类弹性蛋白多肽的从头设计、非色谱纯化及盐效应 被引量：19

1

作者 黄凯宗 李晶晶 +3 位作者 李巍 葛慧华 王文研 张光亚 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第4期653-658,共6页

旨在克隆、表达与纯化类弹性蛋白多肽,并测定类弹性蛋白的相变温度对不同的盐敏感程度。从头设计了类弹性蛋白多肽的序列并人工合成其编码基因片段,克隆至改造后的表达载体pET-22b(+)中,构建重组表达载体,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中并... 旨在克隆、表达与纯化类弹性蛋白多肽,并测定类弹性蛋白的相变温度对不同的盐敏感程度。从头设计了类弹性蛋白多肽的序列并人工合成其编码基因片段,克隆至改造后的表达载体pET-22b(+)中,构建重组表达载体,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中并诱导表达,采用可逆相变循环经高速离心对其进行纯化,并考察了盐类型及浓度对类弹性蛋白相变温度的影响。结果表明:0.4 mmol/L的Na2CO3能使25μmol/L类弹性蛋白多肽[KV8F-20]相变温度降低至19℃,此类弹性蛋白多肽序列有望开发成一新型纯化标签,为今后重组蛋白的非色谱分离纯化奠定基础。 展开更多

关键词 类弹性蛋白多肽 非色谱法纯化 可逆相变循环 相变温度 纯化标签

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以类弹性蛋白多肽为标签的表达质粒构建及其用于木聚糖酶的非色谱纯化 被引量：5

2

作者 付晓平 王文研 张光亚 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第1期90-95,共6页

【目的】旨在构建一个能以非色谱纯化目标蛋白的表达质粒,使用自行设计的类弹性蛋白多肽(ELPs)作为非色谱纯化标签,以纯化目标蛋白。该ELPs长度短,对盐非常敏感。【方法】从头设计了木聚糖酶,将其通过一段无规则卷曲同ELPs相连,合成了... 【目的】旨在构建一个能以非色谱纯化目标蛋白的表达质粒,使用自行设计的类弹性蛋白多肽(ELPs)作为非色谱纯化标签,以纯化目标蛋白。该ELPs长度短,对盐非常敏感。【方法】从头设计了木聚糖酶,将其通过一段无规则卷曲同ELPs相连,合成了编码上述序列的基因,并构建重组表达载体pET-22b-SoxB-M2-S-ELP,转化至大肠杆菌BLR(DE3)中诱导表达,采用可逆相变循环经高速离心纯化木聚糖酶,并考察纯酶的酶学性质。【结果】成功构建了表达载体并表达,在pH=7.0时0.5 mol/L碳酸钠可使ELPs的相变温度降至22℃。在上述条件下,对木聚糖酶进行了非色谱纯化,其纯化倍数为3.2,回收率为21.2%,纯度为64.3%。经测定,未连接ELPs的酶、粗酶及纯化酶学性质基本一致,其最适温度为60℃,最适pH为6.0,最适反应时间为30 min,粗酶70℃保温1 h相对酶活仍有50%,为嗜热木聚糖酶,与预期相符。【结论】ELPs作为非色谱纯化标签纯化重组木聚糖酶具有操作简单、易于放大、成本较低的优势,故所构建的重组质粒可望通用于分离多种重组蛋白,具有较广泛的用途。 展开更多

关键词 类弹性蛋白多肽 非色谱纯化 相变温度 木聚糖酶 重组质粒 从头设计

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人源WNT16 HEK 293T稳转细胞株构建、蛋白纯化与活性检测方法研究

3

作者 王克芬 陈海迪 +3 位作者 章嘉成 周鑫 邓成 武永康 《四川医学》 CAS 2023年第12期1233-1238,共6页

目的无翅型MMTV整合位点家族成员16(WNT16)是一种重要的信号调节蛋白,参与多种细胞生物学过程的调控。本研究旨在构建稳定转染WNT16基因的HEK 293T细胞株,并利用多聚赖氨酸标签(HIS-Tag)实现高效纯化WNT16蛋白。方法使用TK-PCDH-copGFP-... 目的无翅型MMTV整合位点家族成员16(WNT16)是一种重要的信号调节蛋白,参与多种细胞生物学过程的调控。本研究旨在构建稳定转染WNT16基因的HEK 293T细胞株,并利用多聚赖氨酸标签(HIS-Tag)实现高效纯化WNT16蛋白。方法使用TK-PCDH-copGFP-T2A-Puro载体,将WNT16 CDS-HIS序列通过XbaI和BamHI位点连接载体,构建慢病毒载体质粒;将该质粒与pSPAX2和pMD2.G一起共转染HEK 293T细胞,制备携带WNT16基因的慢病毒;利用慢病毒感染HEK 293T细胞,并通过嘌呤霉素筛选和Western Blot鉴定稳定过表达WNT16的细胞株;利用镍螯合琼脂糖凝胶与HIS标签的高亲和性纯化WNT16蛋白,使用考马斯亮蓝染色和Western Blot法检测纯化效果;用纯化的WNT16蛋白刺激Jurkat细胞,使用Western Blot法检测Jurkat细胞中β-catenin信号通路蛋白的水平,以评估WNT16蛋白的活性。结果成功构建过表达WNT16基因的慢病毒表达载体,并用其感染HEK 293T细胞。经过嘌呤霉素筛选和Western Blot鉴定,我们获得了稳定表达WNT16的HEK 293T细胞株。使用HIS标签成功纯化了WNT16蛋白,并用考马斯亮蓝染色和Western Blot法检测了纯化效果。最后,我们用纯化的WNT16蛋白刺激Jurkat细胞,并用Western Blot法检测了Jurkat细胞中β-catenin信号通路蛋白的水平,WNT16蛋白能够显著增加Jurkat细胞中β-catenin蛋白的表达,表明纯化的WNT16蛋白具有激活WNT/β-catenin通路的生物学活性。结论本研究成功实现了WNT16蛋白的高效表达和纯化,并初步研究了其功能。这为进一步探究WNT16在细胞生物学中的作用提供了重要的实验基础。 展开更多

关键词 WNT16 HEK 293T细胞 过表达 稳转细胞株 纯化 HIS标签

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以类弹性蛋白多肽为标签纯化1,3-丙二醇氧化还原酶 被引量：3

4

作者 葛慧华 黄志宏 +2 位作者 王文研 张诗冉 张光亚 《应用与环境生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第4期709-712,共4页

以类弹性蛋白多肽(ELPs)为标签的非色谱纯化重组蛋白显示出良好的应用前景.本文使用自行设计的新型ELPs纯化标签,以低浓度盐诱发其可逆相变,从而更温和、高效地纯化融合表达的1,3-丙二醇氧化还原酶(PDOR).在测得ELPs-PDOR融合蛋白在不... 以类弹性蛋白多肽(ELPs)为标签的非色谱纯化重组蛋白显示出良好的应用前景.本文使用自行设计的新型ELPs纯化标签,以低浓度盐诱发其可逆相变,从而更温和、高效地纯化融合表达的1,3-丙二醇氧化还原酶(PDOR).在测得ELPs-PDOR融合蛋白在不同浓度Na2CO3溶液中相变温度的基础上,选取0.8 mol/L Na2CO3溶液,在室温下使ELPs发生可逆相变,与目的蛋白PDOR一同聚集,经可逆相变以离心法得以纯化,得到纯度约98%的纯酶,纯化倍数可达到8倍以上,是组氨酸标签的7倍多.融合酶的酶学性质表明ELPs作为纯化标签对目标蛋白空间结构影响微小,融合蛋白可直接作为酶催化化学反应.低盐诱发相变的方法,可避免盐浓度过高对酶结构及性能产生的不利影响,因此,在重组酶纯化上更具有优势. 展开更多

关键词 类弹性蛋白多肽 纯化标签 可逆相变 重组酶纯化 非色谱法

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一种带有组氨酸标签的抗糖尿病疫苗的构建、表达、纯化及鉴定 被引量：2

5

作者 杨雪 刘晓锐 +4 位作者 邢芸 徐茂磊 金亮 刘景晶 吴洁 《药物生物技术》 CAS 2013年第3期189-193,共5页

利用组氨酸标签系统提高抗糖尿病疫苗HSP65-6P277融合蛋白的产量,简化纯化工艺。通过PCR方法,在融合蛋白HSP65-6P277的N端添加6个组氨酸标签后,定向克隆到pET28a原核表达载体中成功构建了组氨酸标签融合表达载体pET28a-HIS-HSP65-6P277... 利用组氨酸标签系统提高抗糖尿病疫苗HSP65-6P277融合蛋白的产量,简化纯化工艺。通过PCR方法,在融合蛋白HSP65-6P277的N端添加6个组氨酸标签后,定向克隆到pET28a原核表达载体中成功构建了组氨酸标签融合表达载体pET28a-HIS-HSP65-6P277。通过乳糖诱导,融合蛋白HIS-HSP65-6P277在大肠杆菌BL21(DE3)宿主中以可溶形式表达,镍柱亲和层析纯化后,经SDS-PAGE和Western blotting鉴定表明表达产物是约70 k具有6个组氨酸标签肽的融合蛋白;分离纯化融合蛋白的时间从原来的15～20 d缩短为2～3 d,产量提高到56 mg/L。组氨酸标签系统可以较好的简化抗糖尿病疫苗HSP65-6P277融合蛋白的纯化工艺,提高产量。 展开更多

关键词 疫苗 Ⅰ型糖尿病 大肠杆菌 重组表达 His-Hsp65-6p277融合蛋白 分离纯化 组氨酸标签

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人DNase Ⅰ的表达、纯化及降解NETs活性研究 被引量：2

6

作者 梁艺璇 吴洁 《中国药科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期93-99,共7页

为获得纯度较高的人脱氧核糖核酸酶Ⅰ(DNase Ⅰ)以研究其对中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellulartraps,NETs)的降解作用,构建基因工程表达菌E. coli Rosetta (DE3)/p ET32a-His-DNase Ⅰ,乳糖诱导表达,经镍柱亲和纯化获得融... 为获得纯度较高的人脱氧核糖核酸酶Ⅰ(DNase Ⅰ)以研究其对中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellulartraps,NETs)的降解作用,构建基因工程表达菌E. coli Rosetta (DE3)/p ET32a-His-DNase Ⅰ,乳糖诱导表达,经镍柱亲和纯化获得融合蛋白His-DNase Ⅰ。提取小鼠中性粒细胞,用佛波酯PMA刺激形成NETs,Sytox Green及荧光显微镜检测融合蛋白对NETs的降解活性。结果表明,成功构建人DNase Ⅰ基因克隆并在原核细胞中实现高效表达,纯化的His-DNase Ⅰ具备较高的核酸酶活性。本研究为进一步探究DNase Ⅰ的临床应用奠定了理论基础。 展开更多

关键词 脱氧核糖核酸酶Ⅰ 中性粒细胞胞外诱捕网 分离纯化 His标签

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含有纯化标签的重组人表皮生长因子的构建及表达 被引量：2

7

作者 熊盛 陈宇霞 +4 位作者 钱垂文 黄立 张美英 黄文韬 王一飞 《中国卫生检验杂志》 CAS 2006年第10期1153-1155,1174,共4页

目的:高效表达和制备有活性的人表皮生长因子(hum an ep iderm al growth factor,hEGF)。方法:用DNA重组技术构建EGF基因并插入表达载体pQE-40,与载体上的6×H is标签融合,获得的表达质粒pQE-EGF转化E.coliM15[pREP4],得工程菌M15[p... 目的:高效表达和制备有活性的人表皮生长因子(hum an ep iderm al growth factor,hEGF)。方法:用DNA重组技术构建EGF基因并插入表达载体pQE-40,与载体上的6×H is标签融合,获得的表达质粒pQE-EGF转化E.coliM15[pREP4],得工程菌M15[pQE-EGF]。MTT法测定活性,培养工程菌M15[pQE-EGF]并诱导目的蛋白表达,镍离子螯合亲和层析纯化重组EGF。结果:所构建的EGF序列正确,重组EGF在大肠杆菌中以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的21.2%,经镍离子亲和层析一步纯化后的重组EGF纯度达90%,得率为94%。复性后的重组EGF具有促Hela细胞生长活性。结论:以E.coliM15[pREP4]/pQE-40系统表达EGF具有技术路线简单、目的蛋白得率高、成本低等优点,是一种制备活性hEGF的有效手段。 展开更多

关键词 人表皮生长因子 纯化标签 镍离子螯和亲和层析 HELA细胞

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Expression,purification and molecular modeling of iron-containing superoxide dismutase from Acidithiobacillus ferrooxidans 被引量：1

8

作者 刘元东 高建 +5 位作者 邱冠周 刘学端 张成桂 欧阳叙东 蒋莹 曾佳 《中国有色金属学会会刊：英文版》 EI CSCD 2008年第6期1361-1366,共6页

从 Acidithiobacillus ferrooxidans 的 superoxide dismutase (草皮) 可以在它的忍耐起一个重要作用到 bioleaching 的极其有毒、氧化的环境。这基因在 Escherichia 被克隆然后成功地表示了 coli。表示蛋白质被一步舞亲密关系层析最后... 从 Acidithiobacillus ferrooxidans 的 superoxide dismutase (草皮) 可以在它的忍耐起一个重要作用到 bioleaching 的极其有毒、氧化的环境。这基因在 Escherichia 被克隆然后成功地表示了 coli。表示蛋白质被一步舞亲密关系层析最后净化到同质并且观察了根据 SDS 页和 MALDI-TOF-MS 更暗淡。金属内容决心和 recombinant 蛋白质的光系列结果证实蛋白质是包含铁的 superoxide dismutase。为蛋白质的分子的建模表明铁原子被 His26， His75， Asp158 和 His162 绑扎。 展开更多

关键词 超氧歧化酶 基因表达 纯化 分子模型

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树鼩载脂蛋白AV基因的克隆、表达和纯化 被引量：1

9

作者 王艳 李国平 +3 位作者 满永 王抒 涂萍 黎健 《中国动脉硬化杂志》 CAS CSCD 北大核心 2013年第9期775-779,共5页

目的构建树鼩载脂蛋白AV原核表达载体并利用His标签纯化该蛋白。方法从树鼩肝细胞中提取总RNA,经逆转录合成cDNA第一链,以cDNA第一链为模板,扩增载脂蛋白AV基因。PCR扩增产物和pET32a原核表达载体经过双酶切,将纯化回收的酶切产物按适... 目的构建树鼩载脂蛋白AV原核表达载体并利用His标签纯化该蛋白。方法从树鼩肝细胞中提取总RNA,经逆转录合成cDNA第一链,以cDNA第一链为模板,扩增载脂蛋白AV基因。PCR扩增产物和pET32a原核表达载体经过双酶切,将纯化回收的酶切产物按适当的摩尔比通过T4 DNA连接酶16℃连接过夜,连接产物转化大肠杆菌感受态细胞Top10,挑克隆测序。将克隆成功的载脂蛋白AV重组质粒转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3),利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达,并优化诱导条件。表达的载脂蛋白AV经镍离子螯合树脂纯化,采用BCA法分析蛋白浓度,纯度测定采用聚丙烯酰胺凝胶电泳结合薄膜凝胶扫描分析获得。结果挑选的克隆经测序证实载脂蛋白AV基因已经成功连接入pET32a原核表达载体中。在大肠杆菌BL21(DE3)中经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达,有分子量大小约60 kDa的特异性蛋白产生,与预期大小一致。重组蛋白诱导的最佳表达时间为5 h左右,最佳浓度约在20μmol/L。镍离子螯合树脂柱亲和层析获得的纯化蛋白,经过聚丙烯酰胺凝胶电泳后薄膜凝胶扫描分析显示目的蛋白的纯度在95%以上。结论成功构建了载脂蛋白AV的原核表达载体,该蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中实现了高效表达,纯化后的载脂蛋白AV纯度约95%,为进一步研究其结构与功能奠定了基础。 展开更多

关键词 树鼩 载脂蛋白AV 原核表达 蛋白纯化 His标签

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利用新型抗冻蛋白-内含肽标签高效纯化重组蛋白

10

作者 郑延蓉 王从纲 +1 位作者 孙佳明 李宪臻 《大连工业大学学报》 CAS 北大核心 2022年第4期251-255,共5页

利用抗冻蛋白AFP的冰结合特性和Mxe GyrA内含肽的可控自切割特性,构建一种以冰为纯化介质,能够可控自切割的纯化标签。以谷胱甘肽硫转移酶(GST)为对象研究其可行性,采用重叠延伸PCR技术和酶切连接技术构建表达载体pET 24a-GST-Mxe GyrA-... 利用抗冻蛋白AFP的冰结合特性和Mxe GyrA内含肽的可控自切割特性,构建一种以冰为纯化介质,能够可控自切割的纯化标签。以谷胱甘肽硫转移酶(GST)为对象研究其可行性,采用重叠延伸PCR技术和酶切连接技术构建表达载体pET 24a-GST-Mxe GyrA-linker-AFP,在大肠杆菌中成功可溶表达后,利用冰作为吸附介质从细胞破碎上清液中一步分离出融合蛋白GST-Mxe GyrA-linker-AFP。冰融化后,加入终浓度40 mmol/L二硫苏糖醇缓冲液,诱导内含肽N端发生断裂反应形成Mxe GyrA-linker-AFP标签和GST的混合物,再次利用冰吸附去除标签,得到目的蛋白。 展开更多

关键词 亲和色谱 纯化标签 抗冻蛋白 内含肽

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带6个组氨酸尾的可溶性GDNF第1受体的重组表达和活性分析

11

作者 陈立南 孙成三 +4 位作者 陈晴 段德义 杨慧 张进禄 徐群渊 《解剖学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第2期157-160,共4页

目的　用DNA重组方法去除胶质细胞源性神经营养因子 (GDNF)受体 (GFRα 1)基因 3’ 端的与细胞膜糖基化磷脂酰肌醇 (GPI)相连的信号序列 ,使表达的GFRα 1以可溶性形式介导GDNF的作用。　方法　设计一对引物 ,其中下游引物含有 6个组氨... 目的　用DNA重组方法去除胶质细胞源性神经营养因子 (GDNF)受体 (GFRα 1)基因 3’ 端的与细胞膜糖基化磷脂酰肌醇 (GPI)相连的信号序列 ,使表达的GFRα 1以可溶性形式介导GDNF的作用。　方法　设计一对引物 ,其中下游引物含有 6个组氨酸密码子序列 ,以人GFRα 1全长cDNA为模板 ,PCR扩增编码可溶性GFRα 1序列并亚克隆于pBK RSV真核表达载体 ,转染COS 7细胞 ,收获培养上清 ,进行SDS PAGE及Western免疫印迹分析 ;使用钴离子金属螯合层析柱进行纯化 ;检测RET酪氨酸磷酸化以鉴定其生物学活性。　结果　Western免疫印迹证实培养上清液中有分子量为 6 0kD的特异阳性条带 ,与糖基化的GFRα 1分子量相符 ;金属螯合层析得到纯度达90 %以上的重组GFRα 1蛋白 ,每mlCOS 7培养上清中含有 0 5 μg。　结论　带 6个组氨酸尾的重组可溶性GFRα 1能够介导GDNF的作用 。 展开更多

关键词 蛋白纯化 真核表达 受体 表位标记 胶质细胞源性神经营养因子 受体酪氨酸激酶 重组表达

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纯化标签的不同位置对Δ6脂肪酸脱饱和酶异源表达的影响

12

作者 崔洁 陈海琴 +3 位作者 唐鑫 张灏 陈永泉 陈卫 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第8期2607-2618,共12页

【背景】目前利用酵母表达系统已鉴定了多种物种中的Δ6脂肪酸脱饱和酶(FADS6)。由于FADS6是一种具有多个跨膜螺旋的膜蛋白,使得其大量表达和纯化具有挑战性。【目的】探索FADS6的高效表达策略,研究纯化标签添加的位置对高山被孢霉FADS6... 【背景】目前利用酵母表达系统已鉴定了多种物种中的Δ6脂肪酸脱饱和酶(FADS6)。由于FADS6是一种具有多个跨膜螺旋的膜蛋白,使得其大量表达和纯化具有挑战性。【目的】探索FADS6的高效表达策略,研究纯化标签添加的位置对高山被孢霉FADS6I(Ma FADS6I)重组表达效率的影响。【方法】在毕赤酵母表达载体中插入串联亲和标签HRV 3C-Protein A-His,利用改造后的载体构建带有N端或C端标签的Ma FADS6I表达载体;通过电转化获得毕赤酵母重组表达菌株;利用斑点印迹杂交(DotBlot)、聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PolyacrylamideGelElectrophoresis,SDS-PAGE)和免疫印迹(Western Blot)分析重组蛋白的表达水平,并利用气相色谱-质谱(Gas Chromatography-Mass Spectrometry,GC-MS)分析检测Ma FADS6I催化生成的脂肪酸。【结果】通过大量的毕赤酵母转化子筛选,最终获得高效表达Ma FADS6I的毕赤酵母重组菌,证实各转化子的表达具有差异性,Ma FADS6I的C端带有纯化标签较N端更有利于表达。【结论】在Ma FADS6I的C端添加纯化标签比在N端添加更有利于该蛋白在酵母系统中的表达以及底物的转化,为进一步探究FADS6高效表达和结构功能奠定了基础。 展开更多

关键词 Ω-3多不饱和脂肪酸 Δ6脂肪酸脱饱和酶 毕赤酵母表达系统 纯化标签

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应用Profinity eXact标签在真核表达系统中纯化EGFP蛋白 被引量：1

13

作者 李青 张强 +2 位作者 邹丽云 吴玉章 万瑛 《免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第2期144-148,共5页

目的研究Profinity eXact标签在真核蛋白表达系统中的纯化效果。方法通过PCR扩增Profinity eXact标签,构建中间载体pUC18ETagEGFP,构建Profinity eXact标签绿色荧光蛋白真核表达载体FUETagEGFP,采用DNA-磷酸钙方法转染293FT细胞,收集过... 目的研究Profinity eXact标签在真核蛋白表达系统中的纯化效果。方法通过PCR扩增Profinity eXact标签,构建中间载体pUC18ETagEGFP,构建Profinity eXact标签绿色荧光蛋白真核表达载体FUETagEGFP,采用DNA-磷酸钙方法转染293FT细胞,收集过量表达Profinity eXact标签绿色荧光蛋白的细胞,随后提取蛋白进行纯化,采用荧光检测EGFP蛋白结合、纯化效率,最后利用SDS-PAGE检测纯化蛋白的纯度。结果经PCR扩增、酶切和测序,Profinity eXact标签、中间载体pUC18ETagEGFP、Profinity eXact标签真核表达载体构建正确,经荧光显微镜镜下观察Profinity eXact标签真核表达载体转染293FT细胞效果良好,经荧光检测确定EGFP蛋白结合、纯化效率,经SDS-PAGE发现Profinity eXact标签在真核蛋白系统中纯化效果良好。结论 Profinity eXact标签在真核蛋白表达系统中能正常工作,并有较好的纯化效果。 展开更多

关键词 真核表达 亲和纯化 Profinitye Xact tag

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利用分枝杆菌的重组工程系统将TAP标签敲入耻垢分枝杆菌的方法研究 被引量：2

14

作者 赵丽丽 夏强 +1 位作者 赵秀芹 万康林 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第6期539-542,546,共5页

目的利用pJV53质粒编码的分枝杆菌重组工程系统将TAP标签敲入耻垢分枝杆菌基因组。方法将pJV53质粒转入耻垢分枝杆菌,使其表达重组蛋白,制备带有重组蛋白的感受态细胞;从质粒pBS1479中扩增出tap片段,从质粒pSMT3中扩增hyg片段,从耻垢分... 目的利用pJV53质粒编码的分枝杆菌重组工程系统将TAP标签敲入耻垢分枝杆菌基因组。方法将pJV53质粒转入耻垢分枝杆菌,使其表达重组蛋白,制备带有重组蛋白的感受态细胞;从质粒pBS1479中扩增出tap片段,从质粒pSMT3中扩增hyg片段,从耻垢分枝杆菌基因组中分别扩增出aasf基因及其5′端非编码区片段AASF5和aasf基因下游3′端非编码区片段AASF3,利用重叠PCR将以上4个片段拼接在一起,形成最终的敲入片段A5THA3;将构建好的敲入片段转入感受态细胞,使其重组入耻垢分枝杆菌基因组中,PCR和DNA测序鉴定敲入效果。结果重叠PCR技术得到全长为3 200 bp的敲入片段,PCR与DNA测序结果证实带有TAP标签的A5THA3片段已成功敲入耻垢分枝杆菌基因组中。结论成功将TAP标签敲入耻垢分枝杆菌基因组,为下一步进行目的基因功能研究奠定了基础。 展开更多

关键词 重组工程系统 pJV53质粒 串联亲和纯化标签 敲入片段 重叠PCR 耻垢分枝杆菌

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TAP亲和标签选择及其在植物蛋白互作研究中的应用 被引量：1

15

作者 张志飞 赵志丽 文昭竹 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第8期23-27,共5页

串联亲和纯化法(TAP)是一种纯化生理条件下蛋白复合物的技术,已广泛应用于鉴定蛋白相互作用和揭示蛋白复合物互作网络。近年来,随着TAP新型标签的不断出现以及与其他技术的联用,TAP技术正逐渐应用于植物蛋白质互作研究中。综述了TAP亲... 串联亲和纯化法(TAP)是一种纯化生理条件下蛋白复合物的技术,已广泛应用于鉴定蛋白相互作用和揭示蛋白复合物互作网络。近年来,随着TAP新型标签的不断出现以及与其他技术的联用,TAP技术正逐渐应用于植物蛋白质互作研究中。综述了TAP亲和标签选择,并介绍其在植物蛋白互作研究中的成功应用。 展开更多

关键词 串联亲和纯化 亲和标签 植物 蛋白质相互作用

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连接肽对融合蛋白ELP[I]_(30)-linker-eGFP相变的影响 被引量：1

16

作者 张立超 李军明 +2 位作者 葛高顺 孔令岭 胡学军 《生命科学研究》 CAS CSCD 北大核心 2013年第5期401-405,共5页

研究G4S和Poly N连接肽对融合蛋白ELP[I]30-linker-eGFP相变的影响.将编码两种不同连接肽G4S和Poly N的绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,eGFP)基因克隆到pET28-ELP[I]30表达载体中,在宿主菌E.coli BLR(DE3)中经IPTG诱... 研究G4S和Poly N连接肽对融合蛋白ELP[I]30-linker-eGFP相变的影响.将编码两种不同连接肽G4S和Poly N的绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,eGFP)基因克隆到pET28-ELP[I]30表达载体中,在宿主菌E.coli BLR(DE3)中经IPTG诱导表达ELP[I]30-linker-eGFP,通过可逆相变循环(inverse transition cycling,ITC)及镍柱亲和层析纯化ELP[I]30-linker-eGFP蛋白.结果显示,成功构建、表达具有活性的两种连接肽的融合蛋白ELP[I]30-linker-eGFP,连接肽G4S使融合蛋白产生不可逆相变,而Poly N不影响融合蛋白可逆相变,该研究对类弹性蛋白标签的应用具有指导意义. 展开更多

关键词 连接肽 融合蛋白 纯化标签 类弹性蛋白 绿色荧光蛋白

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融合蛋白ELP30-Trx的表达及PEG8000对其相变温度的影响 被引量：1

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作者 张立超 葛高顺 胡学军 《生物技术》 CAS CSCD 北大核心 2013年第5期36-39,共4页

目的:研究不同浓度的PEG8000对融合蛋白ELP30-Trx相变温度的影响。方法:将硫氧还蛋白(Thioredoxin,Trx)基因克隆到pET28-ELP30-Trx表达载体中,经IPTG诱导在宿主菌E.coli BLR(DE3)中表达ELP30-Trx,通过可逆相变循环(Inverse transition c... 目的:研究不同浓度的PEG8000对融合蛋白ELP30-Trx相变温度的影响。方法:将硫氧还蛋白(Thioredoxin,Trx)基因克隆到pET28-ELP30-Trx表达载体中,经IPTG诱导在宿主菌E.coli BLR(DE3)中表达ELP30-Trx,通过可逆相变循环(Inverse transition cycling,ITC)纯化融合蛋白。测量相变温度(T t),并检测不同浓度的PEG8000对ELP30-Trx T t的影响。结果:经酶切及测序鉴定证实成功构建了ELP30-Trx表达载体,经Westen-Blot检测表明成功表达ELP30-Trx融合蛋白。经ITC纯化后的ELP30-Trx纯度可达95%以上。5%、10%、15%、20%的PEG8000(W/V)使终浓度为25μmol/L ELP30-Trx的T t从37.9℃分别降低至34.6℃、28.5℃、14.0℃、6.0℃。结论:成功构建、表达融合蛋白ELP30-Trx,PEG8000能显著降低ELP30-Trx相变温度。通过对类弹性蛋白的研究,为类弹性蛋白的扩大应用提供理论依据。 展开更多

关键词 类弹性蛋白 纯化标签 PEG8000 融合蛋白 硫氧还蛋白

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串联亲和标签LOX蛋白慢病毒表达载体的构建及在乳腺癌细胞中的表达 被引量：1

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作者 刘侠 刘剑仑 +3 位作者 蒋奕 唐玮 杨华伟 韦薇 《现代生物医学进展》 CAS 2015年第29期5613-5616,共4页

目的:为了研究赖氨酰氧化酶(Lysyl Oxidase,LOX)及其相互作用蛋白质在乳腺癌中的功能,构建带StrepⅡ/FLAG串联亲和标签的重组LOX蛋白慢病毒表达载体并在乳腺癌细胞MDA-MB-231中表达。方法:设计引物通过聚合酶链式反应获得带StrepⅡ/FLA... 目的:为了研究赖氨酰氧化酶(Lysyl Oxidase,LOX)及其相互作用蛋白质在乳腺癌中的功能,构建带StrepⅡ/FLAG串联亲和标签的重组LOX蛋白慢病毒表达载体并在乳腺癌细胞MDA-MB-231中表达。方法:设计引物通过聚合酶链式反应获得带StrepⅡ/FLAG串联亲和标签的LOX蛋白(LOX-SF)的亲本质粒,双酶切后鉴定测序克隆至GV303表达载体,连同慢病毒包装质粒共同转染293T得到GV303/LOX-SF慢病毒,将其转染MDA-MB-231细胞,使用荧光定量PCR和蛋白质印迹实验对细胞中重组蛋白LOX-SF进行检测。结果:通过串联亲和纯化获得LOX-SF重组蛋白,使用标签抗体成功鉴定到LOX-SF重组蛋白在MDA-MB-231细胞内稳定表达。结论:GV303/LOX-SF的构建,使带StrepⅡ/FLAG融合标签的LOX蛋白在MDA-MB-231中成功表达及纯化,为筛选和研究LOX及其相互作用蛋白在乳腺癌细胞内的功能奠定了实验基础。 展开更多

关键词 串联亲和纯化 标签 赖氨酰氧化酶 慢病毒载体 相互作用蛋白质

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串联亲和纯化的应用及发展 被引量：1

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作者 闫昭骐 窦岩梅 杜宏武 《生命的化学》 CAS CSCD 北大核心 2009年第4期581-587,共7页

串联亲和纯化(tandem affinity purification,TAP)最早作为一种研究酵母细胞内天然状态下蛋白质相互作用的工具,目前不仅在多个技术领域已成为筛选鉴定新蛋白质复合体的重要工具,并且将成为系统生物学研究的一项关键技术,在探索和绘制... 串联亲和纯化(tandem affinity purification,TAP)最早作为一种研究酵母细胞内天然状态下蛋白质相互作用的工具,目前不仅在多个技术领域已成为筛选鉴定新蛋白质复合体的重要工具,并且将成为系统生物学研究的一项关键技术,在探索和绘制生理条件下多细胞生物蛋白质相互作用网络图谱中发挥主导作用。本文就TAP近些年来的研究进展进行了概括,并对其常见问题与改进策略进行了总结。TAP技术的不断完善,必将使其在蛋白质相互作用领域发挥更重要的作用。 展开更多

关键词 串联亲和纯化 蛋白质复合体 标签

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串联亲和纯化技术及其在植物蛋白质组研究中的应用 被引量：1

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作者 王丰青 吴为人 +3 位作者 陈新建 李娟 周艳 张重义 《生命科学》 CSCD 2013年第6期632-638,共7页

串联亲和纯化(TAP)是一项新颖的蛋白质复合物纯化技术,已被广泛应用于鉴定或验证蛋白质间的相互作用以及建立蛋白质互作网络,其基本原理是,将TAP标签融合到目标蛋白上,然后经过两步亲和纯化,获得融合蛋白及其结构关联蛋白。TAP技术最初... 串联亲和纯化(TAP)是一项新颖的蛋白质复合物纯化技术,已被广泛应用于鉴定或验证蛋白质间的相互作用以及建立蛋白质互作网络,其基本原理是,将TAP标签融合到目标蛋白上,然后经过两步亲和纯化,获得融合蛋白及其结构关联蛋白。TAP技术最初主要在动物和微生物中应用。近几年来,随着新型标签的出现和方法的改进,TAP技术在植物中的应用逐渐增多,为植物蛋白质组学的研究提供了一个有效的手段。简要介绍TAP方法在植物中的应用情况,并对TAP方法应用的限制因素进行分析。 展开更多

关键词 串联亲和纯化 标签 植物 蛋白质组

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