目的探讨影响冬虫夏草扩增片断长度多态性(Amplified Fragment Length Polymorphism,AFLP)的主要因素,建立并优化冬虫夏草AFLP反应体系。方法变性裂解液法提取冬虫夏草基因组cDNA,分别用一步法和两步法进行酶切与连接,再进行预扩增、选...目的探讨影响冬虫夏草扩增片断长度多态性(Amplified Fragment Length Polymorphism,AFLP)的主要因素,建立并优化冬虫夏草AFLP反应体系。方法变性裂解液法提取冬虫夏草基因组cDNA,分别用一步法和两步法进行酶切与连接,再进行预扩增、选扩后,聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,银染检测。结果本研究建立适用于冬虫夏草的AFLP体系:用乙醇沉淀cD-NA,建立的模板不含PCR反应抑制剂及其他酶反应抑制剂,可被限制性内切酶MseI和EcoRI完全酶切;确定两步法进行酶切、连接,酶切时间为37℃3h,连接时间为16℃过夜,缓冲液选用NEB公司buffer2;选择性扩增后的银染显色在10℃以下。结论本研究建立的反应体系适用于冬虫夏草基因组cDNA的AFLP银染法显带研究。展开更多
文摘目的探讨影响冬虫夏草扩增片断长度多态性(Amplified Fragment Length Polymorphism,AFLP)的主要因素,建立并优化冬虫夏草AFLP反应体系。方法变性裂解液法提取冬虫夏草基因组cDNA,分别用一步法和两步法进行酶切与连接,再进行预扩增、选扩后,聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,银染检测。结果本研究建立适用于冬虫夏草的AFLP体系:用乙醇沉淀cD-NA,建立的模板不含PCR反应抑制剂及其他酶反应抑制剂,可被限制性内切酶MseI和EcoRI完全酶切;确定两步法进行酶切、连接,酶切时间为37℃3h,连接时间为16℃过夜,缓冲液选用NEB公司buffer2;选择性扩增后的银染显色在10℃以下。结论本研究建立的反应体系适用于冬虫夏草基因组cDNA的AFLP银染法显带研究。