基于CRISPR/Cas13a的新型冠状病毒核酸免扩增可视化快速检测研究

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作者 赵楠 齐永 +12 位作者 李巍 毛颖清 刘文婧 韩一芳 张迩馨 徐应佳 吕瑞辰 蒋宇欣 赖玉珍 李佳萌 沈万鹏 宋悦 李越希 《中华检验医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2024年第6期658-666,共9页

目的基于规律成簇间隔短回文重复序列及其相关蛋白(CRISPR/Cas13a)的特异性识别切割与非特异性的“反式切割”活性,建立易操作、检测限低、特异性好的核酸免扩增可视化快速检测方法—基于CRISPR/Cas13a的新型冠状病毒核酸免扩增快速检... 目的基于规律成簇间隔短回文重复序列及其相关蛋白(CRISPR/Cas13a)的特异性识别切割与非特异性的“反式切割”活性,建立易操作、检测限低、特异性好的核酸免扩增可视化快速检测方法—基于CRISPR/Cas13a的新型冠状病毒核酸免扩增快速检测技术。方法参照新型冠状病毒的基因序列,利用生信技术筛选并设计合成多个新型冠状病毒特异的crRNA(CRISPR RNA),以体外转录的通用ssRNA(单链RNA)靶标建立检测技术并优化检测体系,以新型冠状病毒假病毒核酸标准物来评价方法检测限。收集临床样本,其中阳性样本应包含不同的新型冠状病毒变异株,阴性样本包括其他的常见呼吸道病原体(甲型流感病毒/乙型流感病毒、人类副流感病毒、肺炎克雷伯菌等)临床样本。分别用实时荧光定量PCR(qPCR)、数字PCR及本研究建立的免扩增可视化快速检测技术,对各种样本进行检测,分析评价新建立技术的灵敏度和特异度。采用四格表确切概率法针对荧光定量PCR、数字PCR与本技术检测结果进行统计学分析,采用双侧检验,P<0.01为差异有统计学意义。结果本研究设计合成了10条crRNA,用于基于CRISPR/Cas13a的新型冠状病毒核酸免扩增可视化快速检测技术的建立与优化,本技术可在最短6 min内检出新型冠状病毒的核酸。利用新型冠状病毒假病毒核酸标准物评价该技术的检测限,结果显示仪器辅助下本技术检测限为14拷贝/μl,肉眼下检测限为28拷贝/μl。以qPCR和数字PCR确认的113份临床样本对所建立的检测技术进行敏感度和特异度分析,利用相关公式及SPSS22软件计算分析,该检测技术的敏感度98.5%(66/67),特异度100%(46/46),本研究建立的基于CRISPR/Cas13a的新型冠状病毒免扩增可视化快速检测技术检测结果与金标准qPCR检测结果差异无统计学意义(P=1)。结论本研究成功建立了一种基于CRISPR/Cas13a的新型冠状病毒核� 展开更多

关键词 基因编辑 新型冠状病毒 核酸检测

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基于CRISPR/Cas9技术验证人T淋巴细胞中单等位突变型UNC13D基因脱颗粒功能

2

作者 蔡丽莎 邢源 +2 位作者 黄佩 陈艳 徐晓军 《遵义医科大学学报》 2023年第11期1058-1066,共9页

目的利用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因编辑技术,敲除人T淋巴细胞中编码Munc13-4蛋白的UNC13D基因;并探讨突变型UNC13D基因(c.1232 G>A,p.R411Q)对人T淋巴细胞Munc13-4蛋白和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)脱颗粒功能的影响。方法设计靶向敲... 目的利用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因编辑技术,敲除人T淋巴细胞中编码Munc13-4蛋白的UNC13D基因;并探讨突变型UNC13D基因(c.1232 G>A,p.R411Q)对人T淋巴细胞Munc13-4蛋白和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)脱颗粒功能的影响。方法设计靶向敲除UNC13D基因的sgRNA序列,构建CRISPR/Cas9 UNC13D-sgRNA共表达质粒,筛选出切割效率较高的sgRNA通过第二代慢病毒包装系统包装慢病毒并感染人T淋巴细胞,再将已包装好的野生型以及突变型UNC13D慢病毒感染knockout-UNC13D基因的人T淋巴细胞,以此分为野生型与突变型两组,应用流式细胞术检测两组间的Munc13-4蛋白表达、CTL的脱颗粒功能。结果成功构建出CRISPR/Cas9 UNC13D-sgRNA共表达质粒,CRISPR/Cas9系统成功下调人T淋巴细胞Munc13-4蛋白表达水平;突变型UNC13D基因(c.1232 G>A,p.R411Q)编码的蛋白能够使人CTL脱颗粒功能下降。结论CRISPR/Cas9基因编辑系统成功敲除人T淋巴细胞UNC13D基因,突变型UNC13D基因(c.1232 G>A,p.R411Q)可能为家族性噬血细胞综合征(FHL)的致病性突变位点。 展开更多

关键词 CRISPR/Cas9系统 家族性噬血细胞综合征 基因编辑 UNC13D基因 T淋巴细胞

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HepG2肝癌细胞中p24β1水平对高尔基体结构的影响

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作者 王迪 刘萱 《军事医学》 CAS CSCD 2023年第5期334-340,共7页

目的通过改变人肝癌细胞HepG2中p24β1表达水平,研究该细胞中p24β1表达水平是否对高尔基体产生影响。方法利用RNA干扰实验敲低HepG2细胞中p24β1表达(HepG2-KD),通过Western印迹检测蛋白干扰效率,实时荧光定量PCR(qPCR)验证转录水平;通... 目的通过改变人肝癌细胞HepG2中p24β1表达水平,研究该细胞中p24β1表达水平是否对高尔基体产生影响。方法利用RNA干扰实验敲低HepG2细胞中p24β1表达(HepG2-KD),通过Western印迹检测蛋白干扰效率,实时荧光定量PCR(qPCR)验证转录水平;通过CRISPR/Cas9基因编辑系统构建同源染色体双敲除p24β12基因的HepG2细胞系(HepG2-KO),在基因组测序和Western印迹检测敲除表型后,通过CCK-8实验和克隆形成实验比较HepG2-KO与HepG2的细胞增殖活性;利用细胞免疫荧光实验分析高尔基体标志物α-N-乙酰半乳糖胺残基在细胞中的分布是否受p24β1水平影响。结果RNA干扰后能使HepG2细胞中p24β1基因的表达下调;成功构建了同源染色体双敲除p24β1的HepG2-KO细胞系,其细胞增殖活性较HepG2无明显差异;在HepG2-KD和HepG2-KO细胞中,高尔基体呈弥散分布,并伴随片层状顺式高尔基体形态改变。结论在肝癌细胞HepG2中,p24β1水平对于稳定高尔基体的结构至关重要,提示其对高尔基体功能具有重要调控作用。 展开更多

关键词 p24β1 HEPG2细胞 肝细胞癌 CRISPR/Cas9 RNA干扰 基因编辑 高尔基体

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大肠杆菌必需基因的CRISPR-Cas9敲除策略及高效质粒置换方法

4

作者 刘锦辉 黄建峰 +1 位作者 尤晓颜 张燕飞 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2023年第18期17-23,共7页

由于必需基因的功能必须性使其难以从基因组上被删除,而此前报道的方法存在效率低、非无痕敲除等缺点。基于此,该文建立了一种基于CRISPR/Cas9的基因组必需基因高效无痕敲除方法。以大肠杆菌metK基因(编码S-腺苷甲硫氨酸合酶)为例,首先... 由于必需基因的功能必须性使其难以从基因组上被删除,而此前报道的方法存在效率低、非无痕敲除等缺点。基于此,该文建立了一种基于CRISPR/Cas9的基因组必需基因高效无痕敲除方法。以大肠杆菌metK基因(编码S-腺苷甲硫氨酸合酶)为例,首先将metK基因克隆至质粒pTarget-metK,并采用定点突变方式将metK基因进行同义突变移除对应的PAM序列,构建获得质粒pHL3。进一步构建含有与pHL3相同metK的回补质粒,pCas、pHL3及回补质粒依次转化即可完成基因组必需基因的高效无痕敲除。该方法对必需基因metK编辑时编辑效率可达100%。为了研究必需基因的酶学性质改变对宿主代谢的影响,探索了基于质粒不相容及Flp/FRT系统对回补质粒的置换效率,发现基于Flp/FRT系统可实现回补质粒高效置换。生长测试表明携带metK野生型或是PAM位点突变的metK编辑菌株与野生型菌株在LB培养基和M9培养基中生长无明显差异,而对L-甲硫氨酸亲和力下降MetK突变体则表现明显的生长延滞。 展开更多

关键词 必需基因 CRISPR/Cas9 基因编辑 质粒置换 无痕敲除

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鳞翅目昆虫基因编辑技术研究进展 被引量：4

5

作者 程英 靳明辉 萧玉涛 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第3期18-28,共11页

鳞翅目昆虫种类繁多,遗传多样性极高,通过基因编辑对其基因功能进行研究,解析其遗传及生理生化调控机理是一种高效实用的方法。鳞翅目昆虫基因编辑技术主要有3种:锌指核酸酶(Zinc finger nucleases,ZFNs)技术、转录激活因子样效应蛋白... 鳞翅目昆虫种类繁多,遗传多样性极高,通过基因编辑对其基因功能进行研究,解析其遗传及生理生化调控机理是一种高效实用的方法。鳞翅目昆虫基因编辑技术主要有3种:锌指核酸酶(Zinc finger nucleases,ZFNs)技术、转录激活因子样效应蛋白核酸酶(Transcription activator-like effector nucleases,TALENs)技术和CRISPR/Cas技术,其原理是在基因组特定位点制造DNA双链断裂,从而激活机体自身的DNA损伤修复机制,在此过程中产生插入、删除等多种突变类型。就此3种主要基因编辑技术的原理及应用于重要鳞翅目昆虫如家蚕、斜纹夜蛾、棉铃虫等基因编辑研究进展进行简要综述,为鳞翅目昆虫功能基因组研究、昆虫生理生化、昆虫行为学研究及建立害虫绿色防控体系提供参考。最后,对基因编辑技术在鳞翅目昆虫中的应用现状做简要总结,对建立鳞翅目昆虫适用的基因编辑技术及应用前景进行展望。 展开更多

关键词 锌指核酸酶 转录激活因子样效应蛋白核酸酶 CRISPR/Cas 鳞翅目 基因编辑

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胚胎编辑:论人类基因工程限制 被引量：3

6

作者 余厚宏(译) 《医学与法学》 2021年第6期72-84,共13页

CRISPR使基因编辑比以往任何时候都更经济和有效;但以生殖为目的而进行的胚胎编辑,其收益与潜在风险并存,后者主要涉及个人健康、公共安全以及可能促成的一种新型优生学社会后果上。鉴于该技术存在被滥用的可能且美国缺乏相关管制,政府... CRISPR使基因编辑比以往任何时候都更经济和有效;但以生殖为目的而进行的胚胎编辑,其收益与潜在风险并存,后者主要涉及个人健康、公共安全以及可能促成的一种新型优生学社会后果上。鉴于该技术存在被滥用的可能且美国缺乏相关管制,政府需要采取法律规制和民主协商的方式以防止风险失控;且为实现公共监管与科学进步之平衡,政府须至少确保自由市场不是限制胚胎基因编辑应用的唯一要素。 展开更多

关键词 基因编辑 新型优生学 社会风险 公共监管

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CRISPR/Cas9技术在小麦育种中的应用进展 被引量：3

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作者 曹巧 史占良 +7 位作者 张国丛 班进福 郑树松 傅晓艺 张士昌 何明琦 韩然 高振贤 《生物技术进展》 2021年第6期661-667,共7页

小麦(Triticum aestivum L.)是世界上主要的农作物之一,在粮食安全供应中发挥重要作用。在过去的几十年,由于小麦基因组复杂和遗传转化困难,导致小麦的基础和应用研究落后于其他谷类作物。2014年小麦基因组编辑取得了显著进展,进而促进... 小麦(Triticum aestivum L.)是世界上主要的农作物之一,在粮食安全供应中发挥重要作用。在过去的几十年,由于小麦基因组复杂和遗传转化困难,导致小麦的基础和应用研究落后于其他谷类作物。2014年小麦基因组编辑取得了显著进展,进而促进了小麦生物技术的发展。综述了CRISPR/Cas9技术在小麦育种中的研究进展,简单介绍了CRISPR/Cas9基因编辑技术的发现、原理和优缺点,指出小麦基因编辑过程中农杆菌介导的遗传转化较粒子轰击法可降低转基因沉默频率,未来将成为基因编辑过程中主流的遗传转化方式;优化sgRNA的启动子、选择同源保守序列做为靶点可以提高基因编辑效率;新开发的碱基编辑器和prime editor需引入更多突变类型。展望了进一步提高小麦基因编辑效率和安全性的可行性,以期为未来小麦育种工作提供参考。 展开更多

关键词 小麦育种 基因编辑 CRISPR/Cas9

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利用CRISPR/Cas9技术有效沉默菊花DgGA20ox基因 被引量：3

8

作者 李翠 郝福顺 孙立荣 《河南科技学院学报（自然科学版）》 2018年第5期22-26,共5页

以菊花品种神马"Sma"为材料,利用CRISPR/Cas9技术编辑其赤霉素合成关键酶GA20氧化酶基因DgGA20ox.采用农杆菌介导的遗传转化方法,成功获得了沉默DgGA20ox菊花转基因植株.与对照相比,转基因植株变得矮小,茎节间显著缩短.测序... 以菊花品种神马"Sma"为材料,利用CRISPR/Cas9技术编辑其赤霉素合成关键酶GA20氧化酶基因DgGA20ox.采用农杆菌介导的遗传转化方法,成功获得了沉默DgGA20ox菊花转基因植株.与对照相比,转基因植株变得矮小,茎节间显著缩短.测序结果显示,DgGA20ox基因发生了移码突变,说明利用CRISPR/Cas9技术能有效沉默菊花基因,这为开展菊花的基因工程研究奠定了基础. 展开更多

关键词 菊花 CRISPR/Cas9 基因编辑 DgGA20ox

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合作网络视角下的基因编辑领域科研团队识别及产出绩效测度 被引量：2

9

作者 王菲菲 陈晓璇 杨辰毓妍 《中州大学学报》 2018年第3期75-80,共6页

基因编辑是近年来生物学界热点话题,科研合作对于共享信息、传播知识具有重要意义。文章旨在通过综合利用社会网络分析、作者合作发文共现分析、网络指标与产出绩效相关分析等方法对基因编辑领域的核心科研团队进行识别,并实现团队合作... 基因编辑是近年来生物学界热点话题,科研合作对于共享信息、传播知识具有重要意义。文章旨在通过综合利用社会网络分析、作者合作发文共现分析、网络指标与产出绩效相关分析等方法对基因编辑领域的核心科研团队进行识别,并实现团队合作模式发现与产出绩效测度。结果显示,桥梁型团队合作模式,可将不同专业特长的众多小团体结合在一起,有利于激发团队成员的创造性,相比三角型和网架型合作模式,在基因编辑这一特定领域下的团队产出绩效更高。 展开更多

关键词 合作模式 基因编辑 社会网络分析方法

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利用CRISPR/Cas9系统构建HepG2细胞THRAP3基因敲除细胞系 被引量：2

10

作者 王丹丹 胡勇 +4 位作者 方毅 韩秀晶 刘曜宁 靳彦文 曹诚 《军事医学》 CAS 2021年第7期493-499,共7页

目的使用CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除人类肝癌细胞HepG2中的甲状腺激素受体相关蛋白3(THRAP3)基因,构建THRAP3基因敲除细胞系。方法根据CRISPR/Cas9靶点设计规则,设计特异性靶向THRAP3基因第3个外显子相关序列的多条小向导RNA,通过T7... 目的使用CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除人类肝癌细胞HepG2中的甲状腺激素受体相关蛋白3(THRAP3)基因,构建THRAP3基因敲除细胞系。方法根据CRISPR/Cas9靶点设计规则,设计特异性靶向THRAP3基因第3个外显子相关序列的多条小向导RNA,通过T7核酸内切酶筛选出切割效率最高的载体,构建pSpCas9-THRAP3真核重组表达质粒。测序鉴定后,将重组质粒转染至HepG2细胞中,用嘌呤霉素(puromycin)抗性筛选细胞株,挑取单克隆,再用PCR、测序等方法鉴定细胞基因型,免疫印迹方法鉴定细胞THRAP3敲除效果。使用高通量测序的方法进行基因表达分析。用流式细胞仪检测基因敲除对细胞周期的影响,CCK-8试剂盒检测细胞增殖。结果成功构建pSpCas9-THRAP3真核重组表达质粒,筛选出特异性敲除THRAP3基因的细胞系,验证了THRAP3敲除对细胞周期以及细胞增殖的影响。结论利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功构建并获得了THRAP3基因敲除细胞系并初步探究了THRAP3基因功能。 展开更多

关键词 CRISPR/Cas9 甲状腺激素受体相关蛋白3 HEPG2细胞 基因编辑

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基因编辑技术在水产生物中的研究进展 被引量：1

11

作者 王峰 李忠 苗贵东 《兴义民族师范学院学报》 2018年第3期112-121,共10页

基因编辑技术(Gene Editing)能够让人类对目标基因进行"编辑",实现对特定DNA片段的敲除、敲入等操作。目前基因编辑技术主要有RNA干扰(RNAi)、锌指核酸酶(ZFNs)、转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)和成簇的规律性间隔的短回... 基因编辑技术(Gene Editing)能够让人类对目标基因进行"编辑",实现对特定DNA片段的敲除、敲入等操作。目前基因编辑技术主要有RNA干扰(RNAi)、锌指核酸酶(ZFNs)、转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)和成簇的规律性间隔的短回文重复序列(CRISPR)等,基因编辑技术已经被广泛应用在线虫、果蝇、拟南芥、小鼠和斑马鱼等模式生物的基因组学、遗传发育、基因功能研究中。随着水产生物全基因组测序工作的开展,水产生物后基因组时代到来,基因编辑技术在水产生物领域应用得到较快发展,文章从基因编辑技术原理、技术发展和基因编辑技术在水产生物基因功能、遗传发育、性别调控及基因调控等方面研究进行综述、进而对基因编辑技术在水产生物中的研究前景进行了展望,旨在为更好地开展水产生物的基因功能和基因调控网络研究提供参考。 展开更多

关键词 水产生物 基因编辑 RNA干扰 人工核酸酶技术 研究进展

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基于新的CRISPR/Cas9技术实现斑马鱼LHX9基因的快速编辑及对F0突变体性腺发育的初筛

12

作者 王楠 朱惠 +5 位作者 朱文娇 张昌润 沈也雷 董梅 宋怀东 乔洁 《现代生物医学进展》 CAS 2020年第1期14-18,共5页

目的:CRISPR/Cas9系统在斑马鱼的反向遗传学中的到了广泛应用,但突变基因的表型观察往往需要在突变鱼系的F1中进行,费时较长。LHX9作为LIM家族的一种转录因子,在胚胎早期的泌尿生殖嵴中有广泛分布;且LHX9基因敲除的小鼠存在性腺发育不... 目的:CRISPR/Cas9系统在斑马鱼的反向遗传学中的到了广泛应用,但突变基因的表型观察往往需要在突变鱼系的F1中进行,费时较长。LHX9作为LIM家族的一种转录因子,在胚胎早期的泌尿生殖嵴中有广泛分布;且LHX9基因敲除的小鼠存在性腺发育不良。本研究拟通过一种新的CRISPR/Cas9基因编辑技术,采用四条sgRNA对LHX9基因进行VASA转基因斑马鱼的基因敲除,以观察该基因缺陷对斑马鱼性腺发育的影响。方法:利用新的CRISPR/Cas9技术,设计四条针对斑马鱼LHX9基因3号外显子的20bp的sgRNA,通过非克隆体外转录得到靶位点的四条sgRNA。将以上靶位点的四条sgRNA与Cas9核酸酶蛋白同时注射入单细胞期的斑马鱼胚胎内,利用PCR鉴定突变型类型和突变比例。通过对LHX9基因突变体的VASA转基因斑马鱼进行荧光观察,发现LHX9基因缺陷的斑马鱼性腺发育的情况。结果:靶向Exon 3的四条sgRNA可成功编辑斑马鱼LHX9基因,敲除效率高达82%,Sanger测序发现产生10种不同的移码突变类型。通过该方法对VASA转基因斑马鱼的LHX9基因进行编辑,发现LHX9基因突变导致dph6的的斑马鱼原始生殖细胞增殖和迁移受到影响。结论:基于4条sgRNA注射的CRISPR/Cas9技术,可以快速地产生具有突变表型的G0斑马鱼,具有应用潜力。LHX9基因敲除导致原始生殖细胞的发育和迁移受到影响,提示该基因参与了斑马鱼早期性腺的发育。 展开更多

关键词 CRISPR/Cas9 LHX9 斑马鱼 基因编辑

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基于基因编辑技术创制高亚油酸水稻材料

13

作者 陈晓军 吴凯伸 +3 位作者 惠建 白海波 马斯霜 李靖宇 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2021年第14期2931-2940,共10页

【目的】亚油酸是一种人体必需的脂肪酸,能加快体内脂肪代谢与分解、减少胆固醇在血管壁上形成积存、有效预防动脉硬化的发生、提高人体免疫力、促进骨骼发育、提高记忆力、预防脑部功能退化等功能。利用基因编辑技术对控制脂肪酸合成... 【目的】亚油酸是一种人体必需的脂肪酸,能加快体内脂肪代谢与分解、减少胆固醇在血管壁上形成积存、有效预防动脉硬化的发生、提高人体免疫力、促进骨骼发育、提高记忆力、预防脑部功能退化等功能。利用基因编辑技术对控制脂肪酸合成途径的关键酶ω-3脂肪酸去饱和酶基因进行精准编辑,关闭下游产物的合成途径,以便提高水稻上游亚油酸的含量,为创制富集亚油酸水稻材料提供依据。【方法】水稻脂肪酸合成途径中的关键酶ω-3脂肪酸去饱和酶基因(OsFAD3)存在2个拷贝,分别分布在第11和第12染色体,且两者cDNA同源性达97.32%。根据基因编辑原理(编辑的特异性取决于引导RNA(gRNA)的特性),在2个同源基因序列高度一致的外显子区域,分别设计合成2个gRNA,并分别构建植物基因编辑载体,利用农杆菌介导法转化本地受体材料(富源4号)。通过对基因编辑植株进行靶位点测序鉴定,分析2个位点的编辑效率和基因型。同时,对OsFAD3双突变体进行粒宽、粒长等主要籽粒农艺性状分析。采用气质联用检测法测量OsFAD3双突变体籽粒的37种脂肪酸含量。【结果】获得2个位点的纯合编辑材料,同时也获得了其他不同基因型组合的编辑材料;与对照材料相比,OsFAD3双突变体的粒宽、粒长等主要籽粒农艺性状均没有发生显著变化,但稻谷中亚油酸的相对含量提高了3.36个百分点。【结论】在不改变籽粒主要农艺性状的前提下,实现了利用基因编辑技术通过转化一个载体同时精准敲除2个ω-3脂肪酸去饱和酶基因,提高了籽粒中亚油酸的相对含量。 展开更多

关键词 水稻 基因编辑 高亚油酸 米糠油

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基于融合网络的学术创新社区发现研究——以基因编辑研究领域为例

14

作者 赵浚吟 杨辰毓妍 《图书情报导刊》 2019年第9期37-44,共8页

科研合作对于共享信息、传播知识具有重要意义。通过综合利用社会网络分析、作者合作发文共现分析等方法,多角度观察了基因编辑研究者的合作情况,选取了融合前的关系网络(作者合作网络)、认知网络(作者-关键词耦合网络)以及融合后的多... 科研合作对于共享信息、传播知识具有重要意义。通过综合利用社会网络分析、作者合作发文共现分析等方法,多角度观察了基因编辑研究者的合作情况,选取了融合前的关系网络(作者合作网络)、认知网络(作者-关键词耦合网络)以及融合后的多关系异构网络进行社区划分和交叉比对。结果显示,多关系异构网络可以选择性地保留原本单关系网络中一些社区较孤立的特性,还能测度出单关系网络中难以反映出的某些研究者之间较大的合作空间,减少社区内耗,提高学术研究效率。 展开更多

关键词 融合网络 基因编辑 学术社区

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香蕉枯萎病菌内源报告基因Foc4carS的鉴定及其应用

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作者 彭军 曾凡云 +5 位作者 王艳玮 漆艳香 丁兆建 王少伶 谢艺贤 张欣 《热带作物学报》 CSCD 北大核心 2024年第5期873-885,共13页

香蕉枯萎病是由尖孢镰刀菌古巴转化型(Fusarium oxysporum f. sp. cubense, Foc)引起的香蕉毁灭性土传病害,其中4号生理小种(Foc4)能感染几乎所有的香蕉品系,危害最严重。carS基因通过调控下游car结构基因参与调控镰刀菌类胡萝卜素的生... 香蕉枯萎病是由尖孢镰刀菌古巴转化型(Fusarium oxysporum f. sp. cubense, Foc)引起的香蕉毁灭性土传病害,其中4号生理小种(Foc4)能感染几乎所有的香蕉品系,危害最严重。carS基因通过调控下游car结构基因参与调控镰刀菌类胡萝卜素的生物合成,本研究克隆鉴定了Foc4carS基因(FOIG_05085),Foc4carS蛋白具有典型的RING-finger蛋白结构域。利用分割标记法(Split-marker PCR)获得Foc4carS基因的融合片段,同时构建含有Foc4carS基因sgRNA591序列的pUC-fFuCas9-HTBNLS-hph-Foc4carS基因编辑载体,通过PEG介导的原生质体转化获得该基因的敲除突变体、回补突变体以及基因编辑敲除体,并对敲除和回补突变体的生物学特性和致病力进行分析。结果显示:ΔFoc4carS突变体的菌落直径、产孢量和致病力等生物学表型与野生菌株Foc4无显著差异,而ΔFoc4carS突变体菌落颜色呈深橙色,Foc4carS基因的缺失影响了次生代谢产物类胡萝卜素的生物合成;基因编辑的ΔFoc4carS(HDR)突变体不论是再生筛选板还是继代后的PDA平板,其菌落均出现典型的深橙色,表明Foc4carS可作为内源报告基因,在香蕉枯萎菌Foc4中进行基因质粒型CRISPR/Cas9编辑可行。 展开更多

关键词 香蕉枯萎菌Foc4 Foc4carS基因 类胡萝卜素 基因敲除 CRISPR/Cas9基因编辑

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