目的探讨定量PCR中三种荧光染料SYBR GreenⅠ、LC Green PLUS、EvaGreen定量效果的差异。方法以三个样品基因组DNA为模板,应用巢氏PCR法先扩增G6PDH大片段,纯化回收产物,定量,并分别以10倍、5倍和2倍倍比稀释,作为定量PCR制作标准曲线...目的探讨定量PCR中三种荧光染料SYBR GreenⅠ、LC Green PLUS、EvaGreen定量效果的差异。方法以三个样品基因组DNA为模板,应用巢氏PCR法先扩增G6PDH大片段,纯化回收产物,定量,并分别以10倍、5倍和2倍倍比稀释,作为定量PCR制作标准曲线的模板。应用real-time PCR仪指定试剂盒检测模板质量,再分别以含有相同Taq酶并分别含有SYBR GreenⅠ、LC Green PLUS、EvaGreen染料的试剂进行小片段定量PCR扩增,每个浓度3复孔。标准曲线拟合,结果分析用仪器自带分析软件完成。结果应用三种荧光染料获得的标准曲线回归系数≥0.98（除1个样品为0.97）,10倍、5倍梯度稀释标准曲线PCR效率为0.8~1.0,2倍稀释标准曲线PCR效率应用SYBR GreenⅠ有2/3样品〉1.2,而后两种染料为0.9~1.2。应用SYBR GreenⅠ较另两种染料的标准曲线误差较大,且样品间分散度也较大。结论在定量PCR中饱和染料LC Green PLUS、EvaGreen的定量效果好于SYBR GreenⅠ。展开更多
为建立灵敏、可靠的食品中鸭源性成分鉴定方法,确定了一对可特异地检测出牛肉中所掺杂鸭肉成分的引物,建立了SYBR Green Ⅰ实时PCR技术检测鸭肉的方法。结果表明:利用SYBR Green Ⅰ实时PCR技术可检测到鸭肉DNA,通过熔解曲线能有效地区...为建立灵敏、可靠的食品中鸭源性成分鉴定方法,确定了一对可特异地检测出牛肉中所掺杂鸭肉成分的引物,建立了SYBR Green Ⅰ实时PCR技术检测鸭肉的方法。结果表明:利用SYBR Green Ⅰ实时PCR技术可检测到鸭肉DNA,通过熔解曲线能有效地区分特异性产物,检测灵敏度可达到1pg DNA。同时利用该方法可检测出熟牛肉、鸭肉混合样品中的鸭肉成分。SYBR Green Ⅰ实时PCR方法能快速、特异、灵敏的检测鸭肉成分。展开更多
【目的】建立一种检测牛分枝杆菌的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR,为防控牛结核病提供技术支持。【方法】根据牛分枝杆菌特异性基因序列(No.MBU87961,gi9954088)设计合成一对扩增牛分枝杆菌的特异性引物,从引物设计、各成分配比、样品采...【目的】建立一种检测牛分枝杆菌的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR,为防控牛结核病提供技术支持。【方法】根据牛分枝杆菌特异性基因序列(No.MBU87961,gi9954088)设计合成一对扩增牛分枝杆菌的特异性引物,从引物设计、各成分配比、样品采集及样品DNA提取等方面进行优化,并对建立的方法进行标准曲线、溶解曲线分析及特异性、敏感性、重复性、临床样品检验试验。【结果】牛分枝杆菌SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR的检测模板范围为1.0×109～1.0×10拷贝/μL时,其标准曲线呈良好的线性关系,溶解曲线表现为单一波峰,Tm值为86.48～86.65℃。SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR的牛型分枝杆菌扩增结果为阳性,其他参试菌株均为阴性;可检测出10拷贝/μL的牛分枝杆菌DNA,敏感性是常规PCR的100倍;Ct值变异系数小于5%,重复性好;对50份PPD检测为阳性的牛鼻黏液、牛奶和淋巴结进行检测,其结果与常规PCR检测结果一致。【结论】建立的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR具有快速、便捷、准确等优点,适合于牛分枝杆菌的鉴别诊断。展开更多
目的建立SYBR Green Real-time PCR检测和筛选黄病毒属病毒方法。方法参照文献报道的通用引物,以JEV cDNA和DEN cDNA为模板,建立RT-PCR和SYBR Green Real-time PCR,检测和筛选黄病毒属病毒,并比较两者的敏感性。结果此黄病毒属引物适合...目的建立SYBR Green Real-time PCR检测和筛选黄病毒属病毒方法。方法参照文献报道的通用引物,以JEV cDNA和DEN cDNA为模板,建立RT-PCR和SYBR Green Real-time PCR,检测和筛选黄病毒属病毒,并比较两者的敏感性。结果此黄病毒属引物适合两种反应体系,SYBR Green Real-time PCR方法的敏感性是RT-PCR方法的100倍,最低检出病毒浓度为0.5×10-2PFU/ml。结论建立的两种方法均可用于黄病毒属病毒检测,以SYBR Green Real-time PCR方法具有更高的敏感性,对于黄病毒属病毒初筛检测具有应用价值。展开更多
文摘目的探讨定量PCR中三种荧光染料SYBR GreenⅠ、LC Green PLUS、EvaGreen定量效果的差异。方法以三个样品基因组DNA为模板,应用巢氏PCR法先扩增G6PDH大片段,纯化回收产物,定量,并分别以10倍、5倍和2倍倍比稀释,作为定量PCR制作标准曲线的模板。应用real-time PCR仪指定试剂盒检测模板质量,再分别以含有相同Taq酶并分别含有SYBR GreenⅠ、LC Green PLUS、EvaGreen染料的试剂进行小片段定量PCR扩增,每个浓度3复孔。标准曲线拟合,结果分析用仪器自带分析软件完成。结果应用三种荧光染料获得的标准曲线回归系数≥0.98（除1个样品为0.97）,10倍、5倍梯度稀释标准曲线PCR效率为0.8~1.0,2倍稀释标准曲线PCR效率应用SYBR GreenⅠ有2/3样品〉1.2,而后两种染料为0.9~1.2。应用SYBR GreenⅠ较另两种染料的标准曲线误差较大,且样品间分散度也较大。结论在定量PCR中饱和染料LC Green PLUS、EvaGreen的定量效果好于SYBR GreenⅠ。
文摘为建立灵敏、可靠的食品中鸭源性成分鉴定方法,确定了一对可特异地检测出牛肉中所掺杂鸭肉成分的引物,建立了SYBR Green Ⅰ实时PCR技术检测鸭肉的方法。结果表明:利用SYBR Green Ⅰ实时PCR技术可检测到鸭肉DNA,通过熔解曲线能有效地区分特异性产物,检测灵敏度可达到1pg DNA。同时利用该方法可检测出熟牛肉、鸭肉混合样品中的鸭肉成分。SYBR Green Ⅰ实时PCR方法能快速、特异、灵敏的检测鸭肉成分。
文摘【目的】建立一种检测牛分枝杆菌的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR,为防控牛结核病提供技术支持。【方法】根据牛分枝杆菌特异性基因序列(No.MBU87961,gi9954088)设计合成一对扩增牛分枝杆菌的特异性引物,从引物设计、各成分配比、样品采集及样品DNA提取等方面进行优化,并对建立的方法进行标准曲线、溶解曲线分析及特异性、敏感性、重复性、临床样品检验试验。【结果】牛分枝杆菌SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR的检测模板范围为1.0×109～1.0×10拷贝/μL时,其标准曲线呈良好的线性关系,溶解曲线表现为单一波峰,Tm值为86.48～86.65℃。SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR的牛型分枝杆菌扩增结果为阳性,其他参试菌株均为阴性;可检测出10拷贝/μL的牛分枝杆菌DNA,敏感性是常规PCR的100倍;Ct值变异系数小于5%,重复性好;对50份PPD检测为阳性的牛鼻黏液、牛奶和淋巴结进行检测,其结果与常规PCR检测结果一致。【结论】建立的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR具有快速、便捷、准确等优点,适合于牛分枝杆菌的鉴别诊断。
文摘目的建立SYBR Green Real-time PCR检测和筛选黄病毒属病毒方法。方法参照文献报道的通用引物,以JEV cDNA和DEN cDNA为模板,建立RT-PCR和SYBR Green Real-time PCR,检测和筛选黄病毒属病毒,并比较两者的敏感性。结果此黄病毒属引物适合两种反应体系,SYBR Green Real-time PCR方法的敏感性是RT-PCR方法的100倍,最低检出病毒浓度为0.5×10-2PFU/ml。结论建立的两种方法均可用于黄病毒属病毒检测,以SYBR Green Real-time PCR方法具有更高的敏感性,对于黄病毒属病毒初筛检测具有应用价值。
