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RNA干扰体外抑制乙型肝炎病毒抗原表达的实验研究 被引量:3
1
作者 汪光蓉 张国元 +3 位作者 杨健 胡为民 唐恩洁 朱道银 《免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第3期311-315,共5页
目的针对乙型肝炎病毒(HBV)prec/c区构建shRNA表达载体,观察shRNA表达载体对HBV抗原表达的抑制作用,为运用RNA干扰(RNAi)技术治疗乙型肝炎奠定基础。方法运用基因重组技术构建shRNA表达载体,经酶切,测序鉴定确认后,与1.5倍HBV真核表达质... 目的针对乙型肝炎病毒(HBV)prec/c区构建shRNA表达载体,观察shRNA表达载体对HBV抗原表达的抑制作用,为运用RNA干扰(RNAi)技术治疗乙型肝炎奠定基础。方法运用基因重组技术构建shRNA表达载体,经酶切,测序鉴定确认后,与1.5倍HBV真核表达质粒pHBV1.5共转染Hela细胞,并于转染后72 h,用微粒子酶免疫实验(MEIA)分别检测细胞上清液和细胞裂解液中HBsAg和HBeAg表达水平;用半定量PCR检测prec/c mRNA的转录情况;分析shRNA表达载体对HBe/HBs抗原表达的抑制情况。结果成功构建了针对HBV prec/c区的shRNA表达载体psiHBV4、psiHBV5、psiHBV6及无关shRNA表达载体psiC;筛选到对HBeAg有明显的抑制作用的psiHBV4载体,同时其对HBsAg的表达有促进作用;psiHBV5和psiHBV6对HBeAg的抑制作用相对较弱,其对HBsAg的表达也有不同程度的促进作用;无关干扰对照psiC对HBV两种抗原的表达均无显著抑制作用。结论成功构建带U6启动子的shRNA表达载体并初步筛选到可显著抑制HBeAg表达的psiHBV4;本研究设计的3个靶向序列中,只有一个序列有大约70%的抑制率,而另外两个序列的抑制率相对较小,说明RNA干扰作用有较强的序列依赖性;无关干扰序列psiC几乎无干扰作用,说明siRNA产生的干扰作用具有高度的特异性。以上结果为应用RNAi治疗乙型肝炎奠定了一定的基础。 展开更多
关键词 乙型肝炎病毒 抗原 shrna RNA干扰 表达载体
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STUB1基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定 被引量:3
2
作者 赵虹 张惊宇 +2 位作者 徐万海 杨子超 赵庆杰 《浙江大学学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2010年第6期623-627,共5页
目的:构建人STUB1基因RNA干扰(RNA interference,RNAi)慢病毒表达载体并进行鉴定。方法:针对筛选确定的人STUB1基因RNAi有效靶点序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经AgeI和EcoRI酶切后的pMagic 4.0载体连接,产生短发卡RNA... 目的:构建人STUB1基因RNA干扰(RNA interference,RNAi)慢病毒表达载体并进行鉴定。方法:针对筛选确定的人STUB1基因RNAi有效靶点序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经AgeI和EcoRI酶切后的pMagic 4.0载体连接,产生短发卡RNA慢病毒载体。PCR筛选阳性克隆,测序鉴定,并包装成慢病毒颗粒。结果:PCR鉴定与DNA测序证实,合成的含STUB1 shRNA慢病毒载体寡核苷酸链插入正确。STUB1 shRNA慢病毒载体在293T细胞中成功包装成慢病毒颗粒。结论:成功构建人STUB1基因RNAi慢病毒载体以及包装成功慢病毒颗粒,为研究STUB1在胶质瘤发生发展过程中相关信号通路的作用,提供了稳定感染细胞的载体。 展开更多
关键词 基因 RNA干扰 慢病毒载体 构建与鉴定 RNA interference LENTIVIRAL vector 慢病毒颗粒 慢病毒表达载体 构建人 包装 RNAi 胶质瘤发生 寡核苷酸链 shrna DNA测序 载体连接 阳性克隆 信号通路 筛选确定 合成
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腺病毒载体RNA干扰抑制Fas(CD95)表达作用 被引量:4
3
作者 刘明社 赵中夫 +4 位作者 王兰 杨慧 张国英 张芸 乔京贵 《长治医学院学报》 2007年第2期81-84,共4页
目的:观察串联表达Fas-shRNA的腺病毒载体pAdeno-X-siFas 1+siFas 2对脂多糖(LPS)/D-氨基半乳糖(D-GalN)诱导BALB/c鼠肝细胞Fas过表达的影响。方法:20只雄性BALB/c鼠随机分为:RNA干扰组(RNAi组)、腺病毒通用阴性对照组(HK组)、模型组(M... 目的:观察串联表达Fas-shRNA的腺病毒载体pAdeno-X-siFas 1+siFas 2对脂多糖(LPS)/D-氨基半乳糖(D-GalN)诱导BALB/c鼠肝细胞Fas过表达的影响。方法:20只雄性BALB/c鼠随机分为:RNA干扰组(RNAi组)、腺病毒通用阴性对照组(HK组)、模型组(M组)和正常对照组(N组)。RNAi组于0 h、24 h经尾静脉注射腺病毒载体pAdeno-X-siFas 1+siFas 2两次,HK组尾静脉注射阴性腺病毒载体;M组尾静脉注射生理盐水;24 h后上述3组腹腔注射LPS/D-GalN;N组尾静脉和腹腔均注射生理盐水。注射LPS/D-GalN8 h后,麻醉并处死鼠取肝脏,冰冻切片荧光显微镜检测腺病毒转染率;Western Blot检测各组肝细胞Fas表达;RT-PCR检查Fas mRNA表达。结果:RNAi组和HK组腺病毒对肝细胞的转染率差异没有显著性(P=0.935);RNAi组与M组和HK组相比肝细胞Fas表达水平显著减少(P<0.01),其Fas mRNA水平也明显降低(P<0.01)。结论:串联重组腺病毒载体能有效转染肝细胞并抑制LPS/D-GalN诱导的BALB/c鼠肝细胞Fas基因的过表达。 展开更多
关键词 RNAI Fas(CD95) shrna 腺病毒载体 BALB/C鼠
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TCAB1基因RNAi慢病毒载体的构建及在人子宫内膜间质细胞中沉默TCAB1基因的效应 被引量:3
4
作者 陈捷 顾林 +2 位作者 史颖莉 袁春桃 倪婕 《中国优生与遗传杂志》 2012年第11期6-8,共3页
目的构建TCAB1基因RNAi慢病毒载体,为子宫内膜异位症(EMs)的基因靶向治疗提供理论依据。方法化学合成3条靶向TCAB1基因的siRNA,转染HEK-293T细胞,24h后采用荧光素酶报告系统筛选有效siRNA,其对TCAB1mRNA有明显抑制作用。针对已经筛选确... 目的构建TCAB1基因RNAi慢病毒载体,为子宫内膜异位症(EMs)的基因靶向治疗提供理论依据。方法化学合成3条靶向TCAB1基因的siRNA,转染HEK-293T细胞,24h后采用荧光素酶报告系统筛选有效siRNA,其对TCAB1mRNA有明显抑制作用。针对已经筛选确定的TCAB1基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经XhoI和HpaI酶切后的LV1载体[含U6启动子和绿色荧光蛋白(GFP)]连接产生LV1-shRNA慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。用LV1-shRNA、pRev、pVsvg、pcgv四质粒共转染包装细胞HEK-293T细胞,包装产生慢病毒,分别于转染后48h、72h收取病毒上清,感染人子宫内膜间质细胞(ESC),进行RT-qPCR检测TCAB1基因相对表达量,检测LV1-shRNA干扰效率。结果 PCR和测序证实,成功构建TCAB1 shRNA的慢病毒载体LV1-shRNA。结论成功构建TCAB1基因的RNAi慢病毒载体,其转染ESC细胞后显著抑制了TCAB1的表达,为子宫内膜异位症的基因靶向治疗提供了实验基础。 展开更多
关键词 TCAB1 shrna RNA干扰 慢病毒载体 子宫内膜异位症
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靶向EZH2基因的shRNA真核表达载体的构建及鉴定 被引量:2
5
作者 卢绩 陈岐辉 +4 位作者 许宁 王春喜 王晓庆 侯宇川 汪岩 《中国实验诊断学》 北大核心 2010年第12期1921-1923,共3页
目的构建靶向EZH2基因的shRNA真核表达载体质粒,为利用RNA干扰技术探索EZH2基因的作用的研究做准备。方法根据EZH2 mRNA序列设计并合成shRNA寡核苷酸片段,退火形成双链并连接入pGenesil-2载体,并进行酶切鉴定和测序。结果酶切证明构建的... 目的构建靶向EZH2基因的shRNA真核表达载体质粒,为利用RNA干扰技术探索EZH2基因的作用的研究做准备。方法根据EZH2 mRNA序列设计并合成shRNA寡核苷酸片段,退火形成双链并连接入pGenesil-2载体,并进行酶切鉴定和测序。结果酶切证明构建的shRNA已插入载体中,经测序证明与设计相同。结论成功构建靶向EZH2基因的shRNA真核表达载体,为进一步研究EZH2基因在肿瘤细胞中的作用机制及后续的体内外RNAi实验研究奠定了基础。 展开更多
关键词 EZH2基因 RNA干扰 shrna 真核表达载体
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靶向HIWI基因的shRNA真核表达载体的构建及鉴定 被引量:2
6
作者 陈岐辉 卢绩 +2 位作者 王小庆 王春喜 姚子明 《中国实验诊断学》 2008年第1期42-46,共5页
目的构建靶向HIWI基因的shRNA真核表达载体质粒,为利用RNA干扰技术探索HIWI基因的作用的研究做准备。方法根据HIWI mRNA序列设计并合成shRNA寡核苷酸片段,退火形成双链并连接入pGenesil-2载体,并进行酶切鉴定和测序。结果酶切证明构建的... 目的构建靶向HIWI基因的shRNA真核表达载体质粒,为利用RNA干扰技术探索HIWI基因的作用的研究做准备。方法根据HIWI mRNA序列设计并合成shRNA寡核苷酸片段,退火形成双链并连接入pGenesil-2载体,并进行酶切鉴定和测序。结果酶切证明构建的shRNA已插入载体中,经测序证明与设计相同。结论成功构靶向HIWI基因的shRNA真核表达载体,为进一步研究HIWI基因在干细胞和肿瘤细胞中的作用机制及后续的体内外RNAi实验研究奠定了基础。 展开更多
关键词 HIWI基因 RNA干扰 shrna 真核表达载体
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猪Utx慢病毒过表达/干扰载体的构建和病毒包装 被引量:1
7
作者 闫海龙 陈晓旭 +3 位作者 朱晋生 张鹏飞 李爽 曾文先 《家畜生态学报》 北大核心 2017年第8期7-13,共7页
UTX(ubiquitously transcribed TPR gene on the X chromosome)作为H3K27me2/3的去甲基酶,能够调控动物发育过程,并有着重要的生物学作用。根据猪Utx预测序列,扩增Utx的CDS区全长序列。利用Utx的CDS区序列信息,构建pCD513B-CMV-Utx过表... UTX(ubiquitously transcribed TPR gene on the X chromosome)作为H3K27me2/3的去甲基酶,能够调控动物发育过程,并有着重要的生物学作用。根据猪Utx预测序列,扩增Utx的CDS区全长序列。利用Utx的CDS区序列信息,构建pCD513B-CMV-Utx过表达载体,设计并合成干扰shRNA和阴性对照寡核苷酸片段。其中干扰shRNA及阴性对照通过退火形成双链DNA,并插入pCD513B-U6慢病毒干扰载体。采用双酶切的方法和DNA测序鉴定重组载体。通过干扰和过表达载体质粒共转293T细胞,利用qRT-PCR筛选出最有效的干扰序列。重组质粒与其他3种慢病毒辅助包装质粒(pRsv-Rev、pGag-Pol、pVSV-G)共转染293T细胞包装慢病毒。结果表明,本试验成功扩增Utx基因的全长序列,且成功构建了Utx的过表达和干扰载体。qRT-PCR筛选出pCD513B-U6-Utx-shRNA-3干扰效率最显著,干扰效率为70%。本试验成功包装出慢病毒Lenti-Utx-shRNA、Lenti-NC和Lenti-Utx,测定的病毒滴度分别为6.1×107 TU/mL、4.8×107 TU/mL和3.9×105 TU/mL。此试验为进一步在猪源细胞中进行Utx基因的研究奠定基础。 展开更多
关键词 组蛋白去甲基化 Utx shrna 慢病毒 过表达载体 干扰载体
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靶向PERK基因的shRNA真核表达载体的构建及对内质网应激状态下L02肝细胞凋亡的影响 被引量:2
8
作者 曹洁 杨朝霞 +1 位作者 沈薇 姚隆 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第12期2376-2381,共6页
目的:构建靶向RNA依赖的蛋白激酶样内质网激酶(PERK)基因的短发夹状RNA(shRNA)真核表达载体,观察其对内质网应激(ERS)状态下人正常肝细胞株L02凋亡的影响。方法:根据PERK基因核苷酸序列,按照小干扰RNA(siRNA)靶序列的设计原则,设计并构... 目的:构建靶向RNA依赖的蛋白激酶样内质网激酶(PERK)基因的短发夹状RNA(shRNA)真核表达载体,观察其对内质网应激(ERS)状态下人正常肝细胞株L02凋亡的影响。方法:根据PERK基因核苷酸序列,按照小干扰RNA(siRNA)靶序列的设计原则,设计并构建靶向PERK基因mRNA的3个特异性shRNA表达载体(PERK1-shRNA、PERK2-shRNA、PERK3-shRNA)和1个无同源性的阴性对照载体(HK-shRNA),经酶切和测序鉴定确认shRNA载体构建成功后,转染L02肝细胞,RT-PCR和Western blotting方法检测PERK基因的表达,筛选出抑制效果最佳的表达载体。分别应用MTT法和流式细胞术检测ERS状态下沉默了PERK基因的L02肝细胞活力和凋亡的变化。结果:经酶切和测序鉴定证实,4个shRNA表达载体均构建成功。RT-PCR和Westernblotting结果显示,与空白对照组相比,PERK1-shRNA、PERK2-shRNA、PERK3-shRNA组L02细胞中PERK基因在mRNA及蛋白水平上的表达均明显降低(P<0.05),其中PERK1-shRNA干扰效果最强。MTT法和流式细胞术结果表明,沉默PERK基因能明显增加ERS状态下肝细胞活力、抑制其凋亡(P<0.05)。结论:成功构建靶向PERK基因的shRNA真核表达载体,PERK基因缺失对ERS状态下L02肝细胞凋亡有抑制作用。 展开更多
关键词 基因 PERK RNA干扰 shrna 表达载体 细胞凋亡
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靶向mdr1基因shRNA真核表达载体的构建及鉴定 被引量:1
9
作者 干惠珠 张桂珍 +4 位作者 张凤春 卜丽莎 杨绍娟 高申 郑德明 《蚌埠医学院学报》 CAS 2007年第4期384-387,共4页
目的:设计并构建靶向mdr1基因shRNA真核表达质粒。方法:以mdr1为靶基因设计具有短发夹结构的模板寡核苷酸,退火形成互补双链结构,再克隆至pSilencerTM3.1-H1neo载体,构建重组的短发夹shRNA表达载体。采用酶切法和测序法鉴定。结果:经限... 目的:设计并构建靶向mdr1基因shRNA真核表达质粒。方法:以mdr1为靶基因设计具有短发夹结构的模板寡核苷酸,退火形成互补双链结构,再克隆至pSilencerTM3.1-H1neo载体,构建重组的短发夹shRNA表达载体。采用酶切法和测序法鉴定。结果:经限制性内切酶酶切电泳后显示有66bp模板寡核苷酸片段和4.3kbp的线性化的pSilencerTM3.1-H1neo载体片段。重组子测序结果与Genebank中的mdr1基因cDNA序列相符。结论:重组靶向mdr1基因shRNA表达载体构建正确,为进一步转染耐药的肿瘤细胞逆转肿瘤耐药研究奠定了基础。 展开更多
关键词 MDR1基因 RNA干扰 shrna表达载体
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大鼠靶向α7nAchR基因shRNA真核表达载体及重组腺病毒构建 被引量:1
10
作者 王定坤 陆付耳 +6 位作者 邹欣 任妍林 董慧 巩静 方珂 徐丽君 王开富 《华中科技大学学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2017年第4期374-379,共6页
目的构建大鼠烟碱样乙酰胆碱受体α7亚型(α7nAchR)基因短发夹RNA(shRNA)真核表达载体。方法设计并合成编码α7nAchR基因shRNA的DNA模板引物AY318、AY857、AY444+559、AY318+857,并分别与线性化的质粒载体pGenesil-1.1、pGenesil-1.4、p... 目的构建大鼠烟碱样乙酰胆碱受体α7亚型(α7nAchR)基因短发夹RNA(shRNA)真核表达载体。方法设计并合成编码α7nAchR基因shRNA的DNA模板引物AY318、AY857、AY444+559、AY318+857,并分别与线性化的质粒载体pGenesil-1.1、pGenesil-1.4、pGenesil-1.2,pGenesil-1.3连接,以构建可以编码1条α7nAchR基因shRNA和编码2条α7nAchR基因shRNA的重组质粒载体;重组质粒载体感染感受态的DH5a细胞,提取细菌质粒进行特定酶切,并用1%的琼脂糖凝胶电泳以鉴定重组质粒是否构建成功;用LR体外同源重组法将AY318、AY444+559、AY857shRNA表达框分别从重组质粒pGenesil转移至腺病毒pGSadeno质粒表达载体上,构建重组腺病毒质粒;用相同的方法感染DH5a细胞,并鉴定重组腺病毒pGSadeno质粒是否构建成功;提取线性化的重组腺病毒DNA并转染包装细胞HEK293,经放大培养获得滴度为1.0×1010pfu/mL的重组腺病毒上清;将重组腺病毒感染大鼠GH3垂体瘤细胞,以PCR反应鉴定重组腺病毒载体的α7nAchR基因干扰效果。结果通过酶切片段及其大小,初步判断AY318、AY857、AY444+559、AY318+857shRNA成功重组入质粒载体,重组腺病毒pGSadeno-shRNA包装成功;重组腺病毒感染HEK293细胞,在荧光显微镜下有绿色荧光蛋白表达;重组腺病毒感染GH3细胞后α7nAchR mRNA表达显著减少,且pGSadeno-AY857shRNA干扰效果最明显(85%)。结论具有感染力和干扰大鼠α7nAchR基因表达的shRNA真核表达载体构建成功,且pGSadeno-AY857shRNA具有最强的基因干扰效果。 展开更多
关键词 α7nAchR shrna 基因干扰 重组质粒 重组腺病毒
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小鼠Dppa2基因shRNA载体的构建及干扰效果的检测 被引量:1
11
作者 陈天姬 杜娟 卢光琇 《现代生物医学进展》 CAS 2010年第3期404-407,共4页
目的:构建有效的针对小鼠Dppa2基因的shRNA(short hairpin RNA)干扰载体。方法:设计合成2对针对小鼠Dppa2基因的shRNA序列以及1对与哺乳动物基因组无同源性的shRNA序列作为对照,构建pSUPER.Retro.puro干扰载体并进行PCR,酶切和测序验证... 目的:构建有效的针对小鼠Dppa2基因的shRNA(short hairpin RNA)干扰载体。方法:设计合成2对针对小鼠Dppa2基因的shRNA序列以及1对与哺乳动物基因组无同源性的shRNA序列作为对照,构建pSUPER.Retro.puro干扰载体并进行PCR,酶切和测序验证。进一步将各干扰载体分别转染小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs),RT-PCR检测干扰效率。结果:PCR,酶切和测序验证均表明各shRNA载体构建成功。将空载体及各重组载体分别转染小鼠ESCs发现,干扰组Dppa2基因表达水平相对于空载体对照组和阴性shRNA载体对照组明显下调。结论:成功构建了有效的针对小鼠Dppa2基因的shRNA干扰载体,为进一步研究Dppa2基因在维持小鼠ESCs不分化过程中的作用提供了基础。 展开更多
关键词 Dppa2 RNA干扰(RNAinterference RNAi) shrna载体
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RNAi阻断乙酰肝素酶介导的卵巢上皮癌细胞系浸润转移体外实验研究 被引量:1
12
作者 陈泓 李力 +1 位作者 张玮 王琪 《现代妇产科进展》 CSCD 北大核心 2010年第6期419-422,426,共5页
目的:探讨乙酰肝素酶shRNA抑制人卵巢癌细胞系乙酰肝素酶(HPSE)表达及对其侵润侵袭能力的影响。方法:针对HPSE mRNA的不同区域设计并构建不同的shRNA表达载体,脂质体法转染HPSE高表达的人卵巢癌细胞系SKOV3,实时定量PCR检验干扰效率,选... 目的:探讨乙酰肝素酶shRNA抑制人卵巢癌细胞系乙酰肝素酶(HPSE)表达及对其侵润侵袭能力的影响。方法:针对HPSE mRNA的不同区域设计并构建不同的shRNA表达载体,脂质体法转染HPSE高表达的人卵巢癌细胞系SKOV3,实时定量PCR检验干扰效率,选择抑制率最高的一组细胞进行抗性筛选,获得稳定转染细胞株,分别用RT-PCR和Western blot检验HPSE mRNA和蛋白表达受抑制情况,分别采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法和集落形成实验测定细胞增殖能力,分别采用Matrigel Invasion,Transwell Migration和Adhesion Assay方法测定细胞体外侵袭、迁移和黏附能力。结果:用荧光定量PCR对不同shRNA干扰载体的干扰效果进行检测,结果显示,pGPU6/GFP/Neo-HPSE-1222组相对拷贝数为0.936±0.417,与其他3组相比,差异有统计学意义,抑制率为48.63%。获得的该组稳定干扰表达SKOV3细胞系,经RT-PCR和Western blot检验其HPSE表达明显减少。细胞生长曲线显示干扰组细胞倍增时间延长。干扰组与对照组集落形成率分别为0.0433±0.0451和0.0397±0.00687,差异无统计学意义(P>0.05)。迁移能力实验中,干扰组与对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。干扰组细胞黏附能力高于对照组(P<0.05)。侵袭能力实验干扰组低于对照组(P<0.05)。结论:采用构建shRNA干扰载体对HPSE基因进行干扰,有效地抑制了HPSE基因的活性,降低了卵巢癌细胞侵袭能力,黏附能力增强。 展开更多
关键词 卵巢肿瘤 细胞系 肿瘤侵润 乙酰肝素酶 RNAi shrna表达载体 细胞功能
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细胞周期相关因子CDCA3基因shRNA表达载体的构建及鉴定 被引量:1
13
作者 李娟 唐刘君 +5 位作者 王晓辉 查欣 胡中倩 邢小翠 杨晓明 汪思应 《安徽医学》 2012年第2期136-140,共5页
目的设计能转录短发夹状RNA(short hairpin RNAs,shRNA)的DNA序列,构建能有效下调CDCA3蛋白表达的shRNA真核表达载体,研究其对CDCA3表达的影响,以便进一步研究CDCA3的功能。方法根据文献获得CDCA3的siRNA靶序列,依据RNA干扰机制和shRNA... 目的设计能转录短发夹状RNA(short hairpin RNAs,shRNA)的DNA序列,构建能有效下调CDCA3蛋白表达的shRNA真核表达载体,研究其对CDCA3表达的影响,以便进一步研究CDCA3的功能。方法根据文献获得CDCA3的siRNA靶序列,依据RNA干扰机制和shRNA靶序列的设计原则,以CDCA3基因为靶基因,合成一对编码shRNA的两条DNA序列,经退火后合成DNA双链,再克隆至shRNA表达载体pSIREN-DNRDsRed质粒中,连接产物转化E.coilJM109感受态细胞,然后挑取克隆提质粒,进行酶切鉴定和DNA序列测定。将构建成功的载体通过脂质体介导转染导入人胚肾HEK293细胞,采用Western blot法和Realtime RT-PCR,检测特异性shRNA对CDCA3蛋白在mRNA及蛋白表达水平的抑制效果。结果成功构建靶向CDCA3蛋白的特异shRNA的真核表达载体;转染HEK293细胞后,可显著下调CDCA3在细胞内的mRNA水平及蛋白表达水平。结论 CDCA3蛋白的特异shRNA的真核表达载体能显著下调HEK293细胞内的CDCA3蛋白表达。成功构建CDCA3 shRNA表达载体,为进一步研究CDCA3基因的功能提供了实验基础。 展开更多
关键词 CDCA3蛋白 RNA干扰 shrna 载体构建
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COX-2 shRNA干扰载体的构建
14
作者 杜清峰 张海宁 姚如永 《中国伤残医学》 2014年第10期39-41,共3页
目的:构建靶向COX-2基因的有效shRNA干扰载体并进行鉴定分析。方法:根据Genbank提供的COX-2 mRNA序列,使用Designer3.0(Genepharma)软件进行设计DNA oligo,构建并化学合成shRNA模板,用酶切和测序方法进行分析鉴定。结果:通过酶切和序列... 目的:构建靶向COX-2基因的有效shRNA干扰载体并进行鉴定分析。方法:根据Genbank提供的COX-2 mRNA序列,使用Designer3.0(Genepharma)软件进行设计DNA oligo,构建并化学合成shRNA模板,用酶切和测序方法进行分析鉴定。结果:通过酶切和序列测定表明,成功构建了COX-2 shRNA表达载体。结论:构建的COX-2 shRNA干扰载体,为下一步转基因研究,探讨COX-2功能奠定基础。 展开更多
关键词 COX-2 RNA干扰 shrna载体 COX-2
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ADAM28 shRNA干扰载体的构建及对人牙周膜干细胞的抑制效应
15
作者 赵征 邱海燕 +1 位作者 傅兰 李杰 《上海口腔医学》 CAS CSCD 北大核心 2020年第5期476-481,共6页
目的:探讨金属蛋白酶解离素28(ADAM28)shRNA干扰载体对人牙周膜干细胞(human periodontal ligament stem cells,HPDLSC)内ADAM28基因表达的抑制作用,为先天性牙根发育不全疾病的基因治疗提供实验依据。方法:设计合成4对特异性shRNA干扰... 目的:探讨金属蛋白酶解离素28(ADAM28)shRNA干扰载体对人牙周膜干细胞(human periodontal ligament stem cells,HPDLSC)内ADAM28基因表达的抑制作用,为先天性牙根发育不全疾病的基因治疗提供实验依据。方法:设计合成4对特异性shRNA干扰片段,与pGPU6/GFP/Neo载体连接,构建、鉴定ADAM28 shRNA干扰载体并转染HPDLSC 48 h后,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western印迹分析检测抑制效率。采用SPSS 21.0软件包对数据进行统计学分析。结果:酶切和测序鉴定证明双链shRNA正确插入表达载体pGPU6/GFP/Neo,重组干扰载体构建成功并高效转染HPDLSC。QRT-PCR和Western印迹检测显示,pGPU6/GFP/Neo-ADAM28-shRNA1-4均有显著的抑制效率,shRNA1的抑制效率最高;ADAM28-shRNA1-4组与未转染组、阴性对照组比较,差异均有显著性(P<0.05)。结论:ADAM28 shRNA干扰载体可有效抑制HPDLSC内ADAM28的基因表达。 展开更多
关键词 金属蛋白酶解离素28 shrna 干扰载体 人牙周膜干细胞
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增强型绿色荧光蛋白RNAi表达载体的构建和鉴定
16
作者 干惠珠 张桂珍 +3 位作者 卜丽莎 杨绍娟 高申 郑德明 《中国实验诊断学》 北大核心 2011年第4期619-621,共3页
目的构建靶向增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)的RNA干扰质粒载体。方法设计并合成针对EGFP编码区的模板寡核苷酸单链,克隆入pSilencerTM 3.1-H1 neo载体中,对重组质粒进行酶切鉴定和DNA序列测定。结果重组质粒经限制性内切酶酶切得到66 bp... 目的构建靶向增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)的RNA干扰质粒载体。方法设计并合成针对EGFP编码区的模板寡核苷酸单链,克隆入pSilencerTM 3.1-H1 neo载体中,对重组质粒进行酶切鉴定和DNA序列测定。结果重组质粒经限制性内切酶酶切得到66 bp和4.3 kb条带;重组阳性克隆测序结果与实验设计的模板寡核苷酸序列相符。结论成功构建靶向EGFP的RNA干扰表达载体,为RNA干扰技术在实验室的进一步开展奠定基础。 展开更多
关键词 RNAI 增强型绿色荧光蛋白 shrna表达载体
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小鼠NMDA受体NR2B亚基短发夹RNA干扰真核表达载体的构建与鉴定
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作者 章饶香 《现代医药卫生》 2013年第7期1008-1009,共2页
目的设计并构建小鼠N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体2B亚基(NR2B)短发卡RNA干扰真核表达载体并鉴定。方法根据NMDA受体NR2B mRNA编码序列设计并合成针对NR2B的特异性RNA干涉片段,将其克隆入pYr-1.1质粒载体,构建NR2B短发夹RNA(shRNA)真核... 目的设计并构建小鼠N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体2B亚基(NR2B)短发卡RNA干扰真核表达载体并鉴定。方法根据NMDA受体NR2B mRNA编码序列设计并合成针对NR2B的特异性RNA干涉片段,将其克隆入pYr-1.1质粒载体,构建NR2B短发夹RNA(shRNA)真核表达载体pYr-1.1-GRIN2B-shRNA,并对其进行酶切和测序鉴定。结果酶切和测序结果均证明NMDA受体NR2B shRNA已经插入质粒载体pYr-1.1。结论 NMDA受体NR2B shRNA真核表达载体pYr-1.1-GRIN2B-shRNA构建成功。 展开更多
关键词 小鼠 RNA干扰 NMDA受体NR2B亚基 shrna干扰载体
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Egr-1基因反义干扰表达载体的构建与鉴定
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作者 刘锐锐 李聪慧 +1 位作者 虞游 陈建明 《杭州师范大学学报(自然科学版)》 CAS 2017年第6期618-622,共5页
为构建可在人肝癌细胞中稳定表达Egr-1基因短发夹RNA(shRNA)的表达载体,设计合成Egr-1基因shRNA片段,连接到经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切的pGreenPuro^(TM)shRNA真核表达载体中,连接产物转化大肠杆菌后挑取阳性菌落扩大培养,经菌液PCR法初步... 为构建可在人肝癌细胞中稳定表达Egr-1基因短发夹RNA(shRNA)的表达载体,设计合成Egr-1基因shRNA片段,连接到经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切的pGreenPuro^(TM)shRNA真核表达载体中,连接产物转化大肠杆菌后挑取阳性菌落扩大培养,经菌液PCR法初步鉴定为pGreenPuro-Egr-1shRNA重组子的重组子DNA,用测序法进一步鉴定,结果显示成功构建了Egr-1基因shRNA的反义干扰表达载体pGreenPuro-Egr-1shRNA. 展开更多
关键词 EGR-1基因 shrna 反义干扰 载体构建
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靶向DNA修复基因ERCC6的shRNA载体构建及干扰效果评价
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作者 徐阳 胡芬 +4 位作者 左桂福 王亮 郑向靖 孙渝祥 赵丽娜 《基因组学与应用生物学》 CAS CSCD 北大核心 2018年第7期3158-3163,共6页
构建靶向ERCC6基因的短发夹RNA(short hairpin RNA,sh RNA)真核表达载体,评价其对肺癌细胞ERCC6表达的干扰效果。依据ERCC6基因的核苷酸序列和小干扰RNA的设计原则,设计并合成靶向ERCC6基因的3对ERCC6-sh RNAs和1对阴性对照NC-sh RNA... 构建靶向ERCC6基因的短发夹RNA(short hairpin RNA,sh RNA)真核表达载体,评价其对肺癌细胞ERCC6表达的干扰效果。依据ERCC6基因的核苷酸序列和小干扰RNA的设计原则,设计并合成靶向ERCC6基因的3对ERCC6-sh RNAs和1对阴性对照NC-sh RNA片段,退火后连接至表达载体p GPU6/GFP/Neo中,重组载体经测序鉴定后转染肺癌SPC-A-1细胞中观察绿色荧光蛋白的表达情况,实时荧光定量PCR和Western blotting方法检测ERCC6基因表达的变化。经测序分析证实,各ERCC6-sh RNA的表达载体均构建成功。转染重组质粒48 h后的各组细胞均有绿色荧光表达。实时荧光定量PCR和Western blotting表明,相对于阴性对照组,ERCC6-sh RNA1、ERCC6-sh RNA2、ERCC6-sh RNA3三个实验组SPC-A-1细胞中ERCC6基因在m RNA和蛋白水平上的表达均显著降低(p〈0.05),其中ERCC6-sh RNA3载体的干扰效果最佳。本研究成功构建并筛选了靶向ERCC6基因的sh RNA高效干扰载体,能够有效抑制ERCC6基因在肺癌细胞中的表达,这为进一步研究ERCC6基因与肿瘤发生分子机制和化疗耐药的相关性提供了帮助。 展开更多
关键词 ERCC6 RNA干扰 shrna 载体构建
原文传递
Prohibitin基因的shRNA真核表达载体的构建及鉴定
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作者 何谦 张淑群 +2 位作者 赵丽华 王香玲 楚雍烈 《第四军医大学学报》 CAS 北大核心 2009年第20期2057-2060,共4页
目的:构建靶向prohibitin基因的shRNA真核表达载体.方法:根据prohibitin mRNA序列,利用Ambion网上设计软件设计两条针对该基因不同靶点的shRNA干扰序列,克隆到线性化的质粒载体上,并进行酶切鉴定和测序.结果:酶切结果表明构建的shRNA已... 目的:构建靶向prohibitin基因的shRNA真核表达载体.方法:根据prohibitin mRNA序列,利用Ambion网上设计软件设计两条针对该基因不同靶点的shRNA干扰序列,克隆到线性化的质粒载体上,并进行酶切鉴定和测序.结果:酶切结果表明构建的shRNA已插入载体,经测序证明与设计一致.结论:成功构建两个靶向prohibitin基因的shRNA真核表达载体,为下一步研究prohibitin基因在肿瘤细胞中的作用和后续的的体内外实验奠定了基础. 展开更多
关键词 prohibitin基因 RNA干扰 shrna 真核表达载体
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