E1B-55kDa基因缺陷型溶瘤腺病毒H101体外和体内抑制结肠癌HCT-116细胞增殖

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作者 卞京 李夏伊 +3 位作者 郑于铭 徐文晖 朱美玲 郑磊贞 《肿瘤》 CAS CSCD 北大核心 2021年第9期604-615,共12页

目的:研究E1B-55kDa基因缺陷型溶瘤腺病毒H101对结肠癌HCT-116细胞及其裸鼠皮下移植瘤生长的影响,并探讨可能的作用机制。方法:使用不同效价的缺陷型溶瘤腺病毒H101作用于结肠癌HCT-116、SW480和RKO细胞24、48和72 h后,采用CCK-8法检测... 目的:研究E1B-55kDa基因缺陷型溶瘤腺病毒H101对结肠癌HCT-116细胞及其裸鼠皮下移植瘤生长的影响,并探讨可能的作用机制。方法:使用不同效价的缺陷型溶瘤腺病毒H101作用于结肠癌HCT-116、SW480和RKO细胞24、48和72 h后,采用CCK-8法检测细胞的存活率。随后,用效价为1.0×10^(7)vp/mL的缺陷型溶瘤腺病毒H101处理HCT-116细胞72 h后,在光学显微镜下观察细胞形态学变化,同时采用蛋白质印迹法检测HCT-116细胞中腺病毒衣壳蛋白Hexon的表达情况,以及FCM法检测对细胞周期的影响。采用不同效价(1.0×10^(6)和2.5×10^(6)vp/mL)的缺陷型溶瘤腺病毒H101处理HCT-116细胞48 h后,通过细胞集落形成实验检测缺陷型溶瘤腺病毒H101对HCT-116细胞集落形成能力的影响,以及Transwell小室实验检测对HCT-116细胞的迁移和侵袭能力的影响。用HCT-116细胞构建裸鼠皮下移植瘤模型,瘤内注射缺陷型溶瘤腺病毒H101,观察腺病毒对裸鼠移植瘤生长的影响,并采用免疫组织化学法检测Ki-67和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)在移植瘤中的表达情况。结果:与对照组相比,缺陷型溶瘤腺病毒H101明显抑制HCT-116细胞的生长活力(P<0.05),且这种抑制作用呈一定的浓度和时间依赖性;而SW480和RKO细胞,仅在缺陷型溶瘤腺病毒H101效价高(1.0×10^(7)vp/mL)和作用时间长(72 h)时,对细胞的增殖具有抑制作用(P均<0.05)。缺陷型溶瘤腺病毒H101(1.0×10^(7)vp/mL)处理HCT-116细胞72 h后,HCT-116细胞失去正常形态,悬浮细胞数目增多,并出现细胞破裂导致膜内容物流出;HCT-116细胞的集落形成能力明显降低(P<0.001);缺陷型溶瘤腺病毒H101感染后可上调HCT-116细胞中腺病毒衣壳蛋白Hexon的表达水平(P<0.001),证明缺陷型溶瘤腺病毒H101可在HCT-116细胞中有效表达。缺陷型溶瘤腺病毒H101抑制HCT-116细胞的迁移和侵袭(P均<0.01),并将HCT-116细胞阻滞在S期(P<0.01)。缺陷型� 展开更多

关键词 结肠肿瘤 缺陷型溶瘤腺病毒 细胞增殖 裸鼠

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表达非洲猪瘟病毒P72蛋白复制缺陷型重组腺病毒的构建及鉴定 被引量：11

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作者 胡永新 赵永刚 +4 位作者 张永强 刘拂晓 樊晓旭 吴晓东 王志亮 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第8期1635-1641,共7页

本研究旨在构建能够表达非洲猪瘟病毒(ASFV)P72蛋白的缺陷型重组腺病毒。参考ASFV China-SY18株的基因序列,合成B646L基因。先将合成的B646L基因通过TOPO连接克隆到过渡载体pENTR/D-TOPO中;再将插入B646L基因的过渡载体pENTR/D-TOPO-ASF... 本研究旨在构建能够表达非洲猪瘟病毒(ASFV)P72蛋白的缺陷型重组腺病毒。参考ASFV China-SY18株的基因序列,合成B646L基因。先将合成的B646L基因通过TOPO连接克隆到过渡载体pENTR/D-TOPO中;再将插入B646L基因的过渡载体pENTR/D-TOPO-ASFV-P72与pAd/CMV/V5-DEST腺病毒骨架载体进行重组,得到pAd-ASFV-P72重组质粒;重组质粒经PacⅠ酶切线性化后转染293A细胞,连续传代后获得重组腺病毒。结果表明,获得的Ad5-ASFV-P72重组腺病毒的滴度为2.53×10^9 IFU·m^L^-1;经免疫荧光方法及Western blot鉴定ASFV-P72蛋白在Vero细胞中成功表达,且能够与ASFV标准阳性血清发生特异性反应。本研究成功获得能够表达ASFV P72蛋白的重组腺病毒Ad5-ASFV-P72,不仅为ASFV多基因重组腺病毒载体疫苗的研制奠定了一定基础,还为ASFV相关血清学诊断方法的建立提供了安全有效的抗原。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 复制缺陷型腺病毒 P72蛋白

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脑源性神经营养因子基因修饰的嗅鞘细胞移植对大鼠损伤脊髓的保护作用 被引量：9

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作者 刘锦波 顾卫东 +2 位作者 贡爱华 张志坚 王永忠 《中华实验外科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第5期637-638,共2页

我们以重组缺陷型腺病毒为载体，将脑源性神经营养因子（BDNF）基因转染的嗅鞘细胞移植入大鼠损伤的脊髓，观察脊髓修复和肢体功能恢复情况，为将来应用基因工程细胞移植治疗脊髓损伤提供依据。

关键词 脑源性神经营养因子 嗅鞘细胞移植 损伤脊髓 保护作用 基因修饰 大鼠 缺陷型腺病毒 细胞移植治疗 基因转染 恢复情况

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CEA启动子启动双自杀基因CD/TK重组AdEasy XL腺病毒构建 被引量：5

4

作者 王天宝 汪建平 +2 位作者 董文广 钟女奇 周军 《中华实验外科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第10期1180-1182,共3页

目的构建含有CEA启动子(CEApromoter,Cp)启动的双自杀基因CD与TK的复制缺陷型腺病毒。方法设计带有限制性内切酶酶切序列的PCR引物。在2μlT4DNAligase作用下,Cp插入pAdTrack(pAT)的MCS,形成pAT.Cp;CD插入pAT.Cp的MCS,形成pAT.Cp.C;TK插... 目的构建含有CEA启动子(CEApromoter,Cp)启动的双自杀基因CD与TK的复制缺陷型腺病毒。方法设计带有限制性内切酶酶切序列的PCR引物。在2μlT4DNAligase作用下,Cp插入pAdTrack(pAT)的MCS,形成pAT.Cp;CD插入pAT.Cp的MCS,形成pAT.Cp.C;TK插入pAT.Cp.C的MCS,形成pAT.Cp.C.T。5μgpAT.Cp.C.T经4μlPmeI线化后,转化BJ5183AD1,1μlPacI酶切鉴定。重组AdEasy质粒转化XL10Gold细胞,大量扩增提取纯化,转染5×105AD293细胞,荧光显微镜观察,制备带有Cp.C.T重组腺病毒(recombinantadenoviruswithCp.C.T,RACp.C.T),测定病毒滴度。结果pAT.Cp,pAT.Cp.C,pAT.Cp.C.T双酶切以及PCR均见长约500bp的Cp,1300bp的CD,1100bp的TK。对照质粒DNA转化BJ5183AD1效率为7.36×106cfu/μg。线化pAT.Cp.C.T转化BJ5183AD1,形成重组AdEasy质粒DNA,PacI酶切见典型长约3.0或4.5kb与30.0kbDNA片断。重组质粒转染AD293出现绿色荧光。RACp.C.T滴度为5.67×107pfu/ml。结论RACp.C.T构建正确;AdEasyXL腺病毒载体系统转导Cp.C.T具有高效性,易于观察转染效果。 展开更多

关键词 结肠肿瘤 癌胚抗原 胸苷激酶 腺病毒载体 复制缺陷型腺病毒 AdEasy CEA启动子 重组腺病毒 基因CD 自杀

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多基因联合重组腺病毒对喉癌细胞生长的影响 被引量：4

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作者 陈晓红 韩德民 +9 位作者 马丽晶 邢虎 王琪 黄志刚 房居高 张伟 王鸿 范尔钟 邱兆华 吴祖泽 《中国耳鼻咽喉头颈外科》 北大核心 2005年第3期139-142,共4页

目的探讨携带多基因(抑癌蛋白:p53,免疫共刺激分子:B7–1,粒细胞巨噬细胞集落刺激因子:Granulocyte-MacrophageColony-StimulatingFactor,GM-CSF)的复制缺陷型腺病毒(BB-102)对喉鳞癌原代细胞中的表达效率和对其生长的抑制作用。方法构... 目的探讨携带多基因(抑癌蛋白:p53,免疫共刺激分子:B7–1,粒细胞巨噬细胞集落刺激因子:Granulocyte-MacrophageColony-StimulatingFactor,GM-CSF)的复制缺陷型腺病毒(BB-102)对喉鳞癌原代细胞中的表达效率和对其生长的抑制作用。方法构建多基因联合(p53,GM-CSF,B7-1)重组的复制缺陷腺病毒BB–102,在体外感染两株喉鳞癌细胞系(LSC-1及L-17),采用免疫组化,流氏细胞术,ELISA等检测目的基因编码蛋白效率,用MTT法观察其对喉癌细胞生长抑制作用。结果三种目的基因在喉癌细胞中均有不同程度的表达:B7-1从平均1.34%提高到57%;GM-CSF在转染后24小时即开始升高,持续两天后低水平维持在一周时间;p53蛋白表达明显,但当50pfu/细胞的相同浓度转染时,其表达效率没有Ad-p53高。BB-102和Ad-p53分别对肿瘤细胞生长产生抑制作用,两者没有显著差异(P>0.05)。结论BB-102感染喉癌细胞,目的基因都能有效表达,喉癌原代细胞生长受到明显抑制;感染滴度相同时,单基因腺病毒Ad-p53感染的肿瘤细胞p53蛋白表达丰度比BB-102高。 展开更多

关键词 多基因 癌细胞生长 重组腺病毒 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 BB-102 复制缺陷型腺病毒 免疫共刺激分子 p53蛋白表达 Factor 基因编码蛋白 生长抑制作用 喉癌细胞 肿瘤细胞生长 AD-P53 表达效率 目的基因 鳞癌细胞系 流氏细胞术

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活体生物发光成像追踪大鼠跟腱内移植干细胞 被引量：4

6

作者 黄德清 Gary Balian 《中国组织工程研究》 CAS CSCD 2013年第23期4240-4247,共8页

背景:移植脂肪源干细胞在活体内的归巢、迁移、增殖和分化的机制仍未得到充分阐明。活体生物发光活体成像技术是近来发展起来的一种可以直接检测活细胞在动物体内生物学行为的新的技术方法。目的:探讨用活体生物发光成像技术检测大鼠跟... 背景:移植脂肪源干细胞在活体内的归巢、迁移、增殖和分化的机制仍未得到充分阐明。活体生物发光活体成像技术是近来发展起来的一种可以直接检测活细胞在动物体内生物学行为的新的技术方法。目的:探讨用活体生物发光成像技术检测大鼠跟腱内移植的经荧光基因修饰的脂肪源干细胞可行性。方法:分离培养大鼠腹腔来源的脂肪源干细胞,用浓度为3×1010L-1携带虫荧光素酶的腺病毒载体对其进行转染,观察转染对脂肪源干细胞的影响;将转染的脂肪源干细胞移植到大鼠跟腱缺损处,移植后1,4,7,14d用活体生物发光成像技术检测移植脂肪源干细胞荧光素酶的表达,移植后28d跟腱标本冰冻切片在荧光显微镜下观察。结果与结论:在体外,腺病毒转染对脂肪源干细胞的生长和增殖无明显影响(P>0.05)。细胞移植后1,4,7,14d,活体生物发光成像技术在实验侧修复段跟腱检测到的荧光表达强度分别为(1.22±0.43)×106、(1.81±0.76)×106、(1.88±0.69)×106和(0.89±0.26)×105光子/s(n=6)。而对照侧跟腱修复段未检测到荧光表达;移植后28d,实验侧跟腱冰冻切片在荧光显微镜下见到大量表达荧光的细胞。表明活体生物发光成像技术可成功追踪大鼠跟腱内移植的经荧光基因修饰的脂肪源干细胞。脂肪源干细胞有望成为肌腱组织工程的种子细胞。 展开更多

关键词 干细胞 干细胞移植 缺陷型腺病毒 脂肪源干细胞 腺病毒 细胞转染 荧光素酶 肌腱 生物发光 成像 荧光表达 组织工程 种子细胞 省级基金 干细胞图片文章

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人IL-2复制缺陷型重组腺病毒的构建和鉴定 被引量：2

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作者 孙运祥 任丽君 +1 位作者 郭玉嵩 田长富 《实用肿瘤学杂志》 CAS 2005年第4期260-263,共4页

目的构建含hIL-2的复制缺陷型重组腺病毒。方法将hIL-2DNA片段与载体pDNR-Dual-CMV融合,转化大肠杆菌DH5α。得到重组质粒(pDNR-Dual-hIL-2),经鉴定正确,将pDNR-Dual-hIL-2质粒与pLP-Adeno-x-CMV质粒重组得到重组载体pLP-Adeno-hIL-2,... 目的构建含hIL-2的复制缺陷型重组腺病毒。方法将hIL-2DNA片段与载体pDNR-Dual-CMV融合,转化大肠杆菌DH5α。得到重组质粒(pDNR-Dual-hIL-2),经鉴定正确,将pDNR-Dual-hIL-2质粒与pLP-Adeno-x-CMV质粒重组得到重组载体pLP-Adeno-hIL-2,再次转化大肠杆菌DH5α,挑取正确克隆,大量扩增,提取质粒。将此质粒经PacⅠ酶切后与LipofectamineTM2000转染HEK293细胞,产生含人IL-2的复制缺陷重组腺病毒(AdhIL-2)。结果pLP-Adeno-hIL-2重组载体经PCR、酶切鉴定结果与预期相符,所得重组病毒滴度达到5×107PFUml。结论成功构建了hIL-2的复制缺陷型重组腺病毒。 展开更多

关键词 白细胞介素2 腺病毒载体 同源重组 复制缺陷重组腺病毒 缺陷型重组腺病毒 人IL-2 鉴定结果 HEK293细胞 HIL-2 重组质粒

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一种新型的低辅毒污染的重组AAV生产系统 被引量：3

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作者 陈立 陈浩明 +3 位作者 李戈 姚纪花 卢大儒 薛京伦 《科学通报》 EI CAS CSCD 北大核心 2003年第1期52-54,共3页

将Cre-loxP系统引入重组AAV的生产过程之中,用缺陷型腺病毒AdLC作为生产重组AAV的辅助病毒.在大量生产带有目的基因(EGFP,hFIX)的重组腺相关病毒载体的同时,最大程度地限制了辅助病毒的产生,从而减轻了下游纯化工作的压力.活体动物实验... 将Cre-loxP系统引入重组AAV的生产过程之中,用缺陷型腺病毒AdLC作为生产重组AAV的辅助病毒.在大量生产带有目的基因(EGFP,hFIX)的重组腺相关病毒载体的同时,最大程度地限制了辅助病毒的产生,从而减轻了下游纯化工作的压力.活体动物实验的结果证实了这种方法的优越性.实验结果为重组AAV载体系统在基因治疗领域中的应用提供了一条新的途径. 展开更多

关键词 重组腺相关病毒 AAV Cre-loxP系统 缺陷型腺病毒 辅助病毒 生产系统 基因治疗

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依托泊苷提高复制缺陷型腺病毒介导外源基因在肿瘤细胞中的表达水平 被引量：4

9

作者 张圣海 吴继红 +6 位作者 刘新建 陈霞芳 田毓华 谢匡成 于慧 潘虹 黄倩 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 2007年第1期14-20,共7页

目的：研究化疗药物依托泊苷对腺病毒载体介导的外源基因在肿瘤细胞内表达水平的影响。方法：携带外源基因增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的复制缺陷型腺病毒Ad5-CMV-EGFP（MOI为1或10）单独或联合终质量浓度为0．2、2、20、40、80、100和... 目的：研究化疗药物依托泊苷对腺病毒载体介导的外源基因在肿瘤细胞内表达水平的影响。方法：携带外源基因增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的复制缺陷型腺病毒Ad5-CMV-EGFP（MOI为1或10）单独或联合终质量浓度为0．2、2、20、40、80、100和200μg／ml的依托泊苷感染体外培养的肿瘤细胞NCI-H446（人非小细胞肺癌细胞株）、A549（人肺腺癌细胞株）、SMMC-7721（人肝癌细胞株）、SGC7901（人胃癌细胞株）、SKBR-3（人乳腺癌细胞株）和BTT（小鼠膀胱移行上皮癌细胞株）后不同时间，流式细胞仪分析肿瘤细胞EGFP阳性率和平均荧光强度，Western blotting检测EGFP蛋白表达，RT—PCR和实时荧光定量PCR检测肿瘤细胞内EGFP的mRNA表达量和DNA拷贝数。结果：不同剂量的依托泊苷可不同程度地提高Ad5-CMV-EGFP在7种肿瘤细胞内的表达水平，但对EGFP阳性率无明显提高。10 MOI的Ad5-CMV-EGFP联合40μg／ml依托泊苷分别感染肿瘤细胞NCI-H446、NCI-H460、A549、SMMC-7721、SGC7901、SKBR-3和BTT 24h后，细胞内EGFP的荧光强度分别是单独感染的3．3、3．5、3．1、6．2、7．0、5．4和3．4倍。Ad5-CMV-EGFP联合应用依托泊苷后肿瘤细胞内EGFP蛋白表达增加2～5倍，EGFP mRNA表达量提高，但DNA拷贝数未见明显改变。结论：依托泊苷可提高腺病毒载体介导的外源基因在肿瘤细胞内的表达水平，该作用可能是在转录水平上发挥作用的。 展开更多

关键词 复制缺陷型腺病毒 依托泊苷 肿瘤 基因表达

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抗HBc-ScFv基因复制缺陷型腺病毒载体的构建及其体外表达 被引量：2

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作者 汤正好 马会慧 +3 位作者 臧国庆 余永胜 李刚 姚集鲁 《世界华人消化杂志》 CAS 北大核心 2005年第6期734-738,共5页

目的:构建表达抗乙型肝炎病毒核心蛋白单链抗体(抗HBc ScFv)的复制缺陷型腺病毒载体,并检测其能否在真核细胞中有效表达目的基因. 方法:采用DNA重组技术将特异性人源性抗卜HBc单链抗体基因克隆于腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV,与5 型腺病... 目的:构建表达抗乙型肝炎病毒核心蛋白单链抗体(抗HBc ScFv)的复制缺陷型腺病毒载体,并检测其能否在真核细胞中有效表达目的基因. 方法:采用DNA重组技术将特异性人源性抗卜HBc单链抗体基因克隆于腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV,与5 型腺病毒骨架质粒pAdeasy-1共转染B15183细菌,经细菌内同源重组产生携带抗HBc ScFv基因的重组腺病毒载体pAd—ScFV,经脂质体法转染293细胞,包装产生携带抗HBc scFv基因的重组腺病毒Ad—scFv,体外转染HepG2细胞,PCR和ELISA法检测目的基因及其表达. 结果:构建了表达抗HBc ScFv基因的复制缺陷型腺病毒,病毒滴度达4×1015 PFU/L,并能在真核细胞中有效表达目的基因. 结论:成功构建表达抗HBc ScFv的复制缺陷型腺病毒载体,为进一步开展抗HBc ScFv在抗HBV基因治疗中的作用研究提供实验基础. 展开更多

关键词 缺陷型腺病毒载体 体外表达 基因复制 人源性抗HBc单链抗体 ScFv基因 复制缺陷型腺病毒 ELISA法检测 DNA重组技术 重组腺病毒载体 HepG2细胞 病毒核心蛋白 目的基因 构建表达 真核细胞 293细胞 乙型肝炎 穿梭质粒 基因克隆

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γ干扰素转基因表达对过敏小鼠模型的治疗作用及其机制研究 被引量：3

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作者 陈彬 高占成 《中华结核和呼吸杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第5期315-319,共5页

目的通过腺病毒载体介导小鼠γ干扰素(mIFNγ)在小鼠肺脏转基因表达,探讨其对卵白蛋白(OVA)诱导过敏小鼠模型的治疗作用及其机制。方法48只BALB/c小鼠,按随机数字表法分为7组,即阴性对照组(A组)、过敏模型组Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组(B、D和F组)、... 目的通过腺病毒载体介导小鼠γ干扰素(mIFNγ)在小鼠肺脏转基因表达,探讨其对卵白蛋白(OVA)诱导过敏小鼠模型的治疗作用及其机制。方法48只BALB/c小鼠,按随机数字表法分为7组,即阴性对照组(A组)、过敏模型组Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组(B、D和F组)、转基因治疗组Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组(C、E和G组)。除A组外,B、C、D、E、F、G各组在第0天和第5天经腹腔给予OVA(每只15μg)致敏,第12～14天经气道吸入0.5%的OVA雾化液激发(20ml/次),建立过敏模型。第15天C、E、G组小鼠经鼻滴入50μl带有mIFNγ基因的复制缺陷型腺病毒(AdCMVmIFNγ)悬液[每只5×109/空斑形成单位(PFU)],A、B、D、F组小鼠经鼻滴入50μl生理盐水作为对照。第18天处死A、B、C组小鼠,第21天处死D和E组小鼠,第25天处死F和G组小鼠,获取支气管肺泡灌洗液(BALF)进行细胞分类计数,其上清液用酶联免疫吸附法测定mIFNγ的浓度,右肺用4%多聚甲醛固定及苏木精伊红(HE)染色,左肺组织提取总RNA,用半定量逆转录聚合酶链反应(RTPCR)了解肺组织中白细胞介素4(IL4)、IL-5、IL-6、IL-10、IL1-2、IL13和IL18的表达。结果(1)经鼻给予AdCMVmIFN-γ后,BALF中可测得mIFNγ的高效表达,C组第3天为(729.0±104.7)pg/ml,E组第6天为(984.5±119.1)pg/ml,G组第10天为(310.6±59.7)pg/ml。(2)B、C、D、 展开更多

关键词 转基因表达 治疗作用 小鼠模型 Γ干扰素 逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR) 过敏 机制研究 IFN-γ IL-10 IL-12 IL-13 BALB/C小鼠 复制缺陷型腺病毒 支气管肺泡灌洗液 MRNA丰度 腺病毒载体介导 酶联免疫吸附法 IL-18 空斑形成单位

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人肝细胞生长因子重组腺病毒的构建及其对人胎肝细胞细胞周期的影响 被引量：2

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作者 林勇 谢渭芬 +5 位作者 张忠兵 张新 陈伟忠 陈岳祥 张兴荣 程志红 《中华消化杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第6期336-339,共4页

目的　利用AdEasy系统构建人肝细胞生长因子 (HGF)复制缺陷型重组腺病毒 (AdHGF) ,并观察其对人胎肝细胞细胞周期的影响。方法　将质粒 pUCHGF扩增、酶切获得人HGFcDNA片段 ,插入腺病毒穿梭载体质粒 pAdTrack巨细胞病毒 (CMV )启动子下... 目的　利用AdEasy系统构建人肝细胞生长因子 (HGF)复制缺陷型重组腺病毒 (AdHGF) ,并观察其对人胎肝细胞细胞周期的影响。方法　将质粒 pUCHGF扩增、酶切获得人HGFcDNA片段 ,插入腺病毒穿梭载体质粒 pAdTrack巨细胞病毒 (CMV )启动子下游 ,构建重组穿梭载体pAdTrack CMV HGF ,线性化后与骨架载体AdEasy 1在细菌BJ5 183内同源重组得到腺病毒质粒 pAdHGF ,经 2 93细胞包装后得到复制缺陷型重组腺病毒AdHGF ;将AdHGF体外感染人胎肝细胞 ,以RT PCR检测HGF在胎肝细胞的表达 ;同时通过流式细胞仪测定AdHGF对胎肝细胞细胞周期的作用。结果　连接、重组后通过酶切和测序法筛选出pAdHGF ;经 2 93细胞包装 ,3d后观察到绿色荧光蛋白 (GFP)明显表达 ,氯化铯梯度离心纯化最终获得约 4× 10 10 efu/ml滴度的重组病毒 ;AdHGF体外感染人胎肝细胞 3d后 ,HGF表达明显增加 ,流式细胞仪检测结果显示感染后的胎肝细胞由G0 /G1期向S期和G2 /M期转化。结论　利用新型腺病毒载体AdEasy系统可在短期内制备同时表达GFP和HGF的重组腺病毒Ad HGF ;AdHGF体外感染胎肝细胞可显著提高HGF的表达并促进肝细胞增殖 ,这将为肝细胞移植和基因治疗肝纤维化提供新的手段。 展开更多

关键词 肝纤维化 人肝细胞生长因子 缺陷型重组腺病毒 基因治疗 绿色荧光蛋白

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MDA-7基因的腺病毒载体构建及对肺腺癌A549细胞凋亡的影响 被引量：3

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作者 李书华 龙捷 +2 位作者 王红艳 谢晓斌 张雅洁 《现代医药卫生》 2014年第13期1929-1932,共4页

目的构建一种由腺病毒AdMax包装系统表达目的基因——黑色素瘤分化相关基因-7(MDA-7)的复制缺陷型腺病毒,并初步探索其抗肿瘤活性。方法通过基因操作技术将目的基因(MDA-7)插入到5型腺病毒AdMax包装系统的E1A区域,构建复制缺陷型腺病毒A... 目的构建一种由腺病毒AdMax包装系统表达目的基因——黑色素瘤分化相关基因-7(MDA-7)的复制缺陷型腺病毒,并初步探索其抗肿瘤活性。方法通过基因操作技术将目的基因(MDA-7)插入到5型腺病毒AdMax包装系统的E1A区域,构建复制缺陷型腺病毒Ad.hMDA-7-EGFP;同时构建对照病毒Ad.EGFP。病毒滴度计算按寇化法(Karber法)进行腺病毒感染性滴度(TCID50)测定。应用免疫组化染色法检测MDA-7在感染2种病毒的肺腺癌A549细胞中的表达状态;通过二苯甲亚胺-碘化丙啶(Hoechst33342-PI)双染色法及流式细胞仪检测2种病毒对肿瘤细胞杀伤的差异。结果成功构建携带目的基因的腺病毒载体,经聚合酶链反应(PCR)鉴定正确;MDA-7在感染Ad.hMDA-7-EGFP的肺腺癌A549细胞中表达,以相同感染复数(MOI)值感染Ad.EGFP时肺腺癌A549细胞中未检测到MDA-7表达;Ad.hMDA-7-EGFP对肿瘤细胞株杀伤能力明显高于Ad.EGFP。结论成功构建复制缺陷型腺病毒Ad.hMDA-7-EGFP,并证实MDA-7蛋白在肿瘤细胞中过表达,诱导肺腺癌A549细胞株发生凋亡。 展开更多

关键词 病毒复制 基因疗法 肿瘤/治疗 复制缺陷型腺病毒 AdMax包装系统

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Ad—PSMA转染树突状细胞与细胞因子诱导的杀伤细胞共培养抗前列腺癌的实验研究 被引量：3

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作者 王可兵 高新 +2 位作者 夏宏辉 李文杰 方建明 《中华泌尿外科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第2期132-133,共2页

我们前期成功构建了携带前列腺特异性膜抗原基因的复制缺陷型腺病毒Ad-PSMA，本研究将Ad-PSMA转染树突状细胞（DC）与细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）共培养，评价效应细胞抗前列腺癌（PCa）的生物学效应。

关键词 细胞因子诱导的杀伤细胞 抗前列腺癌 细胞共培养 树突状细胞 实验研究 PSMA 转染 复制缺陷型腺病毒

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表达PCV2 Cap蛋白重组复制缺陷型腺病毒黏膜免疫效果 被引量：2

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作者 邓祖丽颖 刘雨丰 +1 位作者 马宁宁 陈陆 《河南农业科学》 北大核心 2020年第10期143-148,共6页

为研发高效的猪圆环病毒2型(PCV2)黏膜疫苗,通过口服、肌内和滴鼻途径,将表达PCV2 Cap蛋白主要抗原表位的重组复制缺陷型腺病毒(rAd/Cap/518)免疫Balb/c小鼠,同时以无外源基因的空腺病毒(wild-rAd)经滴鼻途径免疫Balb/c小鼠作为对照组,... 为研发高效的猪圆环病毒2型(PCV2)黏膜疫苗,通过口服、肌内和滴鼻途径,将表达PCV2 Cap蛋白主要抗原表位的重组复制缺陷型腺病毒(rAd/Cap/518)免疫Balb/c小鼠,同时以无外源基因的空腺病毒(wild-rAd)经滴鼻途径免疫Balb/c小鼠作为对照组,分别检测小鼠血清中IgG和唾液、肺部、肠道灌洗液中IgA抗体水平,脾脏T淋巴细胞亚群及相关细胞因子IFN-γ和IL-4的分泌水平以及淋巴结、脾脏和肺组织中PCV2病毒载量,评价其黏膜免疫效果。结果显示,与对照组相比,rAd/Cap/518经肌内途径免疫诱导产生的血清IgG抗体水平显著增加;经滴鼻和口服途径免疫诱导产生的局部黏膜部位IgA抗体水平显著增加。rAd/Cap/518经滴鼻、肌内和口服3种途径免疫诱导产生的CD3+T细胞百分率为46.60%~55.65%,经滴鼻免疫诱导产生的CD3+CD4+T细胞百分率为34.43%~37.29%,经肌内和口服途径免疫诱导产生的CD3+CD4+T细胞百分率为36.35%~41.58%,经滴鼻途径免疫诱导的CD3+CD8+T细胞百分率为12.39%~18.32%,经口服免疫诱导的CD3+CD8+T细胞百分率为16.29%,均显著高于对照组。rAd/Cap/518经滴鼻途径免疫后,能诱导小鼠脾脏和肠系膜淋巴细胞分泌IFN-γ。攻毒后免疫鼠体内病毒载量显著降低。综上,rAd/Cap/518经肌内途径免疫主要诱导全身性免疫应答,经滴鼻和口服途径免疫能诱导全身性和局部黏膜免疫应答,是一种很有前景的黏膜免疫候选疫苗。 展开更多

关键词 猪圆环病毒2型 CAP蛋白 复制缺陷型腺病毒 黏膜免疫 免疫效果

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猪传染性胃肠炎病毒S基因A、D抗原共表达的复制缺陷型重组腺病毒构建及鉴定 被引量：2

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作者 刘文晓 高志强 +4 位作者 蒲静 张伟 刘环 牛建蕊 张鹤晓 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2016年第9期3-6,共4页

通过RT-PCR技术和重叠PCR技术扩增出含有猪传染性胃肠炎病毒S基因的A抗原表位和D抗原表位,构建复制缺陷型腺病毒穿梭质粒。穿梭质粒与腺病毒骨架质粒经PacI线性化之后,共同转染AD-293细胞,获得共表达A、D抗原表位的复制缺陷型重组腺病... 通过RT-PCR技术和重叠PCR技术扩增出含有猪传染性胃肠炎病毒S基因的A抗原表位和D抗原表位,构建复制缺陷型腺病毒穿梭质粒。穿梭质粒与腺病毒骨架质粒经PacI线性化之后,共同转染AD-293细胞,获得共表达A、D抗原表位的复制缺陷型重组腺病毒。经Western Blotting检测,该重组腺病毒能够正确表达目的蛋白基因,而且目的蛋白能够与猪传染性胃肠炎阳性血清反应。本研究结果为猪传染性胃肠炎重组疫苗研发奠定基础。 展开更多

关键词 猪传染性胃肠炎 复制缺陷型腺病毒 疫苗

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金黄色葡萄球菌肠毒素A基因在C57BL/6小鼠淋巴细胞中的表达 被引量：1

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作者 汪宇 陆洪光 +2 位作者 程波 麦跃 余德厚 《中华皮肤科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第5期297-299,共3页

目的通过复制缺陷型腺病毒载体的介导,将金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因转染入C57BL/6小鼠淋巴细胞中,观察基因表达产物对B16细胞的作用。方法通过MTT法直接测定重组腺病毒颗粒感染的淋巴细胞的增殖情况,采用双抗体夹心ABC-ELISA法,测... 目的通过复制缺陷型腺病毒载体的介导,将金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因转染入C57BL/6小鼠淋巴细胞中,观察基因表达产物对B16细胞的作用。方法通过MTT法直接测定重组腺病毒颗粒感染的淋巴细胞的增殖情况,采用双抗体夹心ABC-ELISA法,测定淋巴细胞培养上清液中白介素2的水平。MTT法测定活细胞数目,以了解活化的C57BL/6小鼠淋巴细胞对B16细胞的杀伤效应。结果加入不同滴度的重组腺病毒颗粒后,C57BL/6小鼠淋巴细胞明显增殖;同时淋巴细胞培养上清液中白介素2水平也明显增加。重组腺病毒颗粒转染的C57BL/6小鼠淋巴细胞可明显杀伤B16细胞,效/靶比越高,杀伤效应越明显。结论SEA基因可以在C57BL/6小鼠淋巴细胞中表达,并且表达产物能够活化C57BL/6小鼠淋巴细胞,进而杀伤B16细胞。 展开更多

关键词 C57BL/6小鼠 金黄色葡萄球菌肠毒素 淋巴细胞 细胞培养上清液 C57BL/6小鼠 B16细胞 缺陷型腺病毒载体 基因表达产物 病毒颗粒 MTT法 白介素2 杀伤效应 双抗体夹心 SEA基因 基因转染 直接测定 细胞数目 重组 ABC 增殖 水平

原文传递

降落和重叠延伸PCR构建靶向肿瘤干细胞腺病毒载体及感染实验 被引量：1

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作者 张超 刘国炳 +2 位作者 田平阁 周春平 李学农 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第9期1513-1517,共5页

目的应用降落和重叠延伸PCR法构建对肿瘤干细胞有特异靶向性的高效载体-复制缺陷型腺病毒载体,观察其对CD133+人大肠癌细胞株SW480的感染效率。方法利用重叠延伸PCR技术扩增5型腺病毒纤毛球端HI环两端的基因序列,定向插入真核表达质粒pE... 目的应用降落和重叠延伸PCR法构建对肿瘤干细胞有特异靶向性的高效载体-复制缺陷型腺病毒载体,观察其对CD133+人大肠癌细胞株SW480的感染效率。方法利用重叠延伸PCR技术扩增5型腺病毒纤毛球端HI环两端的基因序列,定向插入真核表达质粒pEGFP-N1中,构建重组质粒pEGFP-N1.KNOB△HI,同时在缺失HI环部位引入EcoRV限制性酶切位点。在此基础上,用降落PCR克隆纤毛基因全长编码区序列,构建出腺病毒穿梭质粒pNEB-F5。利用凝胶图像分析和基因测序验证所构建质粒的正确性。再与pAdEasy-1,pShuttle-GFP在E.coli BJ5183中同源重组,得腺病毒载体Ad5FHI-GFP和Ad5-GFP。用Ad5FHI-GFP和Ad5-GFP分别感染CD133+人大肠癌细胞株SW480,通过荧光显微镜观察感染效率。结果降落PCR和重叠延伸PCR都扩增出特异性条带,测序结果与预期相符。与Ad5-GFP相比,Ad5FHI-GFP对CD133+人大肠癌细胞株SW480有显著提高。结论利用降落和重叠延伸PCR成功构建新型靶向肿瘤干细胞的腺病毒载体,利用降落和重叠延伸PCR成功构建新型靶向肿瘤干细胞的腺病毒载体,其对CD133+人大肠癌细胞株SW480实验显示Ad5FHI-GFP组感染效率明显强于Ad5-GFP组。 展开更多

关键词 降落PCR 重叠延伸PCR 肿瘤干细胞 复制缺陷型腺病毒 穿梭质粒

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腺病毒介导VEGF和HO-1联合治疗缺血随意皮瓣的实验研究 被引量：1

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作者 楼晓莉 陈江萍, 宋建星 《中国美容整形外科杂志》 CAS 2011年第6期381-384,共4页

目的探讨复制缺陷型腺病毒介导的血管内皮生长因子（VEGFl65）和血红素氧化酶（HO—1）联合应用，对提高大鼠超长随意皮瓣成活面积的影响和作用机制。方法将25只健康纯种成年雌性SD大鼠的背部两侧各设计－6cmx1cm大小随意皮瓣。皮瓣远... 目的探讨复制缺陷型腺病毒介导的血管内皮生长因子（VEGFl65）和血红素氧化酶（HO—1）联合应用，对提高大鼠超长随意皮瓣成活面积的影响和作用机制。方法将25只健康纯种成年雌性SD大鼠的背部两侧各设计－6cmx1cm大小随意皮瓣。皮瓣远端皮下分别注射日的基因联合应用组（Ad—VEGFl65＋Ad—HO－1）、基因对照组（Ad—VEGFl65）、基因对照组（Ad—HO—1）、绿色荧光蛋白基因对照组（Ad－11B—GFP）、病毒保存液（Ad—buffer）为空白对照组，共5组。术后7d，分别测量皮瓣的成活面积、HE染色及目的蛋白和CD31免疫组化表达情况及皮瓣新生傲血管密度（MVD）检测等。结果目的基因联合应用组皮瓣成活面积、目的蛋白表达及MVD与其他4组比较，其差异有显著统计学意义（P〈0．01）。结论以复制缺陷型腺病毒为载体，联合应用VEGF和HO－1基因治疗能显著增加大鼠随意皮瓣的成活面积，促进皮瓣存活。 展开更多

关键词 血管内皮生长因子 血红素氧合酶 复制缺陷型腺病毒 基因转染 血管生成

原文传递

sCD80-Linker-sCD40L融合基因腺病毒载体的构建 被引量：1

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作者 魏枫 刘虹 任秀宝 《天津医科大学学报》 2004年第2期200-203,共4页

目的 :构建携带sCD80-Linker -sCD40L融合基因的复制缺陷型腺病毒载体。方法 :在GenBank检索人CD80、CD40L及IL -12b编码基因序列 ,确定扩增区域 ,设计引物。以Trizol抽提人外周血单个核细胞总RNA ,使用RT -PCR方法获得IL -12b信号肽、s... 目的 :构建携带sCD80-Linker -sCD40L融合基因的复制缺陷型腺病毒载体。方法 :在GenBank检索人CD80、CD40L及IL -12b编码基因序列 ,确定扩增区域 ,设计引物。以Trizol抽提人外周血单个核细胞总RNA ,使用RT -PCR方法获得IL -12b信号肽、sCD80、sCD40L等基因的编码序列 ,并分别克隆入T载体。重叠PCR构建sCD80 -Linker -sCD40L融合基因 ,克隆入T载体。使用Stratagene公司AdEasyXLAdenoviralVectorSystem试剂盒构建携带sCD80 -Linker -sCD40L融合基因的复制缺陷型腺病毒载体。结果 :经测序证实 ,正确克隆了人IL -12b信号肽、sCD80、sCD40L编码序列 ,构建了携带sCD80-Linker-sCD40L融合基因的T载体 ,并进一步构建了携带sCD80 -Linker -sCD40L融合基因的复制缺陷型腺病毒载体。本实验病毒滴度为2×1010cfu/ml。结论 :成功构建了携带sCD80 -Linker -sCD40L融合基因的复制缺陷型腺病毒载体。 展开更多

关键词 CD80 CD40L 融合基因 复制缺陷型腺病毒

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