荧光蛋白报告载体观察刚地弓形虫SAGl、MIC3、ROP2鸡尾酒DNA疫苗的表达及其免疫原性的研究 被引量：6

1

作者 王燕娟 曹建平 +2 位作者 孙雅雯 徐馀信 沈玉娟 《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2015年第5期368-371,376,共5页

目的构建能同时表达多个基因的刚地弓形虫DNA鸡尾酒疫苗并初步观察其免疫原性。方法从基因组DNA扩增刚地弓形虫表面抗原(surface antigen,SAG)、微线体蛋白(microneme,MIC)和棒状体蛋白(rhoptry protein,ROP)基因片段,克隆到真核荧光表... 目的构建能同时表达多个基因的刚地弓形虫DNA鸡尾酒疫苗并初步观察其免疫原性。方法从基因组DNA扩增刚地弓形虫表面抗原(surface antigen,SAG)、微线体蛋白(microneme,MIC)和棒状体蛋白(rhoptry protein,ROP)基因片段,克隆到真核荧光表达载体pShuttle-CMV-MCS-EF1α-Am Cyan,pLVX-IRES-Zsgreen及pLVX-IRES-rfp中,构建pShuttle-SAG1,pLVX-Zsgreen-MIC3和pLVX-rfp-ROP2表达质粒。通过聚乙烯亚胺法用混合质粒转染293F细胞48 h,荧光显微镜下观察3个基因的表达情况。将30只C57BL/6雄性小鼠随机分为A、B、C组,分别肌内注射生理盐水(50μl)、pShuttle+pLVX-Zsgreen+pLVX-rfp混合空质粒(2μg/μl,各17μl)、pShuttle-SAG1+pLVX-Zsgreen-MIC3+pLVX-rfp-ROP2混合重组质粒(2μg/μl,各17μl)。免疫28 d后,ELISA检测血清抗刚地弓形虫IgG抗体水平,初步评价该疫苗的免疫原性。结果从刚地弓形虫基因组成功扩增出1、1.1及1.7 kb的SAG1、MIC3和ROP2序列。成功构建了pShuttle-SAG1、pLVX-Zsgreen-MIC3和pLVX-rfp-ROP2真核荧光表达质粒,转染293F细胞后观察到相应的蓝、绿、红报告荧光。免疫小鼠后28 d,ELISA测得A、B、C组IgG抗体的吸光度(A450值)分别为(0.620±0.029)、(0.741±0.040)、(1.561±0.131),C组显著高于A、B组(P<0.01)。结论刚地弓形虫SAG1、MIC3和ROP2基因混合重组质粒组成的DNA鸡尾酒疫苗能诱导小鼠产生良好的免疫原性,且多个荧光蛋白真核表达载体能够较好地指示目的基因的表达。 展开更多

关键词 刚地弓形虫 基因重组 表面抗原 微线体蛋白 棒状体蛋白 鸡尾酒疫苗 免疫原性

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弓形虫微线体蛋白的研究进展 被引量：5

2

作者 郑斌 詹希美 《国外医学（寄生虫病分册）》 2005年第5期200-204,共5页

弓形虫入侵宿主细胞是多步骤的过程。首先是虫体识别、黏附宿主细胞,然后虫体穿透入细胞完成入侵过程。当虫体与细胞接触时,微线体蛋白释放到虫体外,一部分微线体蛋白具有与真核细胞黏附分子相似的结构域———黏附区域,通过不同的黏附... 弓形虫入侵宿主细胞是多步骤的过程。首先是虫体识别、黏附宿主细胞,然后虫体穿透入细胞完成入侵过程。当虫体与细胞接触时,微线体蛋白释放到虫体外,一部分微线体蛋白具有与真核细胞黏附分子相似的结构域———黏附区域,通过不同的黏附区域,微线体蛋白发挥其识别、黏附宿主细胞的作用;另一部分微线体蛋白不含黏附区域,但在虫体不同阶段表达量存在差异,可作为诊断抗原来鉴定急性和隐性弓形虫病。该文对已发现的微线体蛋白的基因序列、蛋白结构及特性作一综述。 展开更多

关键词 弓形虫 微线体蛋白 蛋白结构 基因序列 黏附区域

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弓形虫微线体蛋白研究新进展 被引量：4

3

作者 任娣 袁子国 剡海阔 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2011年第4期206-209,共4页

微线体蛋白(microneme protein,MIC)是由位于弓形虫前端的微线体(microneme)分泌产生的,具有识别、黏附与侵染宿主细胞的性质。近年来研究结果证明,弓形虫的多种微线体蛋白在侵染宿主的过程中发挥重要作用,并且可以作为抗弓形虫病的疫... 微线体蛋白(microneme protein,MIC)是由位于弓形虫前端的微线体(microneme)分泌产生的,具有识别、黏附与侵染宿主细胞的性质。近年来研究结果证明,弓形虫的多种微线体蛋白在侵染宿主的过程中发挥重要作用,并且可以作为抗弓形虫病的疫苗候选分子。作者对目前研究较多的弓形虫微线体蛋白进行综述,为弓形虫疫苗的研究提供理论依据。 展开更多

关键词 弓形虫 微线体蛋白 疫苗

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应用重组抗原诊断弓形虫病的研究进展 被引量：2

4

作者 王卫艳 黄炳成 《中华诊断学电子杂志》 2014年第2期59-63,共5页

随着分子生物学的发展，对弓形虫重组抗原的研究取得了一系列的进展，多种弓形虫抗原基因通过基因工程手段得以表达并应用于弓形虫防治研究，这些抗原包括膜表面抗原（surface antigen，SAGs）、致密颗粒蛋白（dense granule proteins，... 随着分子生物学的发展，对弓形虫重组抗原的研究取得了一系列的进展，多种弓形虫抗原基因通过基因工程手段得以表达并应用于弓形虫防治研究，这些抗原包括膜表面抗原（surface antigen，SAGs）、致密颗粒蛋白（dense granule proteins，GRAs）、棒状颗粒蛋白（rhoptry proteins，ROPs）、微线体蛋白（microneme proteins，MICs）以及基质抗原等。 展开更多

关键词 弓形虫病 抗原诊断 重组抗原 应用 致密颗粒蛋白 分子生物学 膜表面抗原 微线体蛋白

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弓形虫4个假定蛋白基因缺失株的构建及其基本生物功能学研究 被引量：1

5

作者 王沛 王萌 +3 位作者 李婷婷 郑晓楠 梁勤立 陈小庆 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第10期3598-3608,共11页

旨在探究4个与MIC相关的假定蛋白在弓形虫速殖子阶段的作用及基因缺失对毒力的影响。在线设计TGME49_222975、TGME49_275798、TGME49_238220和TGME49_238210的sgRNA序列,用PCR将pSAG1::CAS9-U6::sgUPRT模板上的sgUPRT突变为相应的sgRNA... 旨在探究4个与MIC相关的假定蛋白在弓形虫速殖子阶段的作用及基因缺失对毒力的影响。在线设计TGME49_222975、TGME49_275798、TGME49_238220和TGME49_238210的sgRNA序列,用PCR将pSAG1::CAS9-U6::sgUPRT模板上的sgUPRT突变为相应的sgRNA,获得目的基因的CRISPR质粒。将获得的目的基因质粒和DHFR片段混合后电转入弓形虫速殖子,经乙胺嘧啶单克隆筛选后,PCR鉴定成功即得目的基因缺失株。再用目的基因缺失株和RH野生株进行复制、逸出、噬斑和小鼠毒力试验,比较二者各项试验结果,以评定目的基因对于弓形虫速殖子功能和毒力的影响。结果显示:目的基因缺失株和野生株RH在相同时间内形成的含有1、2、4、8、16个速殖子的纳虫空泡数占比差异不显著(P>0.05),纳虫空泡内速殖子在钙离子刺激下2 min内均可全部逸出,相同条件和时间培养形成的噬斑大小和面积差异不显著(P>0.05),接种相同数目速殖子的小鼠自开始死亡到全部死亡时间差别不显著(P>0.05)。本研究成功构建了4个弓形虫MIC相关基因的缺失株(RHΔTGME49_222975、RHΔTGME49_275798、RHΔTGME49_238200和RHΔTGME49_238210),但毒力与野生株毒力均差异不显著,说明这4个基因均不是弓形虫的重要“独立”毒力因子,但可能在其他方面发挥着重要的生物学功能。本研究初步解析了4个弓形虫MIC相关蛋白的基本生物学功能,为后期全面解析弓形虫蛋白功能提供数据。 展开更多

关键词 弓形虫 微线体蛋白 CRISPR/Cas9 基因敲除

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弓形虫微线体蛋白6,7,8与宿主Spata3,Dkk2蛋白相互作用的研究 被引量：1

6

作者 刘卿 李法财 +3 位作者 杨文彬 刘国华 赵权 朱兴全 《经济动物学报》 CAS 2017年第2期68-74,共7页

为了研究弓形虫微线体蛋白6(MIC6)、7(MIC7)及8(MIC8)是否与宿主精子生成相关蛋白3(Spata3)和Dickkopf相关蛋白2(Dkk2)互作,首先从弓形虫RH虫株cDNA中扩增了弓形虫MIC6、MIC7及MIC8基因,并从小鼠cDNA中扩增了Spata3和Dkk2基因。然后分... 为了研究弓形虫微线体蛋白6(MIC6)、7(MIC7)及8(MIC8)是否与宿主精子生成相关蛋白3(Spata3)和Dickkopf相关蛋白2(Dkk2)互作,首先从弓形虫RH虫株cDNA中扩增了弓形虫MIC6、MIC7及MIC8基因,并从小鼠cDNA中扩增了Spata3和Dkk2基因。然后分别构建pGADT7-MIC6、pGADT7-MIC7和pGADT7-MIC8捕获载体及pGBKT7-Spata3和pGBKT-Dkk2诱饵载体。利用Clon Tech公司的MatchmakerTM Gold Yeast Two-Hybrid系统,将诱饵载体分别转化Y2HGold酵母菌,将捕获载体分别转化Y187酵母菌,最后通过酵母点对点验证分析弓形虫MIC6、MIC7和MIC8蛋白是否与宿主Spata3和Dkk2蛋白互作。结果表明:在酵母双杂交系统里MIC7和MIC8蛋白分别能够与宿主Spata3和Dkk2蛋白互作,而MIC6不能够与宿主Spata3和Dkk2蛋白互作。 展开更多

关键词 弓形虫 微线体蛋白 蛋白互作 Spata3 Dkk2

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载体介导的艾美耳球虫微线体蛋白疫苗的研制现状

7

作者 李文桂 陈雅棠 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2022年第7期848-851,共4页

艾美耳球虫是鸡球虫病的病原体,疫苗研发是当前的热点领域之一。微线体蛋白免疫原性良好,本研究就卡介苗(rBCG-AMA1/RB)、乳酸乳球菌(rLL-AMA1)、植物乳杆菌(rLp-EtMIC1/EtMIC2/TA4-AMA1)、鼠伤寒沙门氏菌(rSt-5401/EnMIC2/MIC5)、根癌... 艾美耳球虫是鸡球虫病的病原体,疫苗研发是当前的热点领域之一。微线体蛋白免疫原性良好,本研究就卡介苗(rBCG-AMA1/RB)、乳酸乳球菌(rLL-AMA1)、植物乳杆菌(rLp-EtMIC1/EtMIC2/TA4-AMA1)、鼠伤寒沙门氏菌(rSt-5401/EnMIC2/MIC5)、根癌农杆菌(rAt-MIC2)、酵母(rPP-EtMIC2)和鸡痘病毒(rFPV-RB)等载体介导的艾美耳球虫微线体蛋白疫苗的研究进展进行综述。 展开更多

关键词 艾美耳球虫 微线体蛋白 疫苗 综述

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刚地弓形虫菱形体蛋白的研究进展

8

作者 郑斌 詹希美 《国际医学寄生虫病杂志》 CAS 2007年第2期79-81,共3页

菱形体蛋白（rhomboid）为一类跨膜丝氨酸蛋白酶，在胞膜的脂质双分子层内发挥酶解作用。刚地弓形虫的菱形体蛋白可识别微线体蛋白的跨膜区，并对其进行蛋白水解，使微线体蛋白的N端片段释放人介质中。微线体蛋白的蛋白水解过程对于刚... 菱形体蛋白（rhomboid）为一类跨膜丝氨酸蛋白酶，在胞膜的脂质双分子层内发挥酶解作用。刚地弓形虫的菱形体蛋白可识别微线体蛋白的跨膜区，并对其进行蛋白水解，使微线体蛋白的N端片段释放人介质中。微线体蛋白的蛋白水解过程对于刚地弓形虫入侵宿主细胞非常重要。深入研究刚地弓形虫菱形体蛋白，将有助于理解生物体菱形体蛋白的功能及研制新的药物以防治弓形虫感染。 展开更多

关键词 刚地弓形虫 菱形体蛋白 微线体蛋白

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弓形虫微线体蛋白MIC3的研究进展

9

作者 江涛 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第11期1044-1046,共3页

弓形虫（Toxoplasma gondii）的微线体（mi-croneme）散布于虫体前端棒状体周围,是一种具有分泌功能的细胞器,其分泌的微线体蛋白（mi-croneme proteins MICs）与虫体对宿主细胞的识别和结合密切相关,在虫体入侵宿主细胞早期发挥重要作用。

关键词 微线体蛋白 弓形虫 MIC3 分泌功能 宿主细胞 棒状体 虫体 细胞器

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刚地弓形虫GJS株微线体蛋白3基因真核表达质粒的构建及在BHK-21细胞中的表达 被引量：9

10

作者 张燕丽 曹丽艳 +5 位作者 芦赟 苟惠天 王艳华 付宝权 李文卉 张德林 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2009年第2期125-129,共5页

采用PCR技术从刚地弓形虫GJS株基因组DNA中扩增微线体蛋白3(MIC3)基因,并克隆到pMD18-T载体,经PCR、酶切及测序鉴定后,阳性重组质粒酶切并亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)后进行PCR、酶切及测序鉴定。将重组质粒转染BHK-21细胞。间接... 采用PCR技术从刚地弓形虫GJS株基因组DNA中扩增微线体蛋白3(MIC3)基因,并克隆到pMD18-T载体,经PCR、酶切及测序鉴定后,阳性重组质粒酶切并亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)后进行PCR、酶切及测序鉴定。将重组质粒转染BHK-21细胞。间接免疫荧光染色证明,质粒DNA成功转染到细胞中并得以表达。Western-blot分析证实,细胞裂解液及上清样品中有1条约39.2 ku的条带,可被山羊抗刚地弓形虫超免疫血清所识别,大小与预测值相符。表明,真核表达质粒pcDNA3-MIC3中的MIC3基因在BHK-21细胞中获得表达且表达产物具有抗原性。 展开更多

关键词 刚地弓形虫 微线体蛋白3 基因克隆 真核表达

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弓形虫MIC6羧基端相互作用蛋白的筛选 被引量：9

11

作者 郑斌 尹志奎 +1 位作者 何蔼 詹希美 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第11期970-974,共5页

目的筛选与弓形虫微线体蛋白6羧基端(MIC6C)相互作用的蛋白。方法以GST-MIC6C蛋白作为探针蛋白,利用GST pull-down技术,从弓形虫裂解液中筛选与其相互作用的蛋白,SDS-PAGE分析实验产物;将目标蛋白条带转印至PVDF膜,测蛋白序列,BLAST2在... 目的筛选与弓形虫微线体蛋白6羧基端(MIC6C)相互作用的蛋白。方法以GST-MIC6C蛋白作为探针蛋白,利用GST pull-down技术,从弓形虫裂解液中筛选与其相互作用的蛋白,SDS-PAGE分析实验产物;将目标蛋白条带转印至PVDF膜,测蛋白序列,BLAST2在线对比搜索相似蛋白序列,初步确定目标蛋白。制备目标蛋白的抗体,Western blot分析GST pull-down实验产物。结果 GST pull-down实验筛选到的目标蛋白的序列与弓形虫醛缩酶的序列一致;制备了醛缩酶的多克隆抗体,目标蛋白条带能被该抗体特异地识别。结论采用GST pull-down技术,初步筛选出与弓形虫MIC6C相互作用的蛋白为醛缩酶。 展开更多

关键词 刚地弓形虫 微线体蛋白6羧基端 GSTpull-down 醛缩酶

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弓形虫GJS株pcDNA3-MIC3核酸疫苗的研究 被引量：7

12

作者 张燕丽 曹丽艳 +5 位作者 芦赟 蔡志杰 王艳华 付宝权 李文卉 张德林 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第10期1299-1302,共4页

根据GenBank中MIC3基因序列设计1对引物,采用PCR技术从弓形虫GJS株基因组DNA中扩增微线体蛋白3(MIC3)基因片段,克隆到pMD18-T载体,经PCR、酶切及测序鉴定后,阳性重组质粒酶切并亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)后进行PCR、酶切及测序鉴... 根据GenBank中MIC3基因序列设计1对引物,采用PCR技术从弓形虫GJS株基因组DNA中扩增微线体蛋白3(MIC3)基因片段,克隆到pMD18-T载体,经PCR、酶切及测序鉴定后,阳性重组质粒酶切并亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)后进行PCR、酶切及测序鉴定。重组质粒pcDNA3-MIC3肌肉注射免疫BALB/c小鼠,通过ELISA检测血清特异抗体;经腹腔攻击感染弓形虫GJS株速殖子,观察小鼠的生存时间。结果成功构建了pcD-NA3-MIC3质粒;免疫组小鼠血清检测到特异性抗体;攻击感染后免疫组小鼠平均存活时间较对照组明显延长。表明该核酸疫苗具有较好的免疫原性,能诱导小鼠产生良好的免疫保护作用。 展开更多

关键词 刚地弓形虫 微线体蛋白3(MIC3) 核酸疫苗 免疫保护

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弓形虫MIC 6羧基端蛋白片段的表达及其多克隆抗体的制备 被引量：7

13

作者 郑斌 何蔼 +4 位作者 李卓雅 郑小英 张瑞琳 杨潇 詹希美 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第9期870-874,共5页

目的克隆表达刚地弓形虫微线体蛋白6羧基端蛋白片段(Tg MIC6C),制备多克隆抗体。方法PCR扩增目的基因片段,克隆到pGEX-4T-1载体上,构建MIC6C/pGEX-4T-1原核表达系统;IPTG诱导表达GST-MIC6C融合蛋白,亲和层析融合蛋白;用纯化的融合蛋白... 目的克隆表达刚地弓形虫微线体蛋白6羧基端蛋白片段(Tg MIC6C),制备多克隆抗体。方法PCR扩增目的基因片段,克隆到pGEX-4T-1载体上,构建MIC6C/pGEX-4T-1原核表达系统;IPTG诱导表达GST-MIC6C融合蛋白,亲和层析融合蛋白;用纯化的融合蛋白混合免疫佐剂免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,纯化并分析抗体的特异性。结果构建了MIC6C/pGEX-4T-1原核表达系统并获得纯化的GST-MIC6C融合蛋白;获得了抗目的蛋白的多克隆抗体,抗体能特异地识别目的蛋白,抗体效价为1∶8 000。结论在体外获得了纯化的GST-MIC6C融合蛋白及其多克隆抗体,为后续GSTpull-down筛选与MIC6相互作用的蛋白奠定了基础。 展开更多

关键词 刚地弓形虫 微线体蛋白6 蛋白表达 多克隆抗体

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弓形虫微线体蛋白1部分基因的克隆、测序及表达 被引量：6

14

作者 杨慧龄 肖建华 +2 位作者 梁瑜 张愉快 刘传爱 《中华预防医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第1期29-32,共4页

目的　构建弓形虫ZS2株pWR450 1 微线体蛋白 1 (MIC1 )原核表达重组质粒 ,对MIC1基因进行序列测定 ,并在不同大肠杆菌中表达。方法　用PCR技术从弓形虫ZS2株的基因组DNA中扩增编码MIC1的基因片段 ,酶切 ,连接 ,重组入pWR450 1表达载... 目的　构建弓形虫ZS2株pWR450 1 微线体蛋白 1 (MIC1 )原核表达重组质粒 ,对MIC1基因进行序列测定 ,并在不同大肠杆菌中表达。方法　用PCR技术从弓形虫ZS2株的基因组DNA中扩增编码MIC1的基因片段 ,酶切 ,连接 ,重组入pWR450 1表达载体 ,再经含氨苄培养基筛选、酶切、PCR鉴定 ,进行序列测序后转化大肠杆菌TG 1、JM1 0 9(DE3)和DH5α。在不同菌体浓度及不同剂量异丙基 β D 硫代半乳糖诱导下 ,用SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定MIC1融合蛋白的表达。 结果　从ZS2株基因组DNA中扩增出特异的MIC1基因片段 ,克隆后获得pWR450 1 /MIC1重组质粒 ,测序结果表明 ,MIC1这部分基因与弓形虫RH株相应基因序列完全一致 ,高度保守。该基因可在不同大肠杆菌中表达相对分子质量约 70 0 0 0的融合蛋白。结论　构建了弓形虫ZS2株pWR450 1 MIC1重组质粒 。 展开更多

关键词 弓形虫属 克隆 微线体蛋白1 MIC1 基因 测序 表达

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微小隐孢子虫GP900^(829~1099)蛋白的表达及其对小鼠巨噬细胞的免疫调节作用

15

作者 杨玲 王龙 +4 位作者 王佳阳 周坤铮 闫宝龙 赵威 黄慧聪 《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》 CSCD 北大核心 2024年第1期55-62,共8页

目的 初步探究微小隐孢子虫微线体蛋白(MIC)糖蛋白900(GP900) 829~1 099aa片段(GP^(900^(829~1099)))通过核因子-κB (NF-κB)/丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路对小鼠巨噬细胞(RAW264.7细胞)的免疫调节作用。方法 从NCBI数据库中获取... 目的 初步探究微小隐孢子虫微线体蛋白(MIC)糖蛋白900(GP900) 829~1 099aa片段(GP^(900^(829~1099)))通过核因子-κB (NF-κB)/丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路对小鼠巨噬细胞(RAW264.7细胞)的免疫调节作用。方法 从NCBI数据库中获取微小隐孢子虫GP^(900^(829~1099))氨基酸序列进行生物信息学分析。以微小隐孢子虫卵囊cDNA为模板,PCR扩增gp900^(829~1099)基因片段,构建pET-32a-gp900^(829~1099)重组质粒并转化至BL21感受态细胞中诱导表达。纯化、超滤浓缩重组蛋白并去除内毒素。采用0.16、0.80、4.00、20.00、100.00、500.00μg/ml的GP^(900^(829~1099))重组蛋白刺激RAW264.7细胞24 h后,CCK-8法检测其对RAW264.7细胞活力的调节作用。以0.16、0.80、4.00μg/ml的GP^(900^(829~1099))重组蛋白刺激RAW264.7细胞,以PBS为对照组,脂多糖(1μg/ml)为阳性对照,24 h后流式细胞术检测CD86表达量,qPCR检测RAW264.7细胞中IL-6和TNF-α mRNA的相对转录水平,ELISA检测RAW264.7细胞培养上清中IL-6、TNF-α的表达水平。采用蛋白质免疫印迹分析NF-κB和MAPK信号通路中P65蛋白和细胞外调节蛋白激酶(ERK)蛋白磷酸化水平。结果 GP^(900^(829~1099))蛋白二级结构中β转角占比9.23%,无规则卷曲占比64.58%,且含有较丰富的T、B细胞抗原表位。表达的GP^(900^(829~1099))重组蛋白的相对分子质量约为49 000。CCK-8结果显示,GP^(900^(829~1099))对细胞没有毒性作用,后续实验采用0.16、0.80和4.00μ/g/ml作为作用浓度。流式细胞术结果显示,CD86+的阳性表达率分别为(13.500±0.815)%、(18.670±0.657)%、(20.470±1.271)%,后两者均高于对照组的(14.500±0.872)%(t=3.818、3.872,P <0.05)。qPCR结果显示,0.16、0.80和4.00μg/ml组RAW264.7细胞的IL-6 mRNA相对转录水平分别为1.409±0.050、2.052±0.098和3.284±0.097,均高于对照组的1.010±0.096 (t=3.700、7.595、16.700,均P<0.05);TNF-α mRNA相对转录水平分别为1.077±0.034、1.440±0.021和2.378±0.037,后两者均 展开更多

关键词 微小隐孢子虫 微线体蛋白GP900 RAW264.7 NF-ΚB MAPK

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重组刚地弓形虫MIC8 CTD蛋白及其多克隆抗体的制备 被引量：5

16

作者 郑斌 尹志奎 +1 位作者 何蔼 詹希美 《中国病原生物学杂志》 CSCD 2011年第8期581-584,共4页

目的制备弓形虫微线体蛋白8羧基端胞质尾(MIC8 CTD)重组蛋白及其多克隆抗体。方法以弓形虫基因组为模板,PCR扩增MIC8 CTD基因片段,构建MIC8 CTD/pGEX-4T-1原核表达系统;IPTG诱导表达GST-MIC8CTD融合蛋白;用纯化的融合蛋白加免疫佐剂免... 目的制备弓形虫微线体蛋白8羧基端胞质尾(MIC8 CTD)重组蛋白及其多克隆抗体。方法以弓形虫基因组为模板,PCR扩增MIC8 CTD基因片段,构建MIC8 CTD/pGEX-4T-1原核表达系统;IPTG诱导表达GST-MIC8CTD融合蛋白;用纯化的融合蛋白加免疫佐剂免疫新西兰兔,制备多克隆抗体,亲和层析纯化并分析抗体的特异性及效价。结果构建了MIC8 CTD原核表达系统,表达并纯化了GST-MIC8 CTD融合蛋白;获得了抗该蛋白的兔源性抗血清,纯化后的多克隆抗体能特异识别MIC8 CTD,ELISA测定抗体效价为1∶8 000。结论制备的GST-MIC8 CTD融合蛋白具有免疫原性,用该抗原免疫动物可获得高效价的多克隆抗体。 展开更多

关键词 刚地弓形虫 微线体蛋白8 羧基末端胞质尾 多克隆抗体

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抗弓形虫MIC3单抗的制备及其在速殖子免疫荧光观察中的应用 被引量：4

17

作者 刘钊 禹海杰 +2 位作者 卓洵辉 周前进 杜爱芳 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2011年第10期1030-1033,共4页

为开展弓形虫速殖子阶段蛋白表达和定位的相关研究,利用弓形虫重组微线体蛋白3(MIC3)抗原研制单克隆抗体,筛选出适合在虫体内用免疫荧光观察该蛋白的单抗分泌株,建立了弓形虫间接免疫荧光观察方法。结果显示,经4轮亚克隆后得到3株稳定... 为开展弓形虫速殖子阶段蛋白表达和定位的相关研究,利用弓形虫重组微线体蛋白3(MIC3)抗原研制单克隆抗体,筛选出适合在虫体内用免疫荧光观察该蛋白的单抗分泌株,建立了弓形虫间接免疫荧光观察方法。结果显示,经4轮亚克隆后得到3株稳定分泌抗MIC3单抗的分泌株:4G1、1G12和5D7;经测定,3株MIC3单抗4G1、1G12和5D7的亚型分别为IgG1、IgG2b、IgG2b,效价分别为1∶3 200、1∶12 800、1∶1 600。筛选得到的2株MIC3单抗(4G1和1G12)可用于间接免疫荧光检测MIC3蛋白在虫体中的分布。通过弓形虫阳性感染猪血液样品推片的免疫荧光试验,验证了这3株单抗具有特异性。结果表明,研制的MIC3单抗和虫体荧光观察体系可用于速殖子MIC3蛋白在虫体表达定位和其他研究,也可作为其他速殖子抗原荧光观察的比较对象。 展开更多

关键词 弓形虫 微线体蛋白3 单克隆抗体 免疫荧光观察 蛋白表达定位

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弓形虫MIC2胞质尾段蛋白及其多克隆抗体的制备 被引量：4

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作者 尹志奎 郑斌 詹希美 《生物技术》 CAS CSCD 北大核心 2013年第1期45-48,共4页

目的:制备弓形虫微线体蛋白2胞质尾段(MIC2C)蛋白片段及其多克隆抗体。方法:以弓形虫cDNA文库为模板,PCR扩增135bp MIC2C基因片段,构建MIC2C/pGEX-4T-1原核表达系统;IPTG诱导表达GST-MIC2C融合蛋白;用纯化的融合蛋白加免疫佐剂背部皮内... 目的:制备弓形虫微线体蛋白2胞质尾段(MIC2C)蛋白片段及其多克隆抗体。方法:以弓形虫cDNA文库为模板,PCR扩增135bp MIC2C基因片段,构建MIC2C/pGEX-4T-1原核表达系统;IPTG诱导表达GST-MIC2C融合蛋白;用纯化的融合蛋白加免疫佐剂背部皮内注射免疫新西兰兔,制备多克隆抗体,亲和层析纯化并分析抗体的效价。结果:构建了MIC2C原核表达系统,表达并纯化了GST-MIC2C融合蛋白,蛋白的浓度为3.07mg/ml;获得了抗该蛋白的兔源性抗血清,纯化后的多克隆抗体效价为1:16 000。结论:在体外制备并纯化了GST-MIC2C融合蛋白及其多克隆抗体,为后续弓形虫入侵机制的研究奠定了基础。 展开更多

关键词 刚地弓形虫 微线体蛋白2 胞质尾 多克隆抗体

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柔嫩艾美耳球虫MIC4-N的真核表达 被引量：4

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作者 王卫婷 姚鹏 +2 位作者 周赛 王黎霞 安健 《北京农学院学报》 2011年第3期24-27,共4页

应用RT-PCR技术扩增柔嫩艾美耳球虫的MIC4-N端基因并去掉信号肽,为了表达检测和纯化的方便,设计引物时改变了3'端的终止密码子,使MIC4-N的C末端带有c-myc和6His抗原标签。通过双酶切,使加工好的MIC4-N基因连接到毕赤酵母表达载体pP... 应用RT-PCR技术扩增柔嫩艾美耳球虫的MIC4-N端基因并去掉信号肽,为了表达检测和纯化的方便,设计引物时改变了3'端的终止密码子,使MIC4-N的C末端带有c-myc和6His抗原标签。通过双酶切,使加工好的MIC4-N基因连接到毕赤酵母表达载体pPICZαA上,转化JM109感受态细胞。再经EcoRⅠ与NotⅠ双酶切、菌落PCR及测序鉴定,证明目的基因与真核表达载体pPICZαA构建成功,单酶切重组表达载体、电转转入GS115酵母感受态细胞中。用含高浓度Zeocin的YPD平板筛选酵母菌落,菌落PCR法鉴定转化成功的阳性菌,在BMMY培养基中摇瓶培养,并用甲醇诱导,经SDS-PAGE及Western Blot鉴定,蛋白分泌表达成功。 展开更多

关键词 柔嫩艾美耳球虫 微线体蛋白4-N 毕赤酵母真核表达

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弓形虫MIC6羧基端与醛缩酶相互作用的鉴定 被引量：3

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作者 郑斌 尹志奎 詹希美 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第9期883-885,890,共4页

目的鉴定弓形虫MIC6羧基端和醛缩酶的相互作用及两种蛋白在虫体内的定位。方法分别用GST-MIC6C多克隆抗体和兔免疫前血清结合的sepharose与弓形虫裂解液进行免疫共沉淀实验,实验产物进行SDS-PAGE和Western blot分析。弓形虫速殖子涂片,... 目的鉴定弓形虫MIC6羧基端和醛缩酶的相互作用及两种蛋白在虫体内的定位。方法分别用GST-MIC6C多克隆抗体和兔免疫前血清结合的sepharose与弓形虫裂解液进行免疫共沉淀实验,实验产物进行SDS-PAGE和Western blot分析。弓形虫速殖子涂片,免疫荧光定位法确定两种蛋白在虫体内的定位。结果与对照相比,GST-MIC6C多克隆抗体的免疫共沉淀产物中有蛋白条带可分别被相应的抗体识别。荧光显微镜下显示,MIC6(红色荧光)和醛缩酶(绿色荧光)两种蛋白皆定位于弓形虫的顶端。结论弓形虫MIC6羧基端与醛缩酶存在相互作用并在虫体内存在共定位关系。 展开更多

关键词 刚地弓形虫 微线体蛋白6羧基端 醛缩酶 免疫共沉淀 共定位

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