大肠杆菌O157∶H7实时定量PCR检测方法的建立 被引量：3

1

作者 李军 谢宇舟 +8 位作者 禤雄标 陈泽祥 杨威 马春霞 胡帅 彭昊 许力干 谢永平 潘艳 《畜牧与兽医》 北大核心 2011年第5期5-9,共5页

根据GenBank公布的大肠杆菌O157∶H7的Flic(H7)基因序列进行同源性比较分析,选择保守序列设计一对特异性扩增引物,通过优化反应条件,建立一个用于大肠杆菌O157∶H7快速定量检测的实时定量PCR方法。该方法的最低检测极限是103CFU/mL,敏... 根据GenBank公布的大肠杆菌O157∶H7的Flic(H7)基因序列进行同源性比较分析,选择保守序列设计一对特异性扩增引物,通过优化反应条件,建立一个用于大肠杆菌O157∶H7快速定量检测的实时定量PCR方法。该方法的最低检测极限是103CFU/mL,敏感性比常规PCR提高10倍。方法重复性好、特异性强,重复性检测的变异系数均小于2%;只能检测大肠杆菌O157∶H7,对非大肠杆菌O157∶H7血清型细菌、猪链球菌2型、副猪嗜血杆菌无反应。利用此方法对模拟样本进行定量检测,其结果与平板细菌计数基本一致,表明此方法可作为大肠杆菌O157∶H7快速诊断和疫情监测的一种快速、准确、简便的检测工具。 展开更多

关键词 大肠杆菌0157:h7 实时定量PCR Flic(h7)基因

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肠出血性大肠杆菌(O157:H7)的特异性荧光探针检测方法的建立 被引量：4

2

作者 姜君 王鹏志 +2 位作者 刘利成 吴伟立 陈唯军 《现代生物医学进展》 CAS 2012年第12期2201-2204,共4页

目的:建立一种real-time PCR,快速准确检测肠出血性大肠杆菌O157:H7。方法:以肠出血性大肠杆菌0157:H7 rfbE为待检靶基因,设计一对引物和一条Taqman探针,探针5'端用FAM基团标记,3'端用TAMRA标记。通过重组质粒的构建,建立并优... 目的:建立一种real-time PCR,快速准确检测肠出血性大肠杆菌O157:H7。方法:以肠出血性大肠杆菌0157:H7 rfbE为待检靶基因,设计一对引物和一条Taqman探针,探针5'端用FAM基团标记,3'端用TAMRA标记。通过重组质粒的构建,建立并优化了大肠杆菌0157:H7的荧光定量PCR检测方法。结果:在人工污染样本无需富集的情况下,检测的最低DNA浓度是10拷贝/反应(3CFU/mL);特异性检测实验中,0157菌株检测结果均为rfbE阳性,而非0157:H7菌株检测结果均为阴性;重复性实验中,批内、批间变异系数均小于3%。结论:实验结果显示此荧光定量PCR方法特异性、灵敏度高,重复性好,可对分离的可疑大肠杆菌0157:H7菌株进行快速鉴定。 展开更多

关键词 大肠杆菌0157:h7 荧光定量PCR(real-timePCR) TAQMAN探针 rfbE

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大肠杆菌O157:H7 eaeA基因的原核表达

3

作者 龚霞 郭霄峰 《华南农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第1期109-113,共5页

将含广东分离株大肠杆菌O157∶H7 021210eaeA基因的克隆质粒双酶切后,亚克隆至原核表达载体pET-28 a(+),经PCR鉴定、酶切鉴定及核苷酸序列测定,正确构建了原核重组表达质粒pET-eaeA.再将该重组质粒转化E.coliBL21(DE3)pLysS,经IPTG诱导... 将含广东分离株大肠杆菌O157∶H7 021210eaeA基因的克隆质粒双酶切后,亚克隆至原核表达载体pET-28 a(+),经PCR鉴定、酶切鉴定及核苷酸序列测定,正确构建了原核重组表达质粒pET-eaeA.再将该重组质粒转化E.coliBL21(DE3)pLysS,经IPTG诱导,进行SDS-PAGE,结果显示,目的蛋白的相对分子质量约为94 000,与eaeA基因蛋白的理论值相符.破菌后电泳证实目的蛋白主要以包涵体形式存在.表达蛋白经初步纯化,3次免疫新西兰兔,获得抗eaeA蛋白的多克隆血清.经琼脂扩散试验和W estern-b lotting试验,表明该蛋白具有较好的免疫原性和反应原性. 展开更多

关键词 大肠杆菌0157:h7 eaeA基因 紧密素 原核表达

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某牛场粪源大肠杆菌O157∶H7的分离鉴定

4

作者 陈露 曹立亭 +1 位作者 周晏丞 廖春玉 《四川畜牧兽医》 2015年第7期25-27,共3页

为了解重庆市某牛场牛群大肠杆菌O157∶H7的感染情况,我们以牛场犊牛为研究对象,采集其新鲜粪便,经LB培养基增菌培养、免疫磁珠富集后,在山梨醇麦康凯琼脂上划线培养,最后PCR扩增eae A基因目的片段,以此分离鉴定粪源大肠杆菌O157∶H7。... 为了解重庆市某牛场牛群大肠杆菌O157∶H7的感染情况,我们以牛场犊牛为研究对象,采集其新鲜粪便,经LB培养基增菌培养、免疫磁珠富集后,在山梨醇麦康凯琼脂上划线培养,最后PCR扩增eae A基因目的片段,以此分离鉴定粪源大肠杆菌O157∶H7。结果显示:在所采集的39份犊牛粪便样品中,分离得到一株符合大肠杆菌O157∶H7生长特点且含有eae A基因的菌株。 展开更多

关键词 大肠杆菌0157∶h7 PCR技术 免疫磁珠法

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三种食源性致病菌多重PCR检测方法的建立 被引量：16

5

作者 舒畅 姜琛璐 +1 位作者 钟慈平 李林 《食品工业科技》 CAS CSCD 北大核心 2014年第12期49-54,共6页

目的:建立同时快速检测沙门氏菌、志贺氏菌和肠出血性大肠杆菌O157∶H7的多重PCR方法。方法:根据沙门氏菌的invA基因、志贺氏菌的ipaH基因及肠出血性大肠杆菌O157∶H7的uidA基因设计3对引物,通过单因素实验、L9(34)正交实验优化反应体系... 目的:建立同时快速检测沙门氏菌、志贺氏菌和肠出血性大肠杆菌O157∶H7的多重PCR方法。方法:根据沙门氏菌的invA基因、志贺氏菌的ipaH基因及肠出血性大肠杆菌O157∶H7的uidA基因设计3对引物,通过单因素实验、L9(34)正交实验优化反应体系,并对多重PCR扩增的敏感性进行分析。结果:3对引物能特异性扩增出495、620、252bp的目的片段;在最优多重PCR反应体系下,多重PCR检测3种致病菌的灵敏度达104CFU/mL;将该法应用于人工污染实验,可在5h内得到准确、稳定的检测结果。结论:该方法操作简单、检测特异性和灵敏度较高,能够实现对沙门氏菌、志贺氏菌和肠出血性大肠杆菌O157∶H7 3种食源性致病菌的快速监控和诊断。 展开更多

关键词 食源性致病菌 多重PCR 沙门氏菌 志贺氏菌 肠出血性大肠杆菌0157:h7

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抗出血性大肠杆菌Ο157∶H7单克隆抗体的制备及鉴定 被引量：5

6

作者 杨书豪 王伟 +5 位作者 景怀奇 田素娟 刘奇 徐建国 姚楚铮 徐海燕 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 2004年第11期963-965,共3页

目的制备抗出血性大肠杆菌Ο157∶H7(E.coliΟ157∶H7)特异性单克隆抗体(MAbs)。方法福尔马林灭活的E.coliΟ157∶H7免疫BALB/c小鼠,利用细胞融合技术建立分泌抗E.coliΟ157∶H7MAbs的杂交瘤细胞株,对配对较好的6株MAbs用ELISA法测定其... 目的制备抗出血性大肠杆菌Ο157∶H7(E.coliΟ157∶H7)特异性单克隆抗体(MAbs)。方法福尔马林灭活的E.coliΟ157∶H7免疫BALB/c小鼠,利用细胞融合技术建立分泌抗E.coliΟ157∶H7MAbs的杂交瘤细胞株,对配对较好的6株MAbs用ELISA法测定其免疫球蛋白类及亚类,用ELISA法、凝集法和Westernblot鉴定MAbs的特异性。结果6株MAbs免疫球蛋白均为小鼠IgM。这些MAbs均能与27个E.coliΟ157∶H7菌株发生凝集反应,与部分弗劳地杆菌发生凝集反应,与11株鼠伤寒沙门氏菌、7株伤寒杆菌、2株痢疾杆菌、致病性大肠杆菌、产毒性大肠杆菌、侵袭性大肠杆菌、出血性大肠杆菌Ο26∶H11和Ο111、肠集聚性大肠杆菌、42株非定血清型大肠杆菌、霍乱弧菌Ο1群和Ο139群不发生凝集反应;ELISA结果显示6株MAbs与粪链球菌、变形杆菌、粘质沙雷氏菌、肺炎克雷伯杆菌均无交叉反应;ELISA和Westernblot结果显示,3株MAbs针对E.coliΟ157∶H77酚相脂多糖。结论6株MAbs具有较高的特异性,有可能用于制备检测E.coliΟ157∶H7的病原检测试剂。 展开更多

关键词 出血性大肠杆菌0157:h7 单克隆抗体 脂多糖 胶体金 免疫层析

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肠出血性大肠杆菌O157∶H7志贺样毒素Ⅱ毒素亚单位Stx2A的表达与纯化 被引量：2

7

作者 马颖 毛旭虎 +1 位作者 邹全明 张卫军 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第15期1582-1584,共3页

目的克隆表达肠出血性大肠杆菌(Enterohem orrhagic Escherichia col,i EHEC)O157∶H7志贺样毒素A亚单位(Sh iga-like toxin,Stx2A),并对其初步纯化。方法设计引物采用PCR法自EHEC O157∶H7基因组扩增Stx2A的编码基因stx2 a,T-A克隆后... 目的克隆表达肠出血性大肠杆菌(Enterohem orrhagic Escherichia col,i EHEC)O157∶H7志贺样毒素A亚单位(Sh iga-like toxin,Stx2A),并对其初步纯化。方法设计引物采用PCR法自EHEC O157∶H7基因组扩增Stx2A的编码基因stx2 a,T-A克隆后构建原核表达质粒pET-11 c(+)-stx2 a,经测序鉴定后转化E.coli.BL21(DE3),IPTG诱导表达,以SDS-PAGE和W esten b lot分析目的蛋白的表达,并采用固相镍离子亲和层析纯化重组蛋白。结果扩增的stx2 a基因约950bp;原核表达质粒pET-11 c(+)-stx2 a经酶切和测序鉴定与预期序列一致;并在E.coli.BL21(DE3)中得到高效表达,蛋白表达率约30%;PAGE初步测定目的蛋白的相对分子质量约31×103;经固相镍离子亲和层析纯化后,蛋白纯度可达92.3%。结论EHEC O157∶H7 Stx2A的高效表达与初步纯化,为探讨O157∶H7菌的感染机制奠定基础。 展开更多

关键词 肠出血性大肠杆菌0157:h7 毒素A亚单位 表达 纯化

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肠出血性大肠杆菌O157：H7志贺样毒素2B亚基的表达 被引量：1

8

作者 丁益强 王长军 俞守义 《医学研究生学报》 CAS 2008年第6期587-590,I0003,共5页

目的:克隆肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157∶H7 AH07株志贺样毒素2B(Stx2B)亚单位基因,应用原核表达系统制备重组蛋白质。方法:根据靶基因序列设计特异性寡核苷酸引物,采用PCR法克隆EHEC AH07株Stx2B的编码基因stx2b,靶基因经TA克隆后连接... 目的:克隆肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157∶H7 AH07株志贺样毒素2B(Stx2B)亚单位基因,应用原核表达系统制备重组蛋白质。方法:根据靶基因序列设计特异性寡核苷酸引物,采用PCR法克隆EHEC AH07株Stx2B的编码基因stx2b,靶基因经TA克隆后连接到表达载体pET-28a构建重组质粒,阳性重组子转化表达宿主菌E.coliBL-21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导目的蛋白表达,应用SDS-PAGE和Western-blot(WB)分析重组蛋白生物活性。结果:PCR扩增stx2b基因约220 bp,成功构建重组质粒pET28a-stx2b,并在原核细胞中得到高效表达,目的蛋白质的相对分子质量约为7500,约占蛋白质总量的40%;WB显示目的蛋白质可与特异性抗体发生特异性反应。结论:成功克隆EHEC O157∶H7stx2b基因,在原核系统获得目的蛋白质的高效表达,为O157∶H7感染机制及疾病诊断和疫苗研究奠定基础。 展开更多

关键词 肠出血性大肠杆菌0157:h7 志贺样毒素2B亚基 克隆表达

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实时PCR在大肠杆菌O157:H7检测中的应用

9

作者 王艳 叶冬青 《中国卫生检验杂志》 CAS 2006年第4期510-512,共3页

关键词 肠出血性大肠杆菌0157:h7 实时聚合酶链式反应 检测

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肠道出血性大肠杆菌O157∶H7中肠道聚集粘附大肠杆菌耐热肠毒素1基因的检测

10

作者 周志江 西川祯一 +1 位作者 长谷笃 春木孝佑 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2001年第3期215-218,共4页

应用聚合酶链式反应 ( polymerase chain reaction,PCR)对 1 99株肠道出血性大肠杆菌 ( enterohemor-rhagic Escherichia coli,EHEC) O1 57∶ H7中肠道聚集粘附大肠杆菌耐热肠毒素 1 ( enteroaggregative Es-cherichia coli heat-stable... 应用聚合酶链式反应 ( polymerase chain reaction,PCR)对 1 99株肠道出血性大肠杆菌 ( enterohemor-rhagic Escherichia coli,EHEC) O1 57∶ H7中肠道聚集粘附大肠杆菌耐热肠毒素 1 ( enteroaggregative Es-cherichia coli heat-stable enterotoxin1 ,EAST1 )基因进行了检验。结果 ,从 1 % ( 2 / 1 99)菌株中检出了 EAST1基因。对其中 1株菌 ( EHEC O1 5796-84 )的 EAST1基因进行了序列测定。与以往发表的其他致腹泻性大肠杆菌的 EAST1基因的序列相比较 ,EHEC O1 5796-84与 EAgg EC ( O4 2 ,TL1 0 0和 1 60株 )、产肠毒素性大肠杆菌 ( enterotoxigenic E.coli,ETEC)、肠道致病性大肠杆菌 ( enteropathogenic E.coli,EPEC)、扩散粘附性大肠杆菌 ( diffusely adherening E.coli,DAEC)的 EAST1基因序列相同 ,但与 EAgg EC菌株 1 7-2的EAST1基因有 1个碱基对不同 ,从而导致 1个氨基酸残基的变化。本研究结果进一步表明 。 展开更多

关键词 出血性大肠杆菌0157:h7 肠道聚集粘附大肠杆 耐热肠毒素1 基因检测 PCR

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应用酶联免疫吸附试验检测肠出血性大肠杆菌0157:H7方法研究

11

作者 宋志荣 王利民 +1 位作者 郭宏 孙克江 《医学检验与临床》 2002年第1期16-19,共4页

目的制备和纯化0157:H7抗原,免疫家兔和豚鼠,获得高效价的抗0157:H7免疫血清并进行纯化及酶标记.建立对0157:H7感染患者快速诊断方法,做到早期发现及时治疗,有效控制疫情的蔓延.方法ELISA双抗体夹心法检测0157:H7抗原.步骤:包被特异性抗... 目的制备和纯化0157:H7抗原,免疫家兔和豚鼠,获得高效价的抗0157:H7免疫血清并进行纯化及酶标记.建立对0157:H7感染患者快速诊断方法,做到早期发现及时治疗,有效控制疫情的蔓延.方法ELISA双抗体夹心法检测0157:H7抗原.步骤:包被特异性抗体,加处理后的粪便等标本,然后加入抗0157:H7酶结合物,最后加入底物显色.结果本课题所研制的抗0157:H7酶结合物只对0157:H7呈阳性反应,而与其他相关细菌无交叉反应.结论应用酶联免疫吸咐试验(即双抗体夹心法)对肠出血性大肠杆菌0157:H7抗原的检测较常规法实验程序简捷、快速、敏感.临床和现场验证结果表明,其方法具有灵敏度高,特异性强操作简单等特点,为肠出血性大肠杆菌0157:H7的鉴定及快速诊断提供了一种新的检测手段. 展开更多

关键词 肠出血性大肠杆菌0157:h7 酶联免疫吸附实验(ELISA) 大肠杆菌 胃肠出血

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肉制品中沙门菌和大肠杆菌0157:H7的检测与体会

12

作者 翟庆桂 韩冰 李羡亭 《中国城乡企业卫生》 2009年第6期87-87,共1页

章丘市疾控中心中心实验室于2006年12月通过了国家实验室认可。2007年参加了由中国合格评定国家认可委员会（CNAS）组织的肉制品中沙门菌和大肠杆菌0157：H7检测能力验证。能力验证是认可机构和管理机构判定实验室能力的重要技术手段，... 章丘市疾控中心中心实验室于2006年12月通过了国家实验室认可。2007年参加了由中国合格评定国家认可委员会（CNAS）组织的肉制品中沙门菌和大肠杆菌0157：H7检测能力验证。能力验证是认可机构和管理机构判定实验室能力的重要技术手段，也是实验室内部质量控制的补充措施。沙门菌和大肠杆菌0157：H7是影响食品安全的主要食源性致病菌。 展开更多

关键词 肉制品 沙门菌 大肠杆菌0157:h7

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