人前脑啡肽原基因修饰的永生化大鼠星形胶质细胞株的构建 被引量：8

1

作者 安珂 田玉科 +2 位作者 杨辉 高峰 王鹏 《中国疼痛医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第3期167-170,共4页

目的构建人前脑啡肽原(hPPE)基因修饰的永生化大鼠星形胶质细胞株。方法采用DNA重组技术将质粒pCMVhPPE.SEQ中的人前脑啡肽原基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)上,经酶切鉴定和测序分析后,采用脂质体介导法将重组质粒pcDNA3.1(+)hPPE... 目的构建人前脑啡肽原(hPPE)基因修饰的永生化大鼠星形胶质细胞株。方法采用DNA重组技术将质粒pCMVhPPE.SEQ中的人前脑啡肽原基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)上,经酶切鉴定和测序分析后,采用脂质体介导法将重组质粒pcDNA3.1(+)hPPE和空质粒pcDNA3.1(+)分别转染永生化大鼠星形胶质细胞株(IAST)。经G418(600μg/ml)筛选,挑选阳性克隆并扩大培养。采用免疫细胞化学法、RTPCR和放射免疫法检测转染细胞亮氨酸脑啡肽(LEK)的表达及分泌,同时检测Neo基因的存在以证实转染成功。结果重组质粒经酶切后分别出现5.4kb和950bb片段,测序分析与文献报道结果一致,表明重组质粒pcDNA3.1(+)hPPE亚克隆成功。Neo基因检测显示重组质粒和空质粒已成功转染至IAST中,筛选获得IAST/hPPE和IAST/Neo两个细胞株,LEK免疫染色均阳性,但平均光密度结果显示IAST/hPPE的LEK表达明显强于IAST/Neo和IAST(P<0.01)。IAST/hPPE细胞与IAST/Neo和IAST细胞相比,hPPEmRNA表达水平和培养上清液中LEK的分泌量明显增高(P<0.01),而IAST与IAST/Neo细胞相比无显著性差异(P>0.05)。结论成功构建了人前脑啡肽原基因修饰的永生化大鼠星形胶质细胞株(IAST/hPPE),为该细胞移植用于镇痛的研究奠定了基础。 展开更多

关键词 前脑啡肽原 星形胶质 基因修饰 细胞株 永生化 大鼠 pcDNA3.1(+) DNA重组技术 免疫细胞化学法 重组质粒 真核表达载体 脂质体介导法 亮氨酸脑啡肽 RT-PCR L-EK mRNA表达 免疫法检测 neo基因 平均光密度 培养上清液 显著性差异

下载PDF 职称材料

通过胚胎干细胞途径获得的嵌合体小鼠中neo基因在各组织中的分布 被引量：2

2

作者 姚玉成 熊俊 +2 位作者 王新民 李建秀 胡以平 《Acta Genetica Sinica》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2001年第12期1116-1119,T001,共5页

为探讨小鼠胚胎干细胞参与早期胚胎发育的潜能 ,以neo基因作为目的基因进行了胚胎干细胞的转染 ,经G41 8的筛选 ,获得表达neo基因的单克隆细胞 ,挑取部分克隆扩大 ,进行小鼠囊胚腔注射 ,再重新植入小鼠子宫 ,共注射了 60个囊胚 ,分别回... 为探讨小鼠胚胎干细胞参与早期胚胎发育的潜能 ,以neo基因作为目的基因进行了胚胎干细胞的转染 ,经G41 8的筛选 ,获得表达neo基因的单克隆细胞 ,挑取部分克隆扩大 ,进行小鼠囊胚腔注射 ,再重新植入小鼠子宫 ,共注射了 60个囊胚 ,分别回输到 5只假孕小鼠 ,在子代中得到了携带有neo基因的嵌合体小鼠。通过对嵌合体小鼠各组织PCR分析发现 ,neo基因可以在皮肤、肝脏。 展开更多

关键词 胚胎干细胞 neo基因 嵌合体小鼠 组织分布

下载PDF 职称材料

山羊Myostatin基因打靶载体的构建 被引量：2

3

作者 潘求真 孙书锋 +5 位作者 陆泉枝 王海 连正兴 杨宁 李宁 谭景和 《中国草食动物》 2006年第3期10-13,共4页

根据绵羊、猪、小鼠和牛的Myostatin基因序列,设计引物,通过PCR方法扩增了山羊的Myostatin基因的3′臂、5′臂,其长度分别为1·4kb、4·5kb。将扩增的片段与T载体连接后进行部分序列测定,与已知发表的Myostatin序列进行同源性比... 根据绵羊、猪、小鼠和牛的Myostatin基因序列,设计引物,通过PCR方法扩增了山羊的Myostatin基因的3′臂、5′臂,其长度分别为1·4kb、4·5kb。将扩增的片段与T载体连接后进行部分序列测定,与已知发表的Myostatin序列进行同源性比较,同源性为100%。对目的片段与载体进行酶切后定向连接形成转基因结构,经序列测定后,证明其插入方向和位置完全正确,构建表达Neo、Tk基因的哺乳动物双标记转基因载体,并命名为ploxp-M。 展开更多

关键词 neo基因 TK基因 ploxP质粒 聚合酶链式反应

下载PDF 职称材料

IIn-UK融合基因在CHO细胞中的高表达研究 被引量：2

4

作者 刘志刚 林建波 +3 位作者 张国强 安怀杰 徐桂清 俞炜源 《军事医学科学院院刊》 CSCD 北大核心 2004年第3期209-211,224,共4页

目的 :构建新型高效真核表达载体 ,实现人源化鼠抗人纤维蛋白单链抗体 低分子量尿激酶 (IIn UK)在CHO细胞中的高表达。方法 :利用常规分子生物学方法 ,通过对neo基因的表达进行不同程度的弱化 ,构建了一系列新型真核表达载体 ,以IIn U... 目的 :构建新型高效真核表达载体 ,实现人源化鼠抗人纤维蛋白单链抗体 低分子量尿激酶 (IIn UK)在CHO细胞中的高表达。方法 :利用常规分子生物学方法 ,通过对neo基因的表达进行不同程度的弱化 ,构建了一系列新型真核表达载体 ,以IIn UK融合基因为目的基因 ,比较这些真核表达载体实现外源基因高表达的能力 ,然后挑选高表达的克隆 ,通过MTX加压扩增 ,以提高IIn UK融合基因的拷贝数及表达水平。结果与讨论 :构建了 5种新型真核表达载体 ,并筛选出优化的真核表达载体 ,通过MTX加压扩增 ,实现了IIn UK融合基因在CHO细胞中的高表达 ,表达量达到 10 μg/ (10 6细胞·2 4h )。 展开更多

关键词 真核表达载体 neo基因 CHO/dhfr^-细胞 重组蛋白 高表达

原文传递

内含子中正筛选标记neo基因在转录中的剪切研究 被引量：1

5

作者 孙世惠 周艳荣 +3 位作者 陈红星 林艳丽 黄培堂 邓继先 《生物技术通讯》 CAS 2006年第6期859-861,共3页

目的:研究插入内含子中的正筛选标记基因neo在转录中的剪切情况。方法:克隆了猪血清白蛋白基因5'端调控序列,以猪基因组DNA为模板,P10/P11为引物,PCR扩增猪血清白蛋白基因翻译终止密码子后2.9kb的3'端调控序列;以pEGFP-1为模板,... 目的:研究插入内含子中的正筛选标记基因neo在转录中的剪切情况。方法:克隆了猪血清白蛋白基因5'端调控序列,以猪基因组DNA为模板,P10/P11为引物,PCR扩增猪血清白蛋白基因翻译终止密码子后2.9kb的3'端调控序列;以pEGFP-1为模板,P400/P401为引物PCR扩增绿色荧光蛋白(EGFP)基因,插入猪血清白蛋白基因5'端调控区之后,在3'端调控序列的内含子中靠近N端的序列中插入正筛选标记基因neo,构建了表达EGFP的真核表达载体pEXp11。转染人肝癌细胞系HepG2,通过G418药物筛选获得稳定转染的抗药性细胞克隆。提取抗性细胞克隆基因组RNA并进行反转录,获得cDNA序列。结果:用引物D400/D401及分别位于neo基因和3'端调控序列上的一对引物D394/D357进行PCR检测,其中D394/D357并未扩增出目的条带。结论:插入内含子中的neo基因在转录过程中可随内含子一起被剪切。 展开更多

关键词 neo基因 猪血清白蛋白基因 RT-PCR

下载PDF 职称材料

转基因猪中抗生素标记基因neo漂移风险评估

6

作者 王庆庆 高鹏飞 +5 位作者 李和刚 马德尊 蔡春波 钱丽丽 姜声旺 崔文涛 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2015年第10期2720-2725,共6页

本试验旨在研究转基因猪中抗生素标记基因neo漂移的可能性。利用Southern blotting鉴定F1代仔猪的显隐性,结果发现6头仔猪中有3头为转基因仔猪,3头为阴性仔猪。通过PCR技术对试验仔猪血液和消化道组织中neo基因进行检测,结果发现neo基... 本试验旨在研究转基因猪中抗生素标记基因neo漂移的可能性。利用Southern blotting鉴定F1代仔猪的显隐性,结果发现6头仔猪中有3头为转基因仔猪,3头为阴性仔猪。通过PCR技术对试验仔猪血液和消化道组织中neo基因进行检测,结果发现neo基因没有在血液水平和消化道组织中发生漂移。通过PCR技术对试验仔猪肠道细菌中neo基因进行检测,在肠道细菌基因组中没有检测到neo基因的存在。检测结果表明,仔猪血液、肠道细菌和消化道组织等都没有发生neo基因的漂移。 展开更多

关键词 转基因仔猪 neo基因 基因漂移

下载PDF 职称材料

具有还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶功能的家蚕l(3)neo18基因的克隆与表达特征

7

作者 王更先 鲁延军 +2 位作者 司马杨虎 张升祥 徐世清 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2009年第1期58-65,共8页

果蝇l(3)neo18基因可以通过P转座子诱发致死突变,编码的蛋白质具有还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)脱氢酶(ND)的功能。利用生物信息学、cDNA末端快速扩增(RACE)和反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)等方法,克隆了家蚕l(3)neo18同源基因,分... 果蝇l(3)neo18基因可以通过P转座子诱发致死突变,编码的蛋白质具有还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)脱氢酶(ND)的功能。利用生物信息学、cDNA末端快速扩增(RACE)和反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)等方法,克隆了家蚕l(3)neo18同源基因,分析了基因结构与表达谱。Bm-l(3)neo18基因(EU826676)的cDNA全长为868 bp,由573 bp的完整开放读码框(ORF)序列、25 bp的5′端非翻译区序列(5′-UTR)和251 bp的3′端非编码区序列(3′-UTR)组成,编码蛋白质为190个氨基酸残基,分子质量22.7 kD,pI 9.60。Bm-l(3)neo18基因由3个外显子和2个内含子组成,定位于家蚕第3染色体,位于nscaf2930的1 203.8-1 205.6 knt。Bm-l(3)neo18蛋白质在1-185氨基酸残基位置为ND的SGDH亚基保守区,在61-83氨基酸残基位置具有一个保守的跨膜区域。采用Clustal W进行多序列比对发现,Bm-l(3)neo18与埃及伊蚊等昆虫ND具有50%以上的蛋白质同源性,ND的保守区域高度一致,NJ法分子进化分析也显示Bm-l(3)neo18与昆虫ND进化上同源。该基因除在家蚕卵期的表达量较低外,在幼虫、蛹和蛾期均有较高表达,且存在组织差异性。 展开更多

关键词 家蚕 l(3)neo18基因 还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶 基因表达

下载PDF 职称材料

重组逆转录病毒介导的neo^R基因在公鼠生殖系细胞的转移 被引量：1

8

作者 王凤阳 张守峰 +4 位作者 赵君 池海英 孟庆文 扈荣良 殷震 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2001年第6期573-575,共3页

将感染滴度为 10 6cfu/ m L、携带新霉素磷酸转移酶 (neo R)基因的重组逆转录病毒与台盼蓝、polybrene按一定比例配制成注射液 ,单侧睾丸注入 14～ 16日龄公鼠曲细精管以体内感染精原干细胞 ,进行重组逆转录病毒 -精原干细胞介导的基... 将感染滴度为 10 6cfu/ m L、携带新霉素磷酸转移酶 (neo R)基因的重组逆转录病毒与台盼蓝、polybrene按一定比例配制成注射液 ,单侧睾丸注入 14～ 16日龄公鼠曲细精管以体内感染精原干细胞 ,进行重组逆转录病毒 -精原干细胞介导的基因转移研究。注射后 45 d,采集公鼠精液 ,进行精液品质与 PCR检测。结果表明 ,在优化的注射条件下 ,曲细精管内注射重组逆转录病毒后 ,不会干扰小鼠精子的正常发育能力 ,并能够将外源基因整合到精子基因组 ,从而首次通过重组逆转录病毒成功地实现了 neo 展开更多

关键词 重组逆转录病毒 neo^R基因 生殖系细胞 基因转移 小鼠

下载PDF 职称材料

猪Myostatin同源重组载体的构建 被引量：1

9

作者 潘求真 陆泉枝 +5 位作者 孙书锋 王海 连正兴 杨宁 谭景和 吴常信 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2006年第10期10-13,共4页

根据绵羊、猪、小鼠和牛的Myostatin基因序列设计引物,通过PCR方法扩增了猪Myostatin基因的3′臂、5′臂,其长度分别为1.4 kb、4.4 kb。将扩增的片段与T载体连接后进行部分序列测定,与已发表的Myostatin序列进行同源性比较,同源性为100%... 根据绵羊、猪、小鼠和牛的Myostatin基因序列设计引物,通过PCR方法扩增了猪Myostatin基因的3′臂、5′臂,其长度分别为1.4 kb、4.4 kb。将扩增的片段与T载体连接后进行部分序列测定,与已发表的Myostatin序列进行同源性比较,同源性为100%;对目的片段与载体进行酶切后定向连接形成转基因结构,经序列测定后,证明其插入方向和位置完全正确,构建了猪的Myostatin表达Neor、Tk基因的双标记转基因载体。 展开更多

关键词 neo^r基因 TK基因 ploxP质粒 聚合酶链式反应

下载PDF 职称材料

特异性表达新霉素耐药基因Neo^R的人乳腺癌细胞模型的建立

10

作者 郭斯启 奚永志 +3 位作者 宋三泰 金荔 陈兴国 孔繁华 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 1999年第2期119-121,共3页

将含有ＮｅｏＲ基因的ｐＳＶ２－ｎｅｏ质粒经扩增、提取及纯化，以磷酸钙共沉淀法转染入ＭＤＡ人乳腺癌细胞系，经Ｇ４１８长期高压筛选出７株抗性ＭＤＡ细胞克隆，采用ＮｅｏＲ基因特异性引物进行聚合酶链反应，证实了ＮｅｏＲ基因在... 将含有ＮｅｏＲ基因的ｐＳＶ２－ｎｅｏ质粒经扩增、提取及纯化，以磷酸钙共沉淀法转染入ＭＤＡ人乳腺癌细胞系，经Ｇ４１８长期高压筛选出７株抗性ＭＤＡ细胞克隆，采用ＮｅｏＲ基因特异性引物进行聚合酶链反应，证实了ＮｅｏＲ基因在各株Ｇ４１８抗性ＭＤＡ细胞基因组中的整合。ＭＤＡ－ＮｅｏＲ细胞在传代６个月之后仍可耐受６００ｍｇ／Ｌ高浓度的Ｇ４１８，说明ＮｅｏＲ基因导入后的整合及表达是稳定的。表明已初步建立了携有特异标志基因ＮｅｏＲ的人乳腺癌细胞模型。 展开更多

关键词 乳腺癌 基因表达 新霉素 neo^R基因 耐药基因

下载PDF 职称材料

逆转录病毒载体介导Neo^R基因转入正常人造血祖细胞

11

作者 王建安 赖春宁 +2 位作者 马宏进 汲言山 沈倍奋 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 1993年第2期159-165,共7页

本文应用逆转录病毒载体介导基因转移法将含有新霉素抗性(neo^R)基因的双拷贝逆转录病毒载体pN2A转入正常人造血祖细胞。应用Ficoll分层液(比重1.064)富集人造血干、祖细胞,预培养后与已经照射的生产重组病毒包装细胞株共同培养24小时,... 本文应用逆转录病毒载体介导基因转移法将含有新霉素抗性(neo^R)基因的双拷贝逆转录病毒载体pN2A转入正常人造血祖细胞。应用Ficoll分层液(比重1.064)富集人造血干、祖细胞,预培养后与已经照射的生产重组病毒包装细胞株共同培养24小时,经含G418(1000μg/ml)体外半固体培养,可见具有抗性的CFU-GM集落生长。应用PCR方法检测转染细胞中neo^R基因的转移和表达,在生产逆转录病毒的辅助细胞株PA317/N2及体外液体培养的骨髓细胞中均可扩增出neo^R基因的DNA片段,进一步证实了neo^R基因在正常人造血干、祖细胞的有效转移和表达。 展开更多

关键词 逆转录病毒载体 neo^R基因 造血祖细胞 基因转移 基因表达

下载PDF 职称材料