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基于VP1重组蛋白的口蹄疫病毒O型间接ELISA检测技术 被引量:2
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作者 于军超 张乐萃 +9 位作者 高志强 张鹤晓 马贵平 蒲静 张利峰 吴亚琼 王慧珊 朱淑芬 张伟 谷强 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2012年第12期20-23,共4页
采用RT-PCR方法扩增O型口蹄疫病毒VP1基因片段,将其克隆于pET-32a。将重组质粒转化宿主菌Rosetta,经1.0mmol/L IPTG诱导,外源基因获高效表达。通过Western-blot以及ELISA试验证明,重组VP1蛋白与标准阳性血清发生反应。以纯化的VP1蛋白... 采用RT-PCR方法扩增O型口蹄疫病毒VP1基因片段,将其克隆于pET-32a。将重组质粒转化宿主菌Rosetta,经1.0mmol/L IPTG诱导,外源基因获高效表达。通过Western-blot以及ELISA试验证明,重组VP1蛋白与标准阳性血清发生反应。以纯化的VP1蛋白作为检测抗原包被酶标板建立了检测口蹄疫病毒O型抗体的间接ELISA方法。对355份临床血清样品的检测结果显示,建立的方法与口蹄疫病毒O型液相阻断试剂盒符合率为98.87%。表明建立的方法能够用于口蹄疫病毒O型抗体的快速分型检测。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒O型 vp1基因 重组表达 间接ELISA
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猪捷申病毒8型rVP1-ELISA检测方法的建立 被引量:8
2
作者 胡峰 刘杉杉 +6 位作者 蔺文成 王晓玲 张超范 王朝 刘朝霞 胡泉博 崔尚金 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2012年第3期258-263,共6页
为建立猪捷申病毒(PTV)抗体的间接ELISA检测方法,将PTV-8VP1基因克隆至原核表达载体pET-30a中,重组质粒转化大肠杆菌Rosetta表达重组的VP1蛋白。SDS-PAGE及Western-blot分析结果表明,表达的重组蛋白分子质量约为36.2ku,且能被PTV-8阳性... 为建立猪捷申病毒(PTV)抗体的间接ELISA检测方法,将PTV-8VP1基因克隆至原核表达载体pET-30a中,重组质粒转化大肠杆菌Rosetta表达重组的VP1蛋白。SDS-PAGE及Western-blot分析结果表明,表达的重组蛋白分子质量约为36.2ku,且能被PTV-8阳性血清特异性识别。以纯化的重组蛋白包被ELISA反应板,建立了检测PTV抗体的间接ELISA方法。特异性试验结果表明,重组VP1蛋白与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型和猪瘟病毒阳性血清不发生反应。敏感性试验结果表明血清稀释至1∶800时仍检测为阳性。该方法的批内、批间变异系数均小于10%,表明具有较好的重复性。利用建立的方法对633份临床样品进行检测,阳性率是88.10%。选取58份临床样品与间接免疫荧光方法作比对试验,两者的符合率是94.80%。 展开更多
关键词 猪捷申病毒 重组vp1蛋白 原核表达 间接ELISA
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基于基因C型鸭甲肝病毒VP1重组蛋白的鸭甲肝病毒抗体ELISA检测方法的建立 被引量:4
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作者 杨发龙 张焕容 +2 位作者 程方明 岳华 汤承 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第7期1148-1153,共6页
以纯化的基因C型鸭甲肝病毒(DHAV-C)VP1重组蛋白作为包被抗原,建立检测DHAV-C抗体的间接ELISA方法。结果表明,试验的最佳条件:用pH9.6、0.05 mol·L-1的碳酸盐缓冲液将包被抗原稀释成5μg·mL-1,4℃包被过夜,抗体稀释度为1∶100... 以纯化的基因C型鸭甲肝病毒(DHAV-C)VP1重组蛋白作为包被抗原,建立检测DHAV-C抗体的间接ELISA方法。结果表明,试验的最佳条件:用pH9.6、0.05 mol·L-1的碳酸盐缓冲液将包被抗原稀释成5μg·mL-1,4℃包被过夜,抗体稀释度为1∶100,HRP酶标羊抗鸭IgG稀释度为1∶5 000,封闭液为含10%脱脂乳的0.01mol·L-1 PBS,37℃封闭2h,血清稀释液为含1%BSA的PBS,抗体反应时间为60min,酶标羊抗鸭IgG反应时间为30min,底物作用时间为15min,临界值为OD450nm≥0.474。该方法重复性好,批内变异系数为2.03%~2.95%,批间变异系数为3.28%~7.38%,与鸭圆环病毒(DUCV)、鸭乙型肝炎病毒(DHBV)、鸭瘟病毒(DPV)、新城疫病毒(NDV)、禽流感病毒(AIV)、鸭抗大肠杆菌、鸭抗金黄色葡萄球菌、鸭抗沙门菌、鸭抗禽多杀性巴氏杆菌以及鸭疫里默杆菌阳性血清无交叉反应,而与基因A型鸭甲肝病毒(DHAV-A)阳性血清有交叉反应,表明该方法可以作为检测DHAV-C和DHAV-A抗体的通用ELISA方法。与中和试验相比,阳性血清检测符合率为80%,阴性血清检测符合率为100%。初步临床应用表明:该方法可用于雏鸭母源抗体和免疫后抗体消长的检测。本研究基于DHAV-C VP1重组蛋白建立的间接ELISA方法可用于基因A型和C型鸭甲型肝炎的血清流行病学调查和抗体检测。 展开更多
关键词 基因C型鸭甲肝病毒 vp1蛋白 间接ELISA 抗体检测
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A型清道夫受体在口蹄疫病毒VP1-VP4蛋白诱导小鼠免疫应答中的作用 被引量:1
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作者 董昌海 李红芳 +4 位作者 刘元杰 王丹 高云欢 李丽敏 王家鑫 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第12期1888-1892,共5页
为研究A型清道夫受体(SR-A)在重组口蹄疫病毒(FMDV)VP1-VP4蛋白诱导小鼠产生抗免疫应答中的作用,通过构建Pet32a-VP1-VP4原核表达系统制备VP1-VP4蛋白,用纯化的VP1-VP4蛋白分别免疫预先注射SR-A抑制剂的BALB/c小鼠和未作处理的BALB/c小... 为研究A型清道夫受体(SR-A)在重组口蹄疫病毒(FMDV)VP1-VP4蛋白诱导小鼠产生抗免疫应答中的作用,通过构建Pet32a-VP1-VP4原核表达系统制备VP1-VP4蛋白,用纯化的VP1-VP4蛋白分别免疫预先注射SR-A抑制剂的BALB/c小鼠和未作处理的BALB/c小鼠,用ELISA检测免疫7d后小鼠血清中IFN-γ和IL-4的含量,用琼脂扩散法测血清的抗体效价,用ELISA检测血清抗体亚类的含量。结果发现,经SR-A抑制剂处理的小鼠血清IFN-γ含量和IL-4含量均降低,血清总抗体效价也降低,但血清IgA水平显著升高,这表明SR-A在识别VP1-VP4蛋白进而启动免疫应答的过程中发挥广泛的调节作用。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒 A型清道夫受体 重组vp1-vp4蛋白 免疫应答
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肠道病毒71型外壳蛋白VP1的可溶性表达、纯化及活性鉴定 被引量:1
5
作者 周亚萍 史伟峰 +5 位作者 朱荫昌 曹利民 朱思梅 史梅 李坤 姜庆波 《热带医学杂志》 CAS 2011年第9期1018-1020,1035,共4页
目的克隆、表达和鉴定肠道病毒71型(EV71)VP1基因,得到可溶性的蛋白VP1,为制备EV71的抗体和诊断试剂的开发打下基础。方法优化EV71VP1蛋白基因,克隆并构建重组表达质粒pET15b/VP1,转化大肠杆菌BL21。使用Ni2+亲和层析柱对重组蛋白进行纯... 目的克隆、表达和鉴定肠道病毒71型(EV71)VP1基因,得到可溶性的蛋白VP1,为制备EV71的抗体和诊断试剂的开发打下基础。方法优化EV71VP1蛋白基因,克隆并构建重组表达质粒pET15b/VP1,转化大肠杆菌BL21。使用Ni2+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,并用Westernblotting检测目的蛋白。以重组蛋白VP1为抗原,ELISA检测抗原活性。结果重组蛋白在大肠杆菌中可以高效表达,SDS-PAGE显示其相对分子质量为36000,与预计大小一致。ELISA实验证实,重组蛋白具有良好的抗原性。结论本研究成功克隆和表达了EV71VP1蛋白,并得到可溶性的蛋白,对肠道病毒71型诊断试剂的开发有进一步潜在的应用价值。 展开更多
关键词 肠道病毒71 重组蛋白vp1 可溶性抗原
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鸭甲肝病毒鸡胚化弱毒MY株Vp1重组蛋白的免疫保护效果试验
6
作者 路娇 罗薇 +1 位作者 刘内生 刘群 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2012年第1期6-9,共4页
将鸭甲肝病毒鸡胚化弱毒MY株Vp1基因原核表达工程菌(pET32a+Vp1,BL21(DE3)PlysS)对基因Vp1进行大量表达和纯化,得到鸭甲肝弱毒MY株Vp1重组蛋白作为抗原制备亚单位疫苗,免疫雏鸭,用间接ELISA检测方法对免疫后抗体生成水平进行监测,并通... 将鸭甲肝病毒鸡胚化弱毒MY株Vp1基因原核表达工程菌(pET32a+Vp1,BL21(DE3)PlysS)对基因Vp1进行大量表达和纯化,得到鸭甲肝弱毒MY株Vp1重组蛋白作为抗原制备亚单位疫苗,免疫雏鸭,用间接ELISA检测方法对免疫后抗体生成水平进行监测,并通过动物攻毒试验评价免疫保护效果。结果显示:Vp1重组蛋白免疫家兔后血清检测琼扩效价≥1∶64,细胞中和试验效价为1/45;雏鸭免疫后抗体生成水平呈明显上升趋势,对攻毒起到了保护作用。首次揭示了DHAV-1结构蛋白Vp1刺激机体产生抗体使雏鸭获得保护的能力。 展开更多
关键词 鸭肝炎 鸡胚化弱毒 vp1重组蛋白 免疫保护
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猪脑心肌炎病毒抗体间接ELISA检测方法的建立及应用 被引量:4
7
作者 陆文俊 施开创 +3 位作者 屈素洁 莫胜兰 李向涛 钟诚 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2011年第12期6-10,共5页
以猪脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus,EMCV)VP1重组蛋白为包被抗原,建立了检测EMCV血清抗体的间接酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)。经优化,获得间接ELISA的最佳反应条件为抗原包被浓度0.625μg/mL... 以猪脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus,EMCV)VP1重组蛋白为包被抗原,建立了检测EMCV血清抗体的间接酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)。经优化,获得间接ELISA的最佳反应条件为抗原包被浓度0.625μg/mL,待检血清稀释度为1∶40,封闭液为50g/L脱脂乳,酶标兔抗猪抗体稀释度为1∶6 000,底物显色时间为室温避光15min,血清样本阴阳性临界值为OD450nm值≥0.33。与口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus,FMDV)、猪瘟病毒(Classical swine fevervirus,CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)、猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV-2)抗体没有交叉反应。应用所建立的方法对广西2010年—2011年所采集的2 228份血清进行检测,被检血清样品平均阳性率为91.47%,被检猪场阳性率为100%。表明广西地区猪群感染普遍。 展开更多
关键词 脑心肌炎病毒 vp1重组蛋白 间接ELISA 血清学调查
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The Development and Application of an Indirect ELISA Test for the Detection of Chicken Anaemia Virus (CAV) by VP1 in Chicken Flock Serum
8
作者 Elham O. Mahgoub 《Open Journal of Genetics》 2014年第4期316-331,共16页
Chicken anaemia virus (CAV) causes a viral disease in chickens worldwide and thus has economic importance. The main aim of this study was to develop a rapid, sensitive and specific VP1-CAVI indirect ELISA for the dete... Chicken anaemia virus (CAV) causes a viral disease in chickens worldwide and thus has economic importance. The main aim of this study was to develop a rapid, sensitive and specific VP1-CAVI indirect ELISA for the detection of CAV infection. The CAV-VP1, was separately cloned and expressed in recombinant E. coli. The purified recombinant CAV-VP1 protein was then coated as an antigen on an ELISA plates to evaluate its reactivity against chicken sera. The resulting indirect ELISA was then compared with a commercial ELISA. The specificity and sensitivity of the indirect ELISA were measured as 93.3% and 100%, respectively. A t-test produced a t-value of 15.805 for the indirect ELISA and revealed a significant difference between CAV-positive serum and CAV-negative serum (p-value of 0.001). For the second variable (i.e., a commercial ELISA), the t-test yielded a t-value of 5.063, which revealed a significant difference between CAV-positive serum and CAV-negative serum (p-value of 0.015). This intervention produces statistically significant improvements in both variables (p-values < 0.05). The correlation coefficient for the indirect ELISA was r = 0.93. Therefore, this work can be considered as a new achievement in diagnosis for Chicken anaemia virus in chicken flocks. 展开更多
关键词 Indirect ELISA Commercial ELISA CHICKEN ANAEMIA Virus recombinant Protein vp1 Sensitivity Specificity Standard Curve for Indirect ELISA
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肥大细胞对重组口蹄疫病毒VP1-VP4蛋白的模式识别效应 被引量:2
9
作者 李丽敏 王燕 +4 位作者 崔贝贝 林敏 张磊 左玉柱 王家鑫 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第9期1644-1649,共6页
为研究肥大细胞对重组口蹄疫病毒VP1-VP4蛋白的模式识别作用,将VP1-VP4蛋白负载经TLR2/TLR4抑制剂、甘露糖受体抑制剂或清道夫受体抑制剂预处理的小鼠肥大细胞系P815,在不同时间点观察其脱颗粒现象,并用ELISA检测细胞上清液中TNF-α的... 为研究肥大细胞对重组口蹄疫病毒VP1-VP4蛋白的模式识别作用,将VP1-VP4蛋白负载经TLR2/TLR4抑制剂、甘露糖受体抑制剂或清道夫受体抑制剂预处理的小鼠肥大细胞系P815,在不同时间点观察其脱颗粒现象,并用ELISA检测细胞上清液中TNF-α的含量。结果显示,清道夫受体抑制剂处理组在负载VP1-VP4蛋白15和30min时P815细胞脱颗粒数目均极显著低于重组VP1-VP4蛋白组(P<0.001)。在负载VP1-VP4蛋白24h时,各抑制剂处理组的TNF-α含量均极显著低于VP1-VP4蛋白组(P<0.001),其中以甘露糖受体抑制剂处理组含量最低。这表明小鼠肥大细胞系P815主要通过清道夫受体识别FMDV VP1-VP4并引起脱颗粒现象的发生,而甘露糖受体和TLR2/TLR4识别FMDV VP1-VP4则是引起P815细胞分泌TNF-α的主要模式识别机制,其中以甘露糖受体的作用最强。 展开更多
关键词 肥大细胞 模式识别受体 重组口蹄疫病毒vp1-vp4 脱颗粒 Α-肿瘤坏死因子
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共表达口蹄疫病毒VP1-2A基因与猪IL-2重组腺病毒的构建及其免疫效果研究 被引量:3
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作者 苏春霞 段相国 +3 位作者 郑洁 林源 郭琳 陈溥言 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2014年第2期1-5,共5页
构建共表达口蹄疫病毒(FMDV)VP1-2A基因和猪白细胞介素2(IL-2)基因的重组腺病毒,并研究重组病毒对小鼠特异性免疫的影响。将FMDV VP1-2A基因和猪IL-2基因先后克隆到腺病毒的穿梭载体pAdenoVator-CMV5-IRES-GFP中,在受体菌中与腺病毒骨... 构建共表达口蹄疫病毒(FMDV)VP1-2A基因和猪白细胞介素2(IL-2)基因的重组腺病毒,并研究重组病毒对小鼠特异性免疫的影响。将FMDV VP1-2A基因和猪IL-2基因先后克隆到腺病毒的穿梭载体pAdenoVator-CMV5-IRES-GFP中,在受体菌中与腺病毒骨架载体pAdenoVatorΔE1/E3同源重组。重组腺病毒质粒转染HEK-293A细胞,得到重组腺病毒rAd5VP1-2A-Po IL-2。MTT法检测重组IL-2的生物活性。用rAd5VP1-2A-poIL-2免疫接种小鼠,同时设免疫单独表达FMDV VP1基因的重组腺病毒rAd5VP1和空腺病毒的对照组。通过检测淋巴细胞增殖功能,特异性抗体分泌,IL-4和IFN-γ的表达水平衡量rAd5VP1-2A-poIL-2对小鼠特异性免疫应答的影响。结果显示,成功获得了rAd5VP1-2A-poIL-2,MTT法检测重组IL-2具有生物学活性。小鼠免疫试验结果显示,与rAd5VP1免疫组相比,rAd5VP1-2ApoIL-2免疫既能增强重组病毒诱导小鼠淋巴细胞增殖的能力,又能提高重组病毒诱导小鼠特异性抗体的水平。细胞因子检测结果显示,串联IL-2能促进重组病毒诱导Th1和Th2的分化。研究结果说明,rAd5VP1-2A-poIL-2可望成为口蹄疫的候选疫苗。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒 重组腺病毒 vp1-2A基因 白细胞介素2
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