Cys对近红外荧光蛋白PAiRFP1光谱学行为的影响研究

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作者 张玉琴 张芝兰 +2 位作者 许梅 赖大坤 冯娟 《光谱学与光谱分析》 SCIE EI CAS CSCD 北大核心 2023年第S01期275-276,共2页

PAiRFP1是一种以细菌光敏色素为模板,改造得到的光激活荧光蛋白。与其他光激活荧光蛋白相比,它最大的优势是激发、发射都在近红外区域。本论文围绕该蛋白中含有的8个半胱氨酸残基,开展了定点突变、光谱学检测等工作,发现(1)在8个单突变... PAiRFP1是一种以细菌光敏色素为模板,改造得到的光激活荧光蛋白。与其他光激活荧光蛋白相比,它最大的优势是激发、发射都在近红外区域。本论文围绕该蛋白中含有的8个半胱氨酸残基,开展了定点突变、光谱学检测等工作,发现(1)在8个单突变体中,仅有Cys-29突变改善了光激活蛋白的分子亮度,其它突变都削弱了近红外荧光;(2)伴随着环境氧化、还原条件的改变,C29S突变近红外荧光显著降低,这说明该位点的半胱氨酸残基对于维持该近红外荧光蛋白在氧化还原环境中的稳定性具有重要作用,相关机理尚待深入研究。 展开更多

关键词 细菌光敏色素 近红外荧光蛋白 定点突变

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集胞藻PCC6803细菌光敏色素体外重组和光化学活性研究 被引量：4

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作者 董依然 冉勇 +1 位作者 赵开弘 周明 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第2期238-244,共7页

采用聚合酶链式反应 (PCR)从集胞藻PCC680 3总DNA中扩增出细菌光敏色素全片段cph1及cph1(C 43 5) ,克隆于pBluescriptSK(+ ) ,然后插入表达载体pET3 0a进行高效表达。获得的脱辅基蛋白Cph1、Cph1(C 43 5)在合适的缓冲体系下分别与藻蓝胆... 采用聚合酶链式反应 (PCR)从集胞藻PCC680 3总DNA中扩增出细菌光敏色素全片段cph1及cph1(C 43 5) ,克隆于pBluescriptSK(+ ) ,然后插入表达载体pET3 0a进行高效表达。获得的脱辅基蛋白Cph1、Cph1(C 43 5)在合适的缓冲体系下分别与藻蓝胆素 (PCB)进行体外重组。光化学研究表明 ,两种脱辅基蛋白都能与PCB进行正确的重组 ,重组产物表现出 650～ 70 0nm可逆光致变色效应。锌电泳证实得到的细菌光敏色素辅基色素为PCB 。 展开更多

关键词 集胞藻 PCC6803 细菌光敏色素 体外重组 光化学活性 DNA 克隆 表达 藻蓝胆素 PCB

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体外重组细菌光敏色素AphA修饰sBLM的光响应 被引量：1

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作者 冉勇 周明 赵开弘 《华中师范大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 2005年第1期84-87,共4页

通过体外重组获得了鱼腥藻Anabaenasp.PCC7120细菌光敏色素AphA,进而将其对金属支撑型BLM进行修饰.实验发现,细菌光敏色素修饰的BLM对于红光(650nm)和远红光(700nm)具有不同的光响应信号.当用远红光照射时,产生一个正向的电流响应,用红... 通过体外重组获得了鱼腥藻Anabaenasp.PCC7120细菌光敏色素AphA,进而将其对金属支撑型BLM进行修饰.实验发现,细菌光敏色素修饰的BLM对于红光(650nm)和远红光(700nm)具有不同的光响应信号.当用远红光照射时,产生一个正向的电流响应,用红光照射时,产生一个反向的电流响应. 展开更多

关键词 细菌光敏色素 sBLM 光响应

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鱼腥藻PCC7120细菌光敏色素缺失突变体的自催化重组研究 被引量：1

4

作者 甘春晖 冉勇 赵开弘 《武汉植物学研究》 CSCD 北大核心 2005年第6期505-510,共6页

采用聚合酶链式反应(PCR)从鱼腥藻PCC 7120 DNA中扩增出细菌光敏色素缺失突变体基因aphA(26-320)、aphA(27-320)、aphA(28-320)、aphA(29-320)和aphA(32-320),利用表达载体pET 30a进行高效表达,获得的A phA缺失突变体脱辅基蛋白在一定... 采用聚合酶链式反应(PCR)从鱼腥藻PCC 7120 DNA中扩增出细菌光敏色素缺失突变体基因aphA(26-320)、aphA(27-320)、aphA(28-320)、aphA(29-320)和aphA(32-320),利用表达载体pET 30a进行高效表达,获得的A phA缺失突变体脱辅基蛋白在一定的反应体系下与藻蓝胆素进行了体外重组的研究。研究表明:A phA(26-320)体外重组获得的色素蛋白具有与植物光敏色素相似的可逆光致变色效应,同时酸性尿素变性实验和Zn2+荧光电泳实验显示藻蓝胆素和以上蛋白质发生共价连接。A phA(26-320)与藻蓝胆素重组产物的P r/P fr吸收峰处于660/610nm。其他4个缺失突变体,A phA(27-320)、A phA(28-320)、A phA(29-320)、A phA(32-320)和藻蓝胆素的重组产物中则没有发现可逆光致变色信号,表明这些缺失突变体不能和藻蓝胆素发生自催化重组。维系细菌光敏色素A phA与色素自催化连接的裂合酶结构域位于A phA(26-320)包含的肽链之中。 展开更多

关键词 细菌光敏色素 聚合酶链式反应(PCR) 缺失突变体 体外重组

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细菌光敏色素PCB-AphA(26-320)体内重组与条件优化 被引量：1

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作者 陈思礼 苏平 +1 位作者 胡勋 周明 《华中师范大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 2008年第4期606-611,共6页

为验证鱼腥藻PCC7120细菌光敏色素脱辅基蛋白AphA（26—320）与藻蓝胆素（PCB）异源体内重组的可行性，并获取光化学活性高、表达量大的细菌光敏色素，通过多个目的蛋白在单个大肠杆菌细胞体内共表达的方式，促使鱼腥藻PCC7120细菌光敏... 为验证鱼腥藻PCC7120细菌光敏色素脱辅基蛋白AphA（26—320）与藻蓝胆素（PCB）异源体内重组的可行性，并获取光化学活性高、表达量大的细菌光敏色素，通过多个目的蛋白在单个大肠杆菌细胞体内共表达的方式，促使鱼腥藻PCC7120细菌光敏色素脱辅基蛋白AphA（26—320）与藻蓝胆素（PCB）的在异源细胞内进行自催化连接．吸收光谱所产生的可逆光致变色效应显示，AphA（26—320）与藻蓝胆素进行了正确的体内重组，AphA（26—320）脱辅基蛋白与藻蓝胆素在体内完成了自催化共价连接；在此过程中还发现：在生长浓度达到OD600=0．6时，冰浴30min，一次性加入终浓度为1mmol／L的IPTG，于30℃，摇床速度为100r／min的条件下诱导表达12～15h可取得较好的效果． 展开更多

关键词 细菌光敏色素 体内重组 自催化连接 表达条件

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细菌光敏色素AphA的克隆表达及重组新方法

6

作者 冉勇 周明 赵开弘 《华中科技大学学报（自然科学版）》 EI CAS CSCD 北大核心 2005年第5期114-117,共4页

通过PCR技术,从蓝藻PCC7120中扩增出细菌光敏色素AphA的基因aphA,进而构建aphA的缺失突变体aphA(N25/C445).二者分别转入表达载体pET30a中,在宿主菌中获得高效表达,获得的脱辅基蛋白与CpcA进行体外重组.在本体外重组体系中,以藻蓝蛋白... 通过PCR技术,从蓝藻PCC7120中扩增出细菌光敏色素AphA的基因aphA,进而构建aphA的缺失突变体aphA(N25/C445).二者分别转入表达载体pET30a中,在宿主菌中获得高效表达,获得的脱辅基蛋白与CpcA进行体外重组.在本体外重组体系中,以藻蓝蛋白α亚基(CpcA),在光敏色素自身作用或者藻蓝蛋白裂合酶的帮助下从CpcA上捕获胆色素完成重组.藻蓝蛋白裂合酶CpcE/F能很大程度增强光敏色素脱辅基蛋白从CpcA夺取PCB的能力.该结果对于研究细菌光敏色素的色素来源及生理生化机理都具有重要意义. 展开更多

关键词 细菌光敏色素 体外重组 藻蓝蛋白 藻蓝蛋白裂合酶

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蓝藻细菌光敏色素AphA(26-320)的体内重组与摇瓶发酵优化

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作者 赵金梅 胡勋 赵开弘 《韶关学院学报》 2008年第9期88-91,共4页

将蓝藻PCC7120细菌光敏色素缺失突变体AphA(26-320)基因和血红素氧化酶(ho1)及胆绿素还原酶(PcyA)的基因共同转化E.Coli BL21(DE3),在IPTG的诱导下实现体内共同表达,进行体内重组,生成了具有可逆光致变色活性的AphA(26-320)-PCB.对重组... 将蓝藻PCC7120细菌光敏色素缺失突变体AphA(26-320)基因和血红素氧化酶(ho1)及胆绿素还原酶(PcyA)的基因共同转化E.Coli BL21(DE3),在IPTG的诱导下实现体内共同表达,进行体内重组,生成了具有可逆光致变色活性的AphA(26-320)-PCB.对重组菌的培养条件,诱导条件进行优化,确定适合合成AphA(26-320)-PCB的培养时间,诱导温度,摇床振荡速度等. 展开更多

关键词 细菌光敏色素 体内重组 诱导表达 优化

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运用二维相关光谱手段研究Atto495荧光探针标记的细菌光敏色素

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作者 胡奇洲 冯娟 《光谱学与光谱分析》 SCIE EI CAS CSCD 北大核心 2016年第S1期425-426,共2页

细菌光敏色素是一类含有胆绿素BV分子、对红光和远红光具有响应的色素-蛋白复合物。本文在采用Atto495分子对细菌光敏色素同源二聚体进行荧光标记的基础上,借助二维相关光谱手段分析了SDS对于结合到蛋白中的Atto495荧光发射谱的影响,发... 细菌光敏色素是一类含有胆绿素BV分子、对红光和远红光具有响应的色素-蛋白复合物。本文在采用Atto495分子对细菌光敏色素同源二聚体进行荧光标记的基础上,借助二维相关光谱手段分析了SDS对于结合到蛋白中的Atto495荧光发射谱的影响,发现除了非特异性结合,Atto495可以与Cys20以及其它区域的Cys结合。相关工作为后续分析光转换过程中的蛋白结构的变化奠定了基础。 展开更多

关键词 细菌光敏色素 荧光标记 二维相关光谱

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一种近红外荧光蛋白PAiRFP1及其突变体V276G的光活化效率研究

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作者 白英男 冯娟 +3 位作者 胡奇洲 吴清勤 周雨 刘贻尧 《光谱学与光谱分析》 SCIE EI CAS CSCD 北大核心 2017年第11期3379-3385,共7页

PAiRFP1是一种以根癌农杆菌中细菌光敏色素Agp2为基础,经过蛋白工程手段改造后获得的近红外荧光蛋白。与其他近红外荧光蛋白不同,PAiRFP1具有光活化行为。这一特性可以有效改善近红外荧光蛋白在体内的成像信噪比。然而,关于光活化行为... PAiRFP1是一种以根癌农杆菌中细菌光敏色素Agp2为基础,经过蛋白工程手段改造后获得的近红外荧光蛋白。与其他近红外荧光蛋白不同,PAiRFP1具有光活化行为。这一特性可以有效改善近红外荧光蛋白在体内的成像信噪比。然而,关于光活化行为的影响因素却研究甚少。主要采用荧光光谱学手段研究了PAiRFP1蛋白浓度、pH、金属离子、氧化还原环境对于PAiRFP1光活化行为的影响,结果发现:(1)PAiRFP1的最大光活化效率与该近红外荧光蛋白的浓度不呈线性关系;(2)随着pH从6.5升高至7.8和9.0,PAiRFP1的最大光活化效率从36.8%提高至52.0%和60.8%;(3)金属离子K^+,Na^+,Ca^(2+)的加入对于PAiRFP1的最大光活化效率没有显著影响;类似现象在H_2O_2和DTT的处理的情况下也被观察到。除了上述影响因素外,还发现当PAiRFP1中276位的缬氨酸被突变为甘氨酸产生V276G突变体后,蛋白的最大光活化效率从~50.0%下降至19.4%。DTT处理后导致V276G突变体最大光活化效率从19.4%提高到了27.1%。此外,比较研究了各种影响因素对于光活化速率的影响。以上结果为今后更好地将此类光激活的近红外蛋白应用于活体成像中提供了更好地理论指导和优化解决方案。 展开更多

关键词 细菌光敏色素 近红外荧光蛋白 光活化效率 突变体

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鱼腥藻细菌光敏色素的分子设计和光化学活性

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作者 李坚 赵开弘 +1 位作者 董依然 孙亚楠 《武汉大学学报（理学版）》 CAS CSCD 北大核心 2005年第6期781-786,共6页

采用PCR技术从鱼腥藻PCC7120中扩增出细菌光敏色素C端分别缺失234和275个氨基酸的突变基因aphA(C-234)、aphA(C-275),克隆于pBluescript SK(+),将前者插入表达载体pET30a进行表达,在后者的N端连接一段跨膜片段(ts),融合基因转入表达载体... 采用PCR技术从鱼腥藻PCC7120中扩增出细菌光敏色素C端分别缺失234和275个氨基酸的突变基因aphA(C-234)、aphA(C-275),克隆于pBluescript SK(+),将前者插入表达载体pET30a进行表达,在后者的N端连接一段跨膜片段(ts),融合基因转入表达载体pGEMD中进行表达.获得的两种脱辅基蛋白在合适的条件下分别与藻蓝胆素(PCB)进行体外重组.光化学研究表明,两种脱辅基蛋白都能与PCB进行正确的重组,重组产物表现出650～700 nm可逆光致变色效应.锌电泳证实与脱辅基蛋白连接的辅基色素为PCB,酸性尿素变性实验证明可逆光致变色效应来源于PCB在不同波长光照下的顺反异构化. 展开更多

关键词 细菌光敏色素 可逆光致变色 体外喧组 基因克隆 基因表达

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蓝细菌光敏色素的分子结构、生物合成和可逆光致变色效应 被引量：1

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作者 马琼 周志 +1 位作者 董静洲 周明 《植物科学学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第5期522-530,共9页

蓝细菌光敏色素(CBCRs)是蓝细菌中感受光的重要光受体,能够响应从紫外光到红外光范围内的光信号,进而影响蓝细菌的光化学行为。蓝细菌光敏色素通过N-末端GAF(cGMP phosphodiesterase,adenylyl cyclase and FhlA domain)结构域中保守性... 蓝细菌光敏色素(CBCRs)是蓝细菌中感受光的重要光受体,能够响应从紫外光到红外光范围内的光信号,进而影响蓝细菌的光化学行为。蓝细菌光敏色素通过N-末端GAF(cGMP phosphodiesterase,adenylyl cyclase and FhlA domain)结构域中保守性半胱氨酸共价结合藻胆色素,形成具有感光生理功能的色素蛋白质。本文重点在分子水平上综述了蓝细菌光敏色素的分子结构、生物合成和可逆光致变色效应机理,并基于最新的研究进展,就蓝细菌光敏色素今后的研究方向进行了展望。 展开更多

关键词 蓝细菌光敏色素 藻胆色素 GAF 光受体

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蓝细菌光敏色素Alr1966GAF2及其突变体的表达与光化学性质研究

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作者 马琼 向建伟 +3 位作者 牟若兰 邓腊青 王运 周明 《植物科学学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第4期551-557,共7页

采用PCR技术从鱼腥藻(Anabaena sp.PCC7120)中扩增蓝细菌光敏色素基因片段alr1966gaf2,将alr1966gaf2插入到pET-30a(+)载体中,构建表达质粒pET-alr1966gaf2。最后将Alr1966GAF2与HO1、PcyA在E.coli BL21(DE3)中共表达获得色素蛋白Alr196... 采用PCR技术从鱼腥藻(Anabaena sp.PCC7120)中扩增蓝细菌光敏色素基因片段alr1966gaf2,将alr1966gaf2插入到pET-30a(+)载体中,构建表达质粒pET-alr1966gaf2。最后将Alr1966GAF2与HO1、PcyA在E.coli BL21(DE3)中共表达获得色素蛋白Alr1966GAF2,并对该蛋白的光化学性质进行分析。结果显示,色素蛋白Alr1966GAF2结合色素为藻蓝胆素(phycoerythrobilin,PCB)或藻紫胆素(phycoviolobilin,PVB),在3种不同吸收态15Z-P428 nm、中间态和15E-P514 nm之间具有顺序可逆光效应。通过定点突变技术将DXCF基序中的保守性Cys突变为Ala,获得了突变体Alr1966GAF2(C72A)。将Alr1966GAF2(C72A)与HO1、PcyA共表达,获得色素蛋白Alr1966GAF2(C72A)。研究结果表明Alr1966GAF2(C72A)结合色素为PCB,Alr1966GAF2(C72A)-PCB具有较强的荧光活性,其荧光量子的产率高达0.11。Alr1966GAF2(C72A)不仅能够共价结合PCB,还可以结合胆绿素(Biliverdin,BV),均具有较强的红色荧光活性。 展开更多

关键词 蓝细菌光敏色素 顺序可逆光效应 红色荧光蛋白 胆绿素

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嗜热藻BP-1中几个蓝细菌光敏色素结构域体内重组及光化学性质研究

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作者 刘冰冰 陈煜 +2 位作者 邓明刚 赵开弘 周明 《植物科学学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第2期178-185,共8页

通过蛋白质序列同源性比对分析,在嗜热藻(Thermosynechococcus elongatus BP-1)里面找到了与已知的Pb/Pg型蓝细菌光敏色素TePixJ和TeTlr0924同源的3个基因tlr0911、tlr1215和tlr1999。通过分子克隆技术把它们的GAF结构域分别构建在pET30... 通过蛋白质序列同源性比对分析,在嗜热藻(Thermosynechococcus elongatus BP-1)里面找到了与已知的Pb/Pg型蓝细菌光敏色素TePixJ和TeTlr0924同源的3个基因tlr0911、tlr1215和tlr1999。通过分子克隆技术把它们的GAF结构域分别构建在pET30a(+)表达载体上,与可生成藻蓝胆素(PCB)的质粒pACYCDuet-ho1-pcyA在大肠杆菌BL21(DE3)体内重组,生成重组蛋白,利用亲和层析柱分离纯化,纯化后的蛋白质经过锌荧光和蛋白质酸性尿素变性以及荧光光谱和吸收光谱等实验分析鉴定,结果表明,Tlr0911-GAF存在蓝光吸收态Pb406 nm和绿光吸收态Pg527 nm之间的可逆光转换,它可共价结合两种藻胆色素,即藻紫胆素(PVB)和藻蓝胆素(PCB),Tlr1999-GAF则存在蓝光吸收态Pb417 nm和青光吸收态Pt496 nm之间的可逆光转换,它同样共价结合PVB和PCB,而Tlr1215-GAF1和Tlr1215-GAF2不能自发结合藻胆色素,不具有光活性。 展开更多

关键词 蓝细菌光敏色素 可逆光转换 体内重组

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