刚地弓形虫ROP18基因的克隆及生物信息学分析 被引量：21

1

作者 郭玲玲 张晓磊 +5 位作者 张进顺 贾晓晖 姜文静 王春苗 刘楠 朱晓波 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2015年第5期414-419,共6页

目的对刚地弓形虫RH株的棒状体蛋白18(TgROP18)基因进行克隆,同时采用生物信息学分析TgROP18蛋白序列。方法提取刚地弓形虫RH株速殖子总RNA,根据TgROP18基因(GenBank登陆号为AM075204)的开放阅读框设计引物,采用逆转录PCR(RT-PCR)扩增RO... 目的对刚地弓形虫RH株的棒状体蛋白18(TgROP18)基因进行克隆,同时采用生物信息学分析TgROP18蛋白序列。方法提取刚地弓形虫RH株速殖子总RNA,根据TgROP18基因(GenBank登陆号为AM075204)的开放阅读框设计引物,采用逆转录PCR(RT-PCR)扩增ROP18基因,并对其产物进行测序;采用在线生物软件预测TgROP18蛋白的结构与功能。结果 TgROP18基因RT-PCR扩增产物与预期一致,大小为1 665bp;测序分析显示,ROP18基因序列与GenBank上已发表的序列完全一致。TgROP18蛋白含有554个氨基酸,分子式为C2753H4405N801O811S20,分子质量单位为62.34ku,理论等电点为9.34;在TgROP18蛋白的二级结构中,α-螺旋、β-折、β-转角、无规则卷曲所占比例分别为41.52%、19.13%、7.76%和31.59%;TgROP18蛋白含有10个亲水性较高的区域(临界值为2.0),28个表面可及性较高的区域(临界值为1.9),10个保守结构区域,7个翻译后修饰位点,21个B细胞抗原表位,21个CTL抗原表位及26个Th抗原表位有。结论生物信息学分析表明,TgROP18蛋白具有良好的免疫原性,这将为弓形虫疫苗的研究提供基础资料。 展开更多

关键词 刚地弓形虫 rop18 克隆 真核表达质粒 生物信息学分析

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弓形虫ROP18基因原核表达载体的构建及表达 被引量：10

2

作者 赵焕阁 韦祎 +3 位作者 黄用豪 梁丽娟 林映莹 谭光宏 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2013年第6期527-529,534,共4页

目的采用PCR方法从刚地弓形虫RH株基因组DNA中扩增弓形虫ROP18基因,构建原核表达载体pET-ROP18,并检测融合蛋白ROP18的免疫反应原性。方法采用PCR技术扩增弓形虫ROP18基因,将其插入原核表达载体pET-28a中,构建原核表达质粒pET-ROP18,PC... 目的采用PCR方法从刚地弓形虫RH株基因组DNA中扩增弓形虫ROP18基因,构建原核表达载体pET-ROP18,并检测融合蛋白ROP18的免疫反应原性。方法采用PCR技术扩增弓形虫ROP18基因,将其插入原核表达载体pET-28a中,构建原核表达质粒pET-ROP18,PCR和双酶切鉴定正确的重组质粒pET-ROP18转入大肠埃希菌BL21中,在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导下表达融合蛋白,诱导产物裂解后进行SDS-PAGE电泳,观察重组蛋白的诱导表达情况,Western blot分析重组蛋白的反应原性。结果以弓形虫基因组DNA为模板,PCR扩增出约1.6kb的ROP18基因片段。将其定向插入原核表达载体pET-28a,构建原核表达质粒pET-ROP18,经PCR和双酶切鉴定后测序,显示重组质粒包含ROP18蛋白基因读码框内的完整序列,能完整表达ROP18抗原蛋白。重组质粒转化菌经IPTG诱导后表达分子质量单位约63ku的融合蛋白,以37℃1mmol/L IPTG诱导4h表达量最大。Western blot分析重组蛋白能被鼠抗弓形虫血清识别。结论成功构建了原核表达载pET-ROP18,重组蛋白ROP18具有免疫反应原性。 展开更多

关键词 弓形虫 rop18 原核表达

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刚地弓形虫强毒株棒状蛋白ROP18的克隆、表达和免疫反应性分析 被引量：10

3

作者 张颖 张进顺 +3 位作者 贾晓辉 贾天军 卢致民 周芳 《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第6期446-449,共4页

目的克隆、表达刚地弓形虫棒状体蛋白ROP18基因(TgROP18),并分析其免疫反应性。方法提取刚地弓形虫RH株基因组DNA,PCR扩增TgROP18基因。扩增产物经双酶切后连接入原核表达载体pET30a(+),重组质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3),阳性菌落加入... 目的克隆、表达刚地弓形虫棒状体蛋白ROP18基因(TgROP18),并分析其免疫反应性。方法提取刚地弓形虫RH株基因组DNA,PCR扩增TgROP18基因。扩增产物经双酶切后连接入原核表达载体pET30a(+),重组质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3),阳性菌落加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析重组蛋白TgROP18的表达情况。以鼠抗弓形虫血清为一抗,蛋白质印迹(Western blot-ting)分析该重组蛋白的免疫反应性。结果 PCR扩增获得TgROP18基因,长约1 665 bp,编码554个氨基酸,其中前47个氨基酸构成信号肽序列。菌落PCR、双酶切和测序结果显示,重组质粒pET30a(+)-TgROP18构建成功。SDS-PAGE结果显示,经IPTG诱导获得相对分子质量(Mr)为59 800的可溶性重组蛋白TgROP18。Western blotting分析结果显示,该重组蛋白可被鼠抗刚地弓形虫的血清识别。结论重组蛋白TgROP18具有一定的免疫反应性。 展开更多

关键词 刚地弓形虫 rop18 原核表达

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弓形虫ROPs DNA疫苗对小鼠急性感染弓形虫的免疫保护作用

4

作者 杜荣起 李丹若 +5 位作者 何金灵 龙芯 赵瑞利 赵伟 金天明 张东超 《黑龙江畜牧兽医》 北大核心 2023年第21期11-17,25,共8页

为了评价弓形虫棒状体蛋白(ROPs)DNA疫苗对小鼠急性感染弓形虫的免疫保护作用,试验将获取的ROP5、ROP17和ROP18基因分别与pVAX1载体连接,获得重组质粒pVAX1-ROP5、pVAX1-ROP17和pVAX1-ROP18。将重组质粒转染至HEK293A细胞中,利用Western... 为了评价弓形虫棒状体蛋白(ROPs)DNA疫苗对小鼠急性感染弓形虫的免疫保护作用,试验将获取的ROP5、ROP17和ROP18基因分别与pVAX1载体连接,获得重组质粒pVAX1-ROP5、pVAX1-ROP17和pVAX1-ROP18。将重组质粒转染至HEK293A细胞中,利用Western-blot方法检测目的蛋白在真核细胞内的表达情况。将获得的重组质粒等摩尔比混合后通过腿部肌肉注射免疫小鼠作为混合疫苗组,同时设置空载体组及生理盐水组,免疫后检测小鼠血清IgG抗体水平、脾淋巴细胞增殖情况、细胞因子水平及T淋巴细胞分型,加强免疫后第14天对小鼠腹腔接种弓形虫RH株并观察其生存情况。结果表明:重组质粒经PCR扩增、测序及双酶切验证,分别在1686,1863,1701 bp处出现特异性条带,与目的基因大小一致且无碱基增加、缺失和突变情况;重组质粒经Western-blot检测在62,68,63 ku处成功表达;与空载体组、生理盐水组相比,混合疫苗组血清IgG抗体水平、脾淋巴细胞增殖指数、IFN-γ和IL-6细胞因子、CD4^(+)T淋巴细胞占比和CD4^(+)/CD8^(+)均极显著升高(P<0.01),免疫小鼠攻虫后的生存时间[(18.4±1.4)d]极显著延长(P<0.01)。说明构建的弓形虫ROPs DNA疫苗pVAX1-ROP5/ROP17/ROP18能够刺激小鼠产生高水平的体液免疫和细胞免疫应答,并能增强小鼠抵抗弓形虫感染的能力。 展开更多

关键词 弓形虫 DNA疫苗 rop5 rop17 rop18

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弓形虫MIC1、MIC6和ROP18混合蛋白对小鼠的免疫保护作用

5

作者 李虎 朱进进 +2 位作者 李婧旸 韩成建 余莉 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2024年第3期34-41,共8页

为评估弓形虫微线体蛋白MIC1、MIC6和棒状体蛋白ROP18组成的重组疫苗对BALB/c小鼠的免疫保护作用,我们将重组表达的MIC1、MIC6和ROP18三种蛋白进行不同的组合,并联合弗氏佐剂通过皮下注射的方式免疫小鼠。用ELISA技术检测免疫后小鼠血... 为评估弓形虫微线体蛋白MIC1、MIC6和棒状体蛋白ROP18组成的重组疫苗对BALB/c小鼠的免疫保护作用,我们将重组表达的MIC1、MIC6和ROP18三种蛋白进行不同的组合,并联合弗氏佐剂通过皮下注射的方式免疫小鼠。用ELISA技术检测免疫后小鼠血清特异性抗体,以及免疫蛋白刺激后脾细胞培养上清中各细胞因子的水平,通过脾淋巴细胞增殖实验检测脾淋巴细胞增殖情况。最后一次免疫后,用弓形虫WH3强毒株攻击,观察并记录小鼠的存活情况。结果表明,与对照PBS组相比,蛋白免疫组产生高滴度的IgG和IgG亚型(IgG1和IgG2a)抗体,滴度可高达1∶128000。细胞因子IL-4、IL-10和IFN-γ表达水平不同程度地升高,并且重组蛋白能够诱导淋巴细胞特异性增殖。免疫组小鼠的生存时间较对照组有所延长,其中MIC6-ROP18组延长时间最长(P<0.01)。MIC1、MIC6和ROP18组成的重组疫苗能诱导小鼠产生较强的体液免疫和细胞免疫应答,其中MIC6-ROP18蛋白组合的免疫保护效果更为明显,但仍需进一步改进。本研究为弓形虫疫苗的研发提供了思路。 展开更多

关键词 弓形虫疫苗 重组蛋白 MIC1 MIC6 rop18

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弓形虫毒力决定因子Rop18的研究进展 被引量：5

6

作者 尹昆 张佃波 闫歌 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2013年第11期1051-1055,共5页

Rop18是一种通过数量性状遗传位点等分析手段新近发现的弓形虫毒力决定因子,其基因的高表达与强毒Ⅰ型RH株对实验小鼠模型的急性毒力直接相关。Rop18可通过其丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性,干扰宿主细胞由IFN-(诱导表达的免疫相关GTP酶IRG... Rop18是一种通过数量性状遗传位点等分析手段新近发现的弓形虫毒力决定因子,其基因的高表达与强毒Ⅰ型RH株对实验小鼠模型的急性毒力直接相关。Rop18可通过其丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性,干扰宿主细胞由IFN-(诱导表达的免疫相关GTP酶IRGs蛋白以及内质网相关转录因子ATF6(的抗弓形体机制,使弓形虫具备强毒力。目前对Rop18的研究已成为棒状体蛋白激酶家族的研究热点。本文综述了Rop18的发现过程、序列和结构特征、作用机制和应用前景等方面的研究进展。 展开更多

关键词 rop18 IRGs 棒状体蛋白激酶 毒力决定因子 弓形虫 综述

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弓形虫棒状体蛋白ROP18的原核表达及其免疫保护性研究 被引量：6

7

作者 许越 张莹光 +4 位作者 徐丹 曹利利 王巍 魏峰 刘全 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2013年第8期708-711,共4页

目的克隆弓形虫ROP18基因并构建该基因的原核表达系统。方法根据GenBank发表的弓形虫ROP18序列设计合成1对特异性引物,PCR扩增ROP18抗原基因,并亚克隆到pET-28a原核表达载体,重组质粒转入大肠埃希菌BL21感受态细胞,用IPTG诱导表达,重组... 目的克隆弓形虫ROP18基因并构建该基因的原核表达系统。方法根据GenBank发表的弓形虫ROP18序列设计合成1对特异性引物,PCR扩增ROP18抗原基因,并亚克隆到pET-28a原核表达载体,重组质粒转入大肠埃希菌BL21感受态细胞,用IPTG诱导表达,重组蛋白用SDS-PAGE及Western blot鉴定。重组蛋白经纯化后免疫小鼠,ELISA法检测血清抗弓形虫IgG,并通过攻虫试验观察重组蛋白的免疫保护作用。结果成功构建了ROP18基因原核表达质粒pET-28a-ROP18,表达重组蛋白的分子质量单位约为55ku,该蛋白可被鼠抗弓形虫多抗血清识别;经ELISA检测,重组蛋白免疫小鼠产生了较高水平的血清抗体;攻虫试验中,重组蛋白免疫小鼠生存时间较对照组小鼠显著延长(P<0.05)。结论成功构建了ROP18基因原核表达质粒,表达的重组蛋白具有一定的免疫保护作用。 展开更多

关键词 弓形虫 rop18 原核表达

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弓形虫TR与ROP18双基因缺失及对NF-κB-IL-12-ROS信号通路相关因子的影响

8

作者 耿小玲 陈芸 +4 位作者 刘旗 张曼玉 蒋蔚 段倩玉 王权 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2023年第2期1-12,共12页

为探究弓形虫的TR与ROP18基因对NF-κB-IL-12-ROS信号通路的影响和抗宿主ROS损伤中是否具有协同作用,本研究利用CRISPR/Cas9技术构建了TR与ROP18双基因敲除株(TR-ROP18-KO)。通过检测TR/ROP18单、双基因缺失株氧化应激水平以及对小鼠巨... 为探究弓形虫的TR与ROP18基因对NF-κB-IL-12-ROS信号通路的影响和抗宿主ROS损伤中是否具有协同作用,本研究利用CRISPR/Cas9技术构建了TR与ROP18双基因敲除株(TR-ROP18-KO)。通过检测TR/ROP18单、双基因缺失株氧化应激水平以及对小鼠巨噬细胞活性氧(ROS)水平影响的研究发现,TR-ROP18-KO株引发的氧化应激水平极显著高于RH株(P<0.01),但与TR单基因缺失株无显著差异(P>0.05);利用RT-PCR检测TR/ROP18单、双基因缺失株感染小鼠巨噬细胞产生的NF-κB、IL-12 mRNA水平和ELISA检测小鼠血清中IL-12的水平发现,TR-ROP18-KO株感染组虽然极显著高于RH株感染组(P<0.01),但TR-ROP18-KO株感染组却未显著高于TR-KO株感染组(P>0.05),表明弓形虫TR与ROP18基因在抗宿主ROS损伤中不存在协同作用。本研究利用TR与ROP18双基因缺失株能够明确解析这两个基因在抗宿主ROS损伤中有无协同作用,为深入研究这两个基因在I型弓形虫免疫逃避途径中的协同作用奠定基础,这也为后续弓形虫双基因功能协同作用的研究提供了一个新思路。 展开更多

关键词 刚地弓形虫 CRISPR/Cas9 TR rop18 免疫逃避

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弓形虫棒状体蛋白ROP18表位肽抗体的制备与初步应用 被引量：1

9

作者 朱进进 程正阳 余莉 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2023年第1期48-54,共7页

设计并制备兔抗弓形虫棒状体蛋白ROP18的特异性表位肽抗体,并对其进行鉴定及初步应用。运用在线蛋白质分析软件Bepi Pred 1.0 Server预测和分析ROP18的抗原表位,人工合成选定的两段优势表位肽,与载体蛋白BSA偶联后分别免疫新西兰兔制备... 设计并制备兔抗弓形虫棒状体蛋白ROP18的特异性表位肽抗体,并对其进行鉴定及初步应用。运用在线蛋白质分析软件Bepi Pred 1.0 Server预测和分析ROP18的抗原表位,人工合成选定的两段优势表位肽,与载体蛋白BSA偶联后分别免疫新西兰兔制备抗ROP18血清,通过ELISA鉴定其效价,Western blot鉴定其特异性,并将这两种抗体应用于免疫荧光和免疫共沉淀技术。间接ELISA结果显示两种抗体效价分别为1∶16 000、1∶64 000;Western blot结果显示,两种抗体均能够特异性识别弓形虫速殖子中的内源性天然ROP18蛋白和外源重组ROP18蛋白;免疫荧光检测到ROP18定位于弓形虫速殖子顶端及感染细胞的纳虫泡膜上;免疫共沉淀未能成功下拉目标蛋白。成功获得ROP18的两种表位肽多克隆抗体,效价高且特异性强,并成功应用于免疫荧光定位,为进一步探究ROP18在弓形虫中的功能和作用奠定了基础。 展开更多

关键词 弓形虫 rop18 免疫荧光 免疫共沉淀

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弓形虫ROP18-MIC2重组真核质粒的构建与表达 被引量：3

10

作者 陈琳 何深一 +5 位作者 石娜 周怀瑜 丛华 白杨 赵广会 赵群力 《山东大学学报（医学版）》 CAS 北大核心 2012年第8期62-67,共6页

目的构建弓形虫棒状体蛋白18(ROP18)和微线体蛋白2(MIC2)的基因融合的重组真核表达质粒,并在转录和翻译水平进行鉴定。方法利用分子克隆技术构建重组真核表达质粒pBudCE4.1-ROP18-MIC2,经PCR、酶切及测序鉴定正确后,体外转染人包皮成纤... 目的构建弓形虫棒状体蛋白18(ROP18)和微线体蛋白2(MIC2)的基因融合的重组真核表达质粒,并在转录和翻译水平进行鉴定。方法利用分子克隆技术构建重组真核表达质粒pBudCE4.1-ROP18-MIC2,经PCR、酶切及测序鉴定正确后,体外转染人包皮成纤维细胞(HFF),采用RT-PCR在48 h时检测转录水平,SDS-PAGE在72 h时检测蛋白表达。结果重组真核表达质粒pBudCE4.1-ROP18-MIC2构建正确,经RT-PCR、SDS-PAGE鉴定,弓形虫ROP18、MIC2可在HFF细胞中瞬时表达。结论成功获得重组真核表达质粒pBudCE4.1-ROP18-MIC2,为进一步研究弓形虫疫苗的免疫保护性奠定基础。 展开更多

关键词 弓形虫属 基因 rop18 基因 MIC2 克隆 分子 真核细胞

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顶复门原虫棒状体蛋白ROP18的研究进展 被引量：3

11

作者 石凯 黄燕 +3 位作者 陈兆国 邓俊良 米荣升 周鹏 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第6期645-650,共6页

顶复门原虫是一类专性的细胞内寄生原虫,包括刚地弓形虫、隐孢子虫、疟原虫、巴贝斯虫和球虫等,是人和动物的重要病原。这类原虫具有相似的亚细胞结构并能分泌与入侵相关的保守蛋白,尤其是在入侵宿主细胞阶段分泌的棒状体蛋白(rhoptry p... 顶复门原虫是一类专性的细胞内寄生原虫,包括刚地弓形虫、隐孢子虫、疟原虫、巴贝斯虫和球虫等,是人和动物的重要病原。这类原虫具有相似的亚细胞结构并能分泌与入侵相关的保守蛋白,尤其是在入侵宿主细胞阶段分泌的棒状体蛋白(rhoptry proteins,ROPs)被认为是保护寄生虫入侵和繁殖的关键分子。其中ROP18是具有丝氨酸-苏氨酸激酶活性的ROP2家族蛋白成员之一,在刚地弓形虫入侵宿主细胞阶段发挥重要作用,是纳虫空泡(PV)形成时宿主细胞免疫的抑制因子。随着基因组学和蛋白质组学技术的不断发展,其相关研究也越来越深入。本文以目前研究最多的刚地弓形虫ROP18为主,对其发现历史、结构、分泌及定位、对宿主的毒力机制及应用现状做一综述。 展开更多

关键词 顶复门原虫 棒状体 rop18 综述

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弓形虫毒力效应因子ROP18竞争性抑制剂的筛选及亲和活性分析 被引量：3

12

作者 邱潇 程允堂 +11 位作者 王利磊 赵桂华 姚营营 徐超 孙慧 刘功振 肖婷 朱嵩 魏庆宽 黄炳成 闫歌 尹昆 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2019年第3期298-303,310,共7页

目的采用药物靶标虚拟筛选技术筛选靶向弓形虫毒性因子ROP18的小分子竞争性抑制剂,并对中靶小分子进行活性分析。方法通过MOE软件的Structure Prepare完成ROP18三维晶体结构的结构准备;以ATP结合口袋作为筛选起点,分别参考EHT药效团注... 目的采用药物靶标虚拟筛选技术筛选靶向弓形虫毒性因子ROP18的小分子竞争性抑制剂,并对中靶小分子进行活性分析。方法通过MOE软件的Structure Prepare完成ROP18三维晶体结构的结构准备;以ATP结合口袋作为筛选起点,分别参考EHT药效团注释及构建方法,以及TypeⅠ激酶抑制剂药效团特征构建靶向天然配体口袋的药效团;通过Pharmacophore Search导入包含202 919个化合物优势构象的SPECS数据库,通过EHT药效团注释方法进行小分子相似性筛选;筛选的小分子经分子对接和打分函数排序后,对排名前100的分子构象进行SAR分析。结果构建的药效团模型具有4个典型的TypeⅠ激酶抑制剂特征,保证了筛选的多样性和互作特异性;在SPECS数据库中共计通过了1 314个符合该模型的小分子,最终选取了25种活性较高的小分子。这些小分子具有2种母环核心Scaffold骨架聚类,分别命名为ScaffoldⅠ类及ScaffoldⅡ类。另有13种Scaffold各异的化合物类型。结论成功构建了靶向ROP18的ATP-结合口袋的药效团模型,筛选得到25种代表性小分子,形成2种Scaffold聚类及13种多样性骨架结构,为开发新型抗弓形虫病药物先导物奠定了基础。 展开更多

关键词 虚拟筛选 药效团模型 竞争性抑制剂 棒状体蛋白激酶18 弓形虫

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弓形虫表面抗原1、棒状体蛋白18真核表达载体的构建与体外表达 被引量：1

13

作者 吴腊梅 吴婷 +8 位作者 吴亮 王晓 苏丹华 刘原 陶思佳 魏逸青 姜旭淦 陈盛霞 曹建平 《江苏大学学报（医学版）》 CAS 2015年第3期246-250,255,共6页

目的:构建刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)表面抗原1(surface antigen 1,SAG1)及棒状体蛋白18(rhoptry protein 18,ROP18)的真核表达重组质粒,并在真核细胞中表达目的蛋白。方法:设计SAG1、ROP18的特异引物,采用RCR技术从弓形虫RH株基因... 目的:构建刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)表面抗原1(surface antigen 1,SAG1)及棒状体蛋白18(rhoptry protein 18,ROP18)的真核表达重组质粒,并在真核细胞中表达目的蛋白。方法:设计SAG1、ROP18的特异引物,采用RCR技术从弓形虫RH株基因组DNA中扩增编码SAG1、ROP18基因片段,经克隆至p TG19-T载体后,亚克隆至真核表达载体p3×FLAG-Myc-CMVTM-24,构建真核表达重组质粒p3×FLAG-Myc-CMVTM-24-SAG1和p3×FLAG-MycCMVTM-24-ROP18。将构建好的真核表达重组质粒转染人肾上皮细胞系293-T细胞,分析转染细胞的表达情况。结果:PCR扩增弓形虫SAG1和ROP18基因片段分别为1 011 bp和1 665 bp,与预期大小相符。重组质粒经PCR、酶切和测序鉴定结果均正确,通过RT-PCR和蛋白质印迹技术鉴定出重组质粒p3×FLAG-Myc-CMVTM-24-SAG1和p3×FLAG-Myc-CMVTM-24-ROP18在293-T细胞中表达。结论:成功构建了真核表达质粒p3×FLAG-Myc-CMVTM-24-SAG1和p3×FLAG-Myc-CMVTM-24-ROP18,该重组质粒能够在真核细胞中表达目的蛋白。 展开更多

关键词 刚地弓形虫 SAG1 rop18 真核表达质粒

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荧光素酶标记ROP18过表达弓形虫株的构建及验证 被引量：1

14

作者 郝桃方 李文洁 +2 位作者 杨子帆 杨兆收 周兴旺 《热带医学杂志》 CAS 2017年第8期991-995,F0003,共6页

目的构建及验证荧光素酶标记ROP18过表达弓形虫ROP18-Ty1-LUC RH株,为研究弓形虫毒力及相关宿主免疫调控机制奠定良好基础。方法利用PCR技术扩增出目的片段ROP18-Ty1和带ROP18-Ty1同源序列接头的质粒骨架,通过重组克隆系统构建既能表达R... 目的构建及验证荧光素酶标记ROP18过表达弓形虫ROP18-Ty1-LUC RH株,为研究弓形虫毒力及相关宿主免疫调控机制奠定良好基础。方法利用PCR技术扩增出目的片段ROP18-Ty1和带ROP18-Ty1同源序列接头的质粒骨架,通过重组克隆系统构建既能表达ROP18-Ty1又含荧光素酶标记的质粒P-ROP18-Ty1-LUC。将质粒PROP18-Ty1-LUC和筛选质粒P-TUB-CAT-SAG1通过电转染的方法转染到RH株弓形虫,经过氯霉素筛选和极限稀释得到目的弓形虫ROP18-Ty1-LUC RH株。构建成功的弓形虫ROP18-Ty1-LUC RH株在基因、蛋白、动物水平进行验证。结果利用重组克隆系统成功构建了质粒P-ROP18-Ty1-LUC,利用双酶切实验和测序验证了序列的正确性。以弓形虫ROP18-Ty1-LUC RH株基因组为模板,用特异引物能PCR扩增出1 704 bp大小的ROP18-Ty1和1 644 bp大小的LUC基因;用特异抗体anti-Ty1通过Western blot检测外源蛋白ROP18-Ty1的表达,在56 000 Mr处有单一条带;用荧光素酶报告基因检测系统检测LUC的表达,利用多标记酶标仪检测到荧光的发射;通过活体成像系统检测ROP18-Ty1-LUC RH弓形虫株在小鼠体内的增殖,与对照组相比感染了ROP18-Ty1-LUC RH弓形虫株的小鼠体内photon值明显更多(P<0.05);最后小鼠毒力实验也验证了ROP18-Ty1-LUC RH弓形虫毒力比RH-LUC弓形虫的毒力强(P<0.05)。结论成功构建和验证荧光素酶标记的ROP18过表达弓形虫ROP18-Ty1-LUC RH株,可以在动物个体水平更客观统计ROP18对弓形虫增殖速率的影响。 展开更多

关键词 弓形虫 rop18 荧光素酶 毒力

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弓形虫RH株ROP18基因的原核表达及鉴定 被引量：1

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作者 段倩玉 蒋蔚 +3 位作者 陈芸 张曼玉 曹敬政 王权 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2020年第5期48-54,共7页

为了研究刚地弓形虫ROP18的生物学功能,并深入了解其在抵抗宿主天然免疫方面所发挥的作用,本研究进行了弓形虫RH株ROP18基因的表达与鉴定。采用PCR方法扩增ROP18的截短基因,将其克隆至原核表达载体pET-30a(+)中后,转化大肠埃希菌BL21(D... 为了研究刚地弓形虫ROP18的生物学功能,并深入了解其在抵抗宿主天然免疫方面所发挥的作用,本研究进行了弓形虫RH株ROP18基因的表达与鉴定。采用PCR方法扩增ROP18的截短基因,将其克隆至原核表达载体pET-30a(+)中后,转化大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达并优化表达条件,SDS-PAGE分析表达情况,重组蛋白纯化后免疫小鼠制备多克隆抗体,通过Western blot及IFA鉴定重组蛋白的免疫活性。结果表明:以弓形虫RH株基因组DNA为模板,成功扩增出长约678 bp的ROP18截短基因,并构建了原核表达质粒pET-30a-ROP18,测序结果与GenBank参考序列比对,同源性为100%;SDS-PAGE结果显示,重组蛋白ROP18以包涵体形式存在,分子质量约为31 kDa,且在IPTG终浓度为0.2 mmol/L、37℃诱导表达6 h时,表达量最高;Western blot结果显示重组蛋白ROP18可被感染弓形虫的犬阳性血清识别,表明ROP18有良好的反应原性;IFA结果显示,ROP18主要分布于弓形虫速殖子的胞浆内,且棒状体常存在的部位呈现较强荧光。本研究成功获得重组蛋白ROP18及针对ROP18蛋白的多克隆抗体,为ROP18特性与功能的研究奠定基础。 展开更多

关键词 弓形虫 rop18 原核表达 多克隆抗体

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Tet-on慢病毒系统表达弓形虫ROP18的研究 被引量：2

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作者 王晓 朱君 +8 位作者 吴亮 吴腊梅 刘原 苏丹华 丁宁 赵康容 姜旭淦 陈盛霞 曹建平 《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2015年第1期25-28,共4页

目的用Tet-on慢病毒载体系统构建稳定表达弓形虫棒状体蛋白18(ROP18)的293T细胞株。方法PCR扩增ROP18基因序列插入慢病毒载体p LVCT-t TR-KRAB中,构建带有ROP18活性片段的慢病毒载体p LVCT-t TRKRAB-ROP18。经鉴定后将该重组载体(6μg)... 目的用Tet-on慢病毒载体系统构建稳定表达弓形虫棒状体蛋白18(ROP18)的293T细胞株。方法PCR扩增ROP18基因序列插入慢病毒载体p LVCT-t TR-KRAB中,构建带有ROP18活性片段的慢病毒载体p LVCT-t TRKRAB-ROP18。经鉴定后将该重组载体(6μg)与辅助质粒ps PAX2(4μg)和p MD2.G(2μg)共同转染293T细胞,荧光显微镜下观察细胞荧光。于转染后48和72 h收集含有慢病毒颗粒上清液,感染293T细胞。以1μg/ml强力霉素(DOX)诱导293T细胞表达ROP18,荧光显微镜下观察细胞荧光,RT-PCR法检测293T细胞中的ROP18表达情况。结果 PCR扩增rop18片段为960 bp,与预期大小一致。经PCR和酶切鉴定重组慢病素载体构建成功。转染48 h后,293T细胞于荧光显微镜下可见绿色荧光。经DOX诱导24 h即可观察到293T细胞中明亮绿色荧光。RT-PCR检测结果显示,293T细胞ROP18可产生960 bp特异条带,与预期结果一致。结论采用Tet-on慢病毒载体系统构建了稳定表达弓形虫ROP18的293T细胞株。 展开更多

关键词 刚地弓形虫 棒状体蛋白18 慢病毒 四环素诱导调控表达系统

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弓形虫毒力因子ROP18研究进展

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作者 刘俊 孙涛 《国际医药卫生导报》 2021年第20期3136-3139,共4页

弓形虫是一种专性细胞内寄生物,能够感染包括人在内的哺乳动物和禽类中间宿主。弓形虫能分泌多种效应分子,这些效应分子能够作用宿主细胞并促进虫体的增殖。其中,棒状体蛋白18(ROP18)是一种寄生虫毒力衍生因子,是弓形虫毒性的决定性因... 弓形虫是一种专性细胞内寄生物,能够感染包括人在内的哺乳动物和禽类中间宿主。弓形虫能分泌多种效应分子,这些效应分子能够作用宿主细胞并促进虫体的增殖。其中,棒状体蛋白18(ROP18)是一种寄生虫毒力衍生因子,是弓形虫毒性的决定性因子之一。在感染过程中,ROP18被分泌到宿主细胞质中,最终定位到细胞膜上。ROP18是一种苏氨酸激酶,但是介导其病理效应的分子机制尚不清楚,本文对弓形虫关键毒力因子ROP18的研究进展做一综述。 展开更多

关键词 弓形虫 rop18 研究进展

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弓形虫棒状体蛋白ROP18的优化表达 被引量：1

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作者 程正阳 苏蕊 +3 位作者 张贤 李叶林 朱万博 余莉 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2017年第4期345-349,共5页

目的构建弓形虫棒状体蛋白ROP18原核表达载体,并通过密码子优化等方法优化其表达。方法运用RT-PCR扩增ROP18基因,将其克隆入pGEX-6P-1原核表达载体,构建pGEX-ROP18重组质粒;运用OptigeneTM密码子优化分析平台对弓形虫ROP18编码基因进行... 目的构建弓形虫棒状体蛋白ROP18原核表达载体,并通过密码子优化等方法优化其表达。方法运用RT-PCR扩增ROP18基因,将其克隆入pGEX-6P-1原核表达载体,构建pGEX-ROP18重组质粒;运用OptigeneTM密码子优化分析平台对弓形虫ROP18编码基因进行优化,合成优化后的全长基因(ROP18u)并将其克隆入pGEX-6P-1原核表达载体,构建pGEX-ROP18u重组质粒;以优化后的ROP18u基因为模板,PCR扩增去除N端信号肽和前功能区序列的截短ROP18片段(ROP18uc),将其克隆入pGEX-6P-1原核表达载体,构建pGEX-ROP18uc重组质粒。所有重组质粒经PCR、双酶切和测序鉴定正确后,转化大肠埃希菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达重组蛋白,并进行Western blot鉴定。结果 pGEX-ROP18、pGEX-ROP18u和pGEX-ROP18uc于30℃诱导培养4h-6h,分别检测到分子质量约为88ku和77ku的重组蛋白,该蛋白能被GST单克隆抗体和ROP18多克隆抗体识别。结论成功构建了pGEX-ROP18、pGEX-ROP18u和pGEX-ROP18uc原核表达载体,密码子优化未能显著提高ROP18重组蛋白的表达量,但提高了可溶性蛋白的含量。 展开更多

关键词 弓形虫 rop18 原核表达

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刚地弓形虫棒状体蛋白18及其作为基因工程疫苗候选分子研究进展 被引量：1

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作者 刘荣荣 张晓磊 张进顺 《动物医学进展》 北大核心 2017年第12期104-107,共4页

刚地弓形虫棒状体蛋白18(rhoptry protein18,ROP18)是由棒状体分泌的、属于棒状体蛋白2家族的一员,具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性,在虫体入侵和毒力的发挥方面起着重要作用。论文就ROP18蛋白的结构、毒力和作用机制及其作为基因疫苗候选分... 刚地弓形虫棒状体蛋白18(rhoptry protein18,ROP18)是由棒状体分泌的、属于棒状体蛋白2家族的一员,具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性,在虫体入侵和毒力的发挥方面起着重要作用。论文就ROP18蛋白的结构、毒力和作用机制及其作为基因疫苗候选分子的研究现状进行综述。 展开更多

关键词 刚地弓形虫 棒状体蛋白18 毒力 作用机制 基因疫苗

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弓形虫ROP18蛋白激酶在酵母中的表达纯化及激酶活性鉴定 被引量：1

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作者 侯永恒 郝桃方 +4 位作者 廖婉琴 杨兆收 潘爱华 吴忠道 周兴旺 《热带医学杂志》 CAS 2016年第6期687-690,共4页

目的建立利用酵母表达系统获得有较高激酶活性的弓形虫棒状体蛋白（ROP18）激酶的表达纯化方法。方法利用PCR技术从弓形虫基因组DNA扩增弓形虫ROP18基因,通过Gateway系统将ROP18基因克隆到酵母表达载体pEGH-A中。将表达载体pEGH-A-ROP1... 目的建立利用酵母表达系统获得有较高激酶活性的弓形虫棒状体蛋白（ROP18）激酶的表达纯化方法。方法利用PCR技术从弓形虫基因组DNA扩增弓形虫ROP18基因,通过Gateway系统将ROP18基因克隆到酵母表达载体pEGH-A中。将表达载体pEGH-A-ROP18转化至Y258酵母菌株中并诱导表达,表达产物纯化后通过SDS-PAGE进行纯度鉴定;最后通过激酶活性实验对纯化的重组蛋白进行激酶活性鉴定。结果构建了弓形虫ROP18激酶重组表达质粒pEGH-A-ROP18和pEGH-A-ROP18-KD,并成功在酵母表达系统表达弓形虫ROP18重组蛋白,其分子量约为8.2×10 4 Mr,SDS-PAGE蛋白电泳显示为单一条带,并具有较高的激酶活性。结论利用酵母细胞表达系统成功表达并纯化了有激酶活性的弓形虫ROP18蛋白激酶。 展开更多

关键词 弓形虫 rop18 酵母表达 纯化 激酶活性

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