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猪胸膜肺炎放线杆菌可视化LAMP检测方法的建立与应用 被引量：4
1
作者 朱海鹏 郑旭 +4 位作者 王慧 高洁 司舒晗 杜涛峰 穆杨 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2022年第7期837-845,共9页
为建立检测猪胸膜肺炎放线杆菌(APP)的可视化环介导等温扩增(LAMP)方法,对比猪APP主要流行毒株的ApxⅣA基因序列,选择高度保守区域设计LAMP引物,以钙黄绿素(Calcein)为指示剂,对反应体系和反应条件优化后建立了一种快速检测猪APP的可视... 为建立检测猪胸膜肺炎放线杆菌(APP)的可视化环介导等温扩增(LAMP)方法,对比猪APP主要流行毒株的ApxⅣA基因序列,选择高度保守区域设计LAMP引物,以钙黄绿素(Calcein)为指示剂,对反应体系和反应条件优化后建立了一种快速检测猪APP的可视化LAMP方法。采用建立的方法在63℃水浴锅中扩增40 min后,85℃作用10 min即可完成检测。用该方法检测大肠杆菌、绿脓杆菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、猪霍乱沙门菌、猪链球菌、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌等,均不发生交叉反应。以10倍稀释的APP基因组DNA为模板,评价方法的敏感性,结果最低检出量为1.67×10^(-5)ng/μL,比普通PCR方法的最低检出量1.67×10^(-2)ng/μL高1000倍;在反应体系中加入钙黄绿素,反应结束后阳性反应管颜色从橘黄色变为黄绿色且在紫外光下有绿色荧光。采用建立的方法检测312份临床样品,共检出阳性样品46份,而采用普通PCR方法仅检出阳性样品10份。该方法的建立为快速诊断猪传染性胸膜肺炎提供了技术支持。 展开更多
关键词 猪胸膜肺炎放线杆菌 可视化环介导等温扩增 ApxⅣA基因 钙黄绿素
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基于可视化和实时荧光环介导等温扩增技术快速鉴定日本红菇
2
作者 赵兰馨 赵晓燕 +4 位作者 易思亮 田恩静 范婷婷 赵志勇 周昌艳 《中国食品卫生杂志》 CSCD 北大核心 2023年第10期1440-1447,共8页
目的利用可视化和实时荧光环介导等温扩增(LAMP)技术,建立日本红菇的快速鉴别方法。方法基于日本红菇内转录间隔区的基因序列设计了特异性的LAMP引物,在23种蘑菇物种间进行特异性验证,通过检测10 ng/μL~1 fg/μL系列浓度的基因组DNA,... 目的利用可视化和实时荧光环介导等温扩增(LAMP)技术,建立日本红菇的快速鉴别方法。方法基于日本红菇内转录间隔区的基因序列设计了特异性的LAMP引物,在23种蘑菇物种间进行特异性验证,通过检测10 ng/μL~1 fg/μL系列浓度的基因组DNA,评估方法的灵敏度。结果设计的LAMP引物可特异性鉴别日本红菇,不与其他蘑菇种类发生交叉反应。建立的LAMP方法检测灵敏度为1%混合蘑菇样本,或终浓度为2 pg/μL的日本红菇DNA。结论本方法可用于新鲜/干制蘑菇及烹饪后蘑菇的检测,检测时间<1 h,其中可视化方法无需专业仪器设备,适用于日本红菇的现场快速鉴别。 展开更多
关键词 日本红菇 可视化环介导等温扩增 实时荧光环介导等温扩增 快速鉴定 蘑菇及其制品
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副溶血性弧菌PMA-LAMP方法的建立 被引量：9
3
作者 马骉 吴莹莹 +2 位作者 戴明雁 方结红 张明洲 《现代食品科技》 EI CAS 北大核心 2016年第7期205-213,共9页
副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus)是一种常见的食源性致病菌,在海鲜等食物中检出率很高,食用没有煮熟的带菌食物或者腌制品,极易引起食物中毒。目前用以检测副溶血性弧菌的快速检测方法都不能区别死活菌,容易出现假阳性结果。本研... 副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus)是一种常见的食源性致病菌,在海鲜等食物中检出率很高,食用没有煮熟的带菌食物或者腌制品,极易引起食物中毒。目前用以检测副溶血性弧菌的快速检测方法都不能区别死活菌,容易出现假阳性结果。本研究基于DNA结合染料叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA),利用荧光染料钙黄绿素(Calcein)的特性,建立了一种实时的可视化环介导等温扩增方法(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP),并与q PCR方法进行比较。实时可视化LAMP方法的反应结果,既可以肉眼直接观测,也可以借助荧光分析设备实时监测,并对半定量分析进行初探,为之后向定量分析深入研究打下基础。实验结果表明,实时可视化PMA-LAMP方法的灵敏度可达5.0×102 CFU/m L,模拟食样灵敏度为1.9×102 CFU/m L,与PMA-q PCR方法结果一致。除去前增菌时间,整个检测过程只需2 h,且准确率高,为副溶血性弧菌快速检测的开展提供了有效的技术支持。 展开更多
关键词 副溶血性弧菌 可视化环介导等温扩增方法 叠氮溴化丙锭 实时荧光定量PCR 快速检测
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水产品中哈维氏弧菌等温快速检测方法优化及比较 被引量：3
4
作者 仲瑶 贾惠齐 +5 位作者 苏鹏 刘玉欣 孔昕荟 龚思颖 郑秋月 曹际娟 《食品安全质量检测学报》 CAS 北大核心 2023年第22期143-151,共9页
目的 基于核酸等温扩增技术,建立荧光法、可视化环介导恒温扩增(loop-mediatedisothermal amplification,LAMP)和重组酶聚合酶扩增(recombinasepolymeraseamplification,RPA)快速检测哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)的分析方法,并对方法进... 目的 基于核酸等温扩增技术,建立荧光法、可视化环介导恒温扩增(loop-mediatedisothermal amplification,LAMP)和重组酶聚合酶扩增(recombinasepolymeraseamplification,RPA)快速检测哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)的分析方法,并对方法进行优化和比较。方法 选择哈维氏弧菌toxR基因为特异靶标序列,分别设计了2组LAMP引物、3组RPA引物,对方法进行筛选。优化建立了荧光法LAMP、可视化LAMP、普通RPA3种等温扩增方法,对3种方法的特异性和灵敏度进行比较,并用模拟污染样本验证检测实际样品的灵敏度。结果 基于快速提取的哈维氏弧菌基因组DNA,本研究所建立的荧光法LAMP、可视化LAMP、普通RPA 3种等温扩增方法均具有良好的特异性,与同属及近属的细菌没有交叉反应。3种方法的灵敏度分别为5.27 fg/μL (1.99 fg/μL~0.93 pg/μL, 95%置信区间)、0.11 ng/μL、1.07 pg/μL;荧光LAMP和普通RPA对模拟污染样本的灵敏度分别为7 CFU/mL和97 CFU/mL。结论 本研究建立优化的3种等温快速检测方法结果准确、操作简单,扩增效率和灵敏度优于文献报道的同类方法,提高了哈维氏弧菌现场快速检测水平。 展开更多
关键词 哈维氏弧菌 荧光法 可视化环介导等温扩增技术 重组酶聚合酶扩增
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膜吸附法结合可视化环介导等温扩增技术检测柑橘黄龙病菌 被引量：4
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作者 李镇希 李文婷 +3 位作者 黄家权 郑正 许美容 邓晓玲 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2022年第1期74-84,共11页
【背景】柑橘黄龙病(Huanglongbing,HLB)是由候选韧皮部杆菌亚洲种(‘Candidatus Liberibacter asiaticus’,CLas)侵染引起的一种柑橘病害。对于该病害的防治主要采取综合措施,包括实施检疫、种植无病苗木、及时挖除病树和集中大面积联... 【背景】柑橘黄龙病(Huanglongbing,HLB)是由候选韧皮部杆菌亚洲种(‘Candidatus Liberibacter asiaticus’,CLas)侵染引起的一种柑橘病害。对于该病害的防治主要采取综合措施,包括实施检疫、种植无病苗木、及时挖除病树和集中大面积联防联控柑橘木虱等。前3种方法都需要依靠准确的柑橘黄龙病诊断技术。【目的】利用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification, LAMP),结合膜吸附法DNA快速提取和Gelgreen荧光染料可视化,建立黄龙病田间核酸快速检测方法。【方法】以黄龙病菌β-操纵子与原噬菌体DNA聚合酶基因为模板设计LAMP特异性引物,包括外引物F3/B3、内引物FIP/BIP、环引物LoopF/LoopB和茎引物StemF/StemB。通过对环引物和茎引物设定不同的用量组合,对LAMP引物体系进行优化,确定合适的引物浓度。用优化后的LAMP引物体系对188份田间柑橘叶片进行检测,并构建受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线分析实时荧光LAMP(qLAMP)在CLas检测上的准确性。对qLAMP预混反应液进行两步的常温干燥,分别设定不同的存放条件,评估LAMP常温干燥试剂的稳定性。用本研究建立的CLas可视化LAMP快速检测方法,对田间71个柑橘叶片样品和35个柑橘果实样品进行检测,与实时荧光定量PCR(qPCR)比较两者的符合率。【结果】在LAMP体系中加入环引物、茎引物或增加其浓度都能促进反应速率的提升,并且同时加入终浓度均为1.6μmol·L-1的环引物和茎引物能进一步提高LAMP反应速率。LAMP预混液通过两步法干燥在不同温度存放1—4周均能保持反应活性基本不变,表明制备的两步法干燥LAMP试剂检测性能较好,在低温和常温环境下的稳定性尚可,仅35℃高温存放会略微增加LAMP试剂的反应时间。使用孔径0.1μm尼龙膜代替纤维素滤纸作为核酸吸附材料能提升CLas快速诊断技术的灵敏度。结合DNA快速提� 展开更多
关键词 柑橘黄龙病 候选韧皮部杆菌亚洲种 田间检测 膜吸附法 DNA快速提取 可视化环介导等温扩增技术
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