异蛋白,为进一步验证与PE25/PPE41和PE35/PPE68直接作用的宿主蛋白及研究其生物学功能奠定了基础。 展开更多

关键词 结核分枝杆菌 PE25/PPE41 PE35/PPE68 宿主互作蛋白 串联亲和纯化

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串联亲和纯化原核表达载体的构建 被引量：1

19

作者 魏波 廖翔 +6 位作者 周围 高原 王羽 冉金宝 梁龙 岳俊杰 呼和巴特尔 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第3期374-380,共7页

【目的】构建串联亲和纯化原核表达载体,用于研究细菌中(生理状态或接近生理条件下的)蛋白-蛋白相互作用。【方法】设计并合成两条串联亲和标签序列,分别可以在靶蛋白N端和C端融合Protein G和链亲和素结合肽(Streptavidin binding pepti... 【目的】构建串联亲和纯化原核表达载体,用于研究细菌中(生理状态或接近生理条件下的)蛋白-蛋白相互作用。【方法】设计并合成两条串联亲和标签序列,分别可以在靶蛋白N端和C端融合Protein G和链亲和素结合肽(Streptavidin binding peptide,SBP)标签;以pUC18载体为骨架,去除原有的阻遏蛋白基因,构建组成型表达载体pNTAP和pCTAP。【结果】成功构建N端和C端标签表达载体pNTAP和pCTAP,它们在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)、肠出血性大肠杆菌O157:H7和痢疾杆菌福氏5型M90T菌株中都可以实现表达。【结论】本实验构建的两个串联亲和纯化表达载体可以在部分革兰氏阴性细菌中表达,为研究细菌内蛋白-蛋白相互作用及致病菌毒力蛋白的作用机制奠定了基础。 展开更多

关键词 原核表达载体 串联亲和纯化 蛋白相互作用

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带TAP标签的癌蛋白SET真核载体的构建及其表达 被引量：1

20

作者 周丽 陈谋通 +4 位作者 刘建军 房师松 黄海燕 袁建辉 徐新云 《癌变．畸变．突变》 CAS CSCD 2009年第4期263-267,共5页

背景与目的:为研究三氯乙烯诱导的差异蛋白SET在肝细胞L-02中的相互作用,构建带串联亲和纯化(tandem affinity purification,TAP)标签融合表达的真核表达载体pcDNA3.1/SET-TAP。材料与方法:从L-02肝细胞中提取总RNA,采用RT-PCR法扩增SE... 背景与目的:为研究三氯乙烯诱导的差异蛋白SET在肝细胞L-02中的相互作用,构建带串联亲和纯化(tandem affinity purification,TAP)标签融合表达的真核表达载体pcDNA3.1/SET-TAP。材料与方法:从L-02肝细胞中提取总RNA,采用RT-PCR法扩增SET基因,从质粒中扩增得到TAP基因,采用重叠PCR法将基因SET与TAP连接成SET-TAP,双酶切后纯化序列定向克隆至pcDNA3.1/zeo(+)并转化E.coli DH5α,取阳性克隆进行酶切和测序鉴定,重组质粒瞬时转染L-02肝细胞进行表达,Real Ti me-PCR和Western blotting检测融合蛋白的表达。结果:经双酶切和DNA测序鉴定,证实pcDNA3.1/SET-TAP真核表达载体构建成功,将该载体转染L-02细胞后,融合蛋白在肝细胞中获得高效表达。结论:该结果为研究SET在三氯乙烯致肝细胞毒性的蛋白质相互作用以及三氯乙烯致机体损伤的机制奠定了基础。 展开更多

关键词 三氯乙烯 癌蛋白SET 重叠PCR 串联亲和纯化 融合表达

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