节球藻毒素-R(nodularin-R,NOD-R)是具有强烈肝毒性的蓝藻毒素。然而,现有的NOD-R检测技术均存在一定的局限性,亟待开发一种新的检测方法。本文利用指数富集的配基系统进化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,...节球藻毒素-R(nodularin-R,NOD-R)是具有强烈肝毒性的蓝藻毒素。然而,现有的NOD-R检测技术均存在一定的局限性,亟待开发一种新的检测方法。本文利用指数富集的配基系统进化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)技术结合高通量测序(HTSELEX),筛选出NOD-R特异的高亲和力适配体。生物膜干涉(biolayer interferometry,BLI)技术对适配体的鉴定结果表明,适配体H62与NOD-R之间的亲和力最高,达到了168 n M。而且,该适配体不与其他毒素结合,具有较高的特异性。以上结果表明,适配体H62有望作为NOD-R检测新方法——适配体生物传感器的分子识别元件。展开更多
现有血清学方法不能实现过敏原表位肽段与IgE结合能力的定量检测和实时动态观察,生物膜干涉(biolayer interferometry,BLI)技术有望弥补这一缺点。本研究选取花生过敏原Ara h 2的一个表位肽及其点突变体为检测对象,利用生物素标记的羊抗...现有血清学方法不能实现过敏原表位肽段与IgE结合能力的定量检测和实时动态观察,生物膜干涉(biolayer interferometry,BLI)技术有望弥补这一缺点。本研究选取花生过敏原Ara h 2的一个表位肽及其点突变体为检测对象,利用生物素标记的羊抗人IgE抗体偶联亲和素标记的生物传感器,特异性结合花生过敏患者血清IgE后,再监测花生过敏原表位肽及其突变体与IgE结合和解离的过程,并计算亲和力常数,评价它们的IgE结合能力。结果显示,表位肽及其突变体与花生过敏患者IgE的亲和力常数介于2.04×10-4到2.11之间。关键氨基酸的突变对亲和力常数影响较大,将过敏原表位肽中的34Q突变34N,38E突变为38D后,其IgE结合能力降低为1/2366。这说明BLI技术可以检测过敏原表位肽与IgE的结合能力,关键氨基酸分子量的减小或疏水性的增加,有望降低过敏原肽段的IgE结合能力。展开更多
文摘目的以革兰阴性菌外膜蛋白折叠辅助因子关键蛋白BamA为靶蛋白,基于生物膜干涉(Biolayer interferometry,BLI)技术建立化合物与BamA蛋白β折叠结构域(BamA_(β-barrel))结合活性的评价方法,为建立靶向BamA蛋白的抗革兰阴性菌先导物奠定基础。方法应用BLI方法检测BamA_(β-barrel)与已知的阳性化合物darobactin的结合活性。原核表达并纯化带有His标签的大肠埃希菌BamA_(β-barrel)蛋白,使用表面活性剂LDAO对其进行复性和折叠;使用生物素标记折叠和未折叠蛋白,并结合到超级链霉亲和素(super streptavidin,SSA)生物传感器,然后检测蛋白与不同浓度的darobactin结合信号的变化,同时做无蛋白或darobactin稀释液对照;空白对照采用未结合生物素化的BamA_(β-barrel)蛋白的传感器,检测上述系列稀释样品。相应信号采用Steady state analysis方式拟合分析,计算平衡常数(KD)值。结果成功获得高纯度的折叠状态BamA_(β-barrel)蛋白,通过BLI技术检测到折叠状态的BamA_(β-barrel)与阳性化合物darobactin具有良好结合活性且呈现浓度依赖性,R^(2)为0.9998,KD值为(2.2E-06±8.0E-08)M。结论基于BLI技术成功建立了折叠状态的BamA_(β-barrel)-化合物结合活性的评价方法,为后续BamA蛋白靶向性抗革兰阴性菌抗生素的发现建立基础。
文摘节球藻毒素-R(nodularin-R,NOD-R)是具有强烈肝毒性的蓝藻毒素。然而,现有的NOD-R检测技术均存在一定的局限性,亟待开发一种新的检测方法。本文利用指数富集的配基系统进化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)技术结合高通量测序(HTSELEX),筛选出NOD-R特异的高亲和力适配体。生物膜干涉(biolayer interferometry,BLI)技术对适配体的鉴定结果表明,适配体H62与NOD-R之间的亲和力最高,达到了168 n M。而且,该适配体不与其他毒素结合,具有较高的特异性。以上结果表明,适配体H62有望作为NOD-R检测新方法——适配体生物传感器的分子识别元件。
文摘现有血清学方法不能实现过敏原表位肽段与IgE结合能力的定量检测和实时动态观察,生物膜干涉(biolayer interferometry,BLI)技术有望弥补这一缺点。本研究选取花生过敏原Ara h 2的一个表位肽及其点突变体为检测对象,利用生物素标记的羊抗人IgE抗体偶联亲和素标记的生物传感器,特异性结合花生过敏患者血清IgE后,再监测花生过敏原表位肽及其突变体与IgE结合和解离的过程,并计算亲和力常数,评价它们的IgE结合能力。结果显示,表位肽及其突变体与花生过敏患者IgE的亲和力常数介于2.04×10-4到2.11之间。关键氨基酸的突变对亲和力常数影响较大,将过敏原表位肽中的34Q突变34N,38E突变为38D后,其IgE结合能力降低为1/2366。这说明BLI技术可以检测过敏原表位肽与IgE的结合能力,关键氨基酸分子量的减小或疏水性的增加,有望降低过敏原肽段的IgE结合能力。
