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葡萄原生质体分离及瞬时转化体系的建立 被引量：22
1
作者 舒小娟 温腾建 +2 位作者 邢佳毅 卢龙 胡建芳 《西北植物学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第6期1262-1268,共7页
为了建立葡萄原生质体进行遗传转化的技术,该研究以葡萄品种‘黑香蕉’的叶片和愈伤组织为材料,分析纤维素酶和离析酶的浓度与配比、渗透压和酶解时间等主要因素对葡萄原生质体分离的影响,探讨建立稳定、高效的葡萄原生质体分离与瞬时... 为了建立葡萄原生质体进行遗传转化的技术,该研究以葡萄品种‘黑香蕉’的叶片和愈伤组织为材料,分析纤维素酶和离析酶的浓度与配比、渗透压和酶解时间等主要因素对葡萄原生质体分离的影响,探讨建立稳定、高效的葡萄原生质体分离与瞬时转化体系,为鉴定目标基因的功能奠定基础。结果表明:(1)葡萄叶片原生质体的分离以3.0%纤维素酶和0.75%离析酶的酶组合,在0.6mol/L甘露醇溶液中,酶解14h为宜,每克游离产量为4.09×106个原生质体,活力为83.12%。(2)葡萄愈伤组织原生质体的分离以2.0%纤维素酶和0.5%离析酶的酶组合,在0.5mol/L甘露醇溶液中,酶解14h为宜,每克游离产量为6.05×106个原生质体,活力为84.13%。(3)利用该方法得到的葡萄原生质体为受体,采用40%PEG-4000介导转化质粒载体pEZS-NL,目标基因瞬时表达产物检测表明,GFP蛋白表达稳定、清晰。该研究建立的葡萄原生质体制备和转化体系,可以用较少量的质粒DNA获得外源基因在原生质体内的表达,为葡萄功能基因的研究提供技术支持。 展开更多
关键词 葡萄 原生质体 叶片 愈伤组织 遗传转化 瞬时表达
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菠萝叶基原生质体分离与瞬时转化体系的建立
2
作者 贺涵 阳习鹏 +3 位作者 赵婉欣 邵雪花 杨凤玺 刘传和 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2024年第7期81-88,98,共9页
【目的】研究菠萝叶基原生质体的高效分离方法,并对制备的原生质体进行瞬时转化,为利用菠萝原生质体进行菠萝基因功能研究提供技术支持。【方法】以‘巴厘’菠萝(Ananas comosus,‘Comtede Paris’)幼嫩叶片的叶基为材料,采用3因素3水... 【目的】研究菠萝叶基原生质体的高效分离方法,并对制备的原生质体进行瞬时转化,为利用菠萝原生质体进行菠萝基因功能研究提供技术支持。【方法】以‘巴厘’菠萝(Ananas comosus,‘Comtede Paris’)幼嫩叶片的叶基为材料,采用3因素3水平正交试验L _(9)(3^(3))分析纤维素酶质量浓度(6,12,20 g/L)、离析酶质量浓度(3,6,9 g/L)和甘露醇浓度(0.4,0.5,0.6 mol/L)对分离原生质体产量与活力的影响;同时,利用单因素试验(设置酶解时间2,4,6 h)筛选制备原生质体的最适酶解时间,确定分离菠萝叶基原生质体的最适条件;在最适条件下制备原生质体,采用聚乙二醇(PEG)介导法转化质粒,建立菠萝原生质体瞬时转化体系。【结果】L 9(33)正交试验结果显示,不同处理分离的原生质体产量为1.01×10^(6)~1.93×10^(6)g^(-1),纤维素酶质量浓度是决定原生质体产量的关键因素;原生质体活力为65.55%~87.00%,甘露醇浓度对原生质体活力的贡献最大。最适酶解条件为:菠萝叶基在含12 g/L纤维素酶、6 g/L离析酶、0.6 mol/L甘露醇的酶液中避光酶解4 h,产量可达1.96×10^(6)g^(-1),活力为85.54%。菠萝叶基原生质体通过PEG介导法转化pAN580-WRKY75质粒后,可在激光共聚焦显微镜下观察到核内的绿色荧光信号。【结论】确定了菠萝叶基原生质体的最适分离条件与瞬时转化方法,建立了适用于菠萝基因功能分析的原生质体瞬时表达体系。 展开更多
关键词 菠萝叶基 原生质体 瞬时转化 绿色荧光蛋白
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农杆菌介导的怀山药叶片瞬时表达方法的建立 被引量：6
3
作者 韩林林 李俊华 +4 位作者 赵喜亭 张晓丽 宋志辉 刘世宇 李明军 《河南师范大学学报（自然科学版）》 CAS 北大核心 2016年第6期135-139,共5页
高效的瞬时表达体系是方便、快捷的研究怀山药基因启动子活性、基因功能和生产重组蛋白的新途径.本研究选取怀山药叶片为受体,以β-葡糖醛酸酶(GUS)和绿色荧光蛋白(GFP)的基因为报告基因,对共培养时间进行分析,得到二者瞬时表达的最初... 高效的瞬时表达体系是方便、快捷的研究怀山药基因启动子活性、基因功能和生产重组蛋白的新途径.本研究选取怀山药叶片为受体,以β-葡糖醛酸酶(GUS)和绿色荧光蛋白(GFP)的基因为报告基因,对共培养时间进行分析,得到二者瞬时表达的最初时间以及较佳观察时间,建立根癌农杆菌介导的怀山药瞬时表达技术体系.结果显示:当注射的菌液浓度OD600=0.6,共培养3d时,GUS基因和GFP基因开始有表达,二者适于观察的共培养时间分别为5d和4d. 展开更多
关键词 怀山药 叶片 瞬时表达 GUS GFP
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菊花花瓣原生质体分离与瞬时转化体系的建立
4
作者 李志美 张碧佩 +7 位作者 伍青 吕金 赵鑫 潘燕 郭炜珊 周厚高 王凤兰 罗红辉 《植物生理学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第10期1951-1963,共13页
本研究以3个菊花(Chrysanthemum morifolium)品种‘帝王水晶’(‘Chrystal Regal’)、‘紫红托桂’(‘Zihong Tuogui’)和‘紫风车’(‘Zi Fengche’)为实验材料,通过轻摇酶解法及酶解前真空处理制备优质的菊花原生质体,并初步以改良的... 本研究以3个菊花(Chrysanthemum morifolium)品种‘帝王水晶’(‘Chrystal Regal’)、‘紫红托桂’(‘Zihong Tuogui’)和‘紫风车’(‘Zi Fengche’)为实验材料,通过轻摇酶解法及酶解前真空处理制备优质的菊花原生质体,并初步以改良的聚乙二醇4000(PEG 4000)介导转化结合热激处理技术建立了菊花花瓣原生质体瞬时转化体系。结果表明,在菊花花瓣组织中可获得完整并有活力的原生质体数量比叶片中多;其中,采用含10 g·L^(-1)纤维素酶、6 g·L^(-1)离析酶、2 g·L^(-1)崩溃酶和400 mmol·L^(-1)甘露醇的酶解液体系,酶解前抽真空处理20~25 min,并置于摇床中22℃、30 r·min^(-1)轻摇酶解12~14 h,‘帝王水晶’和‘紫风车’花瓣原生质体产量分别可达2.8×10^(5)和7.0×10^(5)个·g^(-1)(FW),活力分别为63.9%和76.9%,能满足瞬时表达实验要求。用等体积的含100 mmol·L^(-1)CaCl_(2)、400 mmol·L^(-1)甘露醇和300 g·L^(-1)PEG 4000的缓冲液体系分别介导3个菊花品种的花瓣原生质体(200μL,2×10^(5)个·mL^(-1))转化,并于28℃热激处理60 s,35S启动的外源基因(OsVPE1-GFP)在花瓣原生质体中瞬时表达的绿色荧光信号较强,瞬时转化效率为30%以上。 展开更多
关键词 菊花 花瓣 叶片 原生质体分离 瞬时转化
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续随子转录因子ElWRI1的鉴定及功能分析
5
作者 牛听风 葛丽萍 +2 位作者 苏云婷 王壮琳 李润植 《植物科学学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第4期458-466,共9页
续随子(Euphorbia lathyris L.)种子可积累大量油脂且富含油酸,WRINKLED1(WRI1)为AP2/EREBP类转录因子,参与调控脂肪酸的合成及种子发育等生命过程。本研究通过对续随子的全基因组鉴定,获得了11个续随子ElWRI1转录因子基因,命名为ElWRI1... 续随子(Euphorbia lathyris L.)种子可积累大量油脂且富含油酸,WRINKLED1(WRI1)为AP2/EREBP类转录因子,参与调控脂肪酸的合成及种子发育等生命过程。本研究通过对续随子的全基因组鉴定,获得了11个续随子ElWRI1转录因子基因,命名为ElWRI1-1~ElWRI1-11。结果显示,它们均具有两个AP2结构域;其编码蛋白均属于不稳定亲水蛋白,无跨膜结构;亚细胞定位预测显示所有WRI1蛋白均位于细胞核。表达分析结果表明,ElWRI1-6与ElWRI1-8在种子发育时期的表达量较高,且后者的表达模式与种子油脂积累模式一致。在本氏烟草(Nicotiana benthamiana L.)叶片中异源过表达ElWRI1-8,叶片中总油脂含量增加,且油酸含量显著上升。研究结果表明ElWRI1-8可能是调控续随子种子油脂和油酸生物合成的一个重要转录因子。 展开更多
关键词 续随子 转录因子 WRI1基因 油脂合成 叶片瞬时表达
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基于CRISPR基因编辑系统抗番木瓜曲叶病毒的植物转化载体的构建 被引量：3
6
作者 龙欢 赵辉 +6 位作者 王绪朋 贾瑞宗 贺萍萍 孔华 郭运玲 郭安平 无 《热带作物学报》 CSCD 北大核心 2019年第10期2022-2028,共7页
双生科病毒具有毁灭性强、寄主多样、分布地域广等特点,一直是困扰世界农作物生产的一大难题。用物理和化学方法防治该类病毒不仅花费成本高,见效低,而且还可能对环境造成负面影响,因此用分子手段培育抗病品种才是有效途径之一。本研究... 双生科病毒具有毁灭性强、寄主多样、分布地域广等特点,一直是困扰世界农作物生产的一大难题。用物理和化学方法防治该类病毒不仅花费成本高,见效低,而且还可能对环境造成负面影响,因此用分子手段培育抗病品种才是有效途径之一。本研究结合最新的CRISPR/Cas9基因编辑技术和Golden Gate克隆技术,设计并构建了抗番木瓜曲叶病毒基因编辑串联多切点表达载体。表达载体转入农杆菌AGL1后经注射本氏烟草叶片进行瞬时表达,48 h后通过激光共聚焦显微镜能观察到有绿色荧光的出现,定位的位置为细胞核与细胞质膜。本研究为番木瓜抗曲叶病毒研究提供理论基础。 展开更多
关键词 基因编辑 曲叶病毒 番木瓜 瞬时表达
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小麦叶片瞬时表达体系的优化
7
作者 徐欢欢 刘佳佳 +1 位作者 李娜 马正强 《麦类作物学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第12期1617-1623,共7页
为了解决小麦叶片瞬时表达体系所存在的表达效率低、稳定性差、轰击不均匀等问题,利用GFP和GUS作为报告基因,通过改变叶片处理方式、质粒用量、质粒包裹方法和轰击距离,对小麦叶片瞬时表达体系进行优化,并将优化后的体系应用于小麦抗白... 为了解决小麦叶片瞬时表达体系所存在的表达效率低、稳定性差、轰击不均匀等问题,利用GFP和GUS作为报告基因,通过改变叶片处理方式、质粒用量、质粒包裹方法和轰击距离,对小麦叶片瞬时表达体系进行优化,并将优化后的体系应用于小麦抗白粉病相关基因的功能鉴定,验证优化体系的有效性。结果表明,与未优化前的方法相比,叶片处理方式为乙醇,质粒用量为每枪1μg,质粒包裹方法采用扩大体系法,轰击距离为9cm时,瞬时表达效率显著提高且轰击更为均匀。应用该体系在感病小麦品种叶片中沉默隐性抗白粉病基因Mlo,显著降低了互作细胞吸器指数,进一步验证了目标基因的功能和优化体系的有效性。 展开更多
关键词 小麦 叶片 瞬时表达 体系优化 白粉病
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甘蔗黄叶病毒运动蛋白的原核表达和抗血清制备 被引量：2
8
作者 刘玉姿 张绍康 +5 位作者 田畅 张晓艳 左登攀 王颖 张宗英 韩成贵 《植物病理学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第6期694-701,共8页
甘蔗黄叶病毒(Sugarcane yellow leaf virus,ScYLV)属于黄症病毒科(Luteoviridae)、马铃薯卷叶病毒属(Polerovirus),主要由蚜虫传播,能够侵染甘蔗、玉米等多种作物,引发严重的植物病害。本研究将编码ScYLV运动蛋白(Movement protein,MP... 甘蔗黄叶病毒(Sugarcane yellow leaf virus,ScYLV)属于黄症病毒科(Luteoviridae)、马铃薯卷叶病毒属(Polerovirus),主要由蚜虫传播,能够侵染甘蔗、玉米等多种作物,引发严重的植物病害。本研究将编码ScYLV运动蛋白(Movement protein,MP)的基因连接到pDB-His-MBP原核表达载体上,转化到大肠杆菌菌株Rosetta中,经IPTG诱导,表达分子量大小约为70 kDa的融合蛋白,将纯化后的融合蛋白制备多克隆抗血清。利用western blot检测抗血清的效价为1∶128000,灵敏度为1∶256,抗血清不与马铃薯卷叶病毒属(Polerovirus)的其它病毒以及黄症病毒属(Luteovirus)病毒发生交叉反应,具有很好的特异性。本文制备的ScYLV MP抗血清可以用于ScYLV的检测,并为深入研究ScYLV与寄主的相互作用等问题提供材料基础。 展开更多
关键词 甘蔗黄叶病毒 运动蛋白 原核表达 瞬时表达 抗血清
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