绵羊肺腺瘤病毒中国NM株部分gag基因的克隆与序列分析 被引量：9

1

作者 刘淑英 马学恩 +1 位作者 李景鹏 张九河 《中国病毒学》 CSCD 2004年第2期133-136,共4页

参照GenBank中已发表的绵羊肺腺瘤病毒的基因序列,设计合成一对引物,对绵羊肺腺瘤病毒(Jaagsiekte sheep retrovirus,JSRV)内蒙株的gag基因中主要编码CA蛋白的基因段进行PCR扩增,产物经琼脂糖凝胶电泳分析,呈现一条约897bp的特异条带,... 参照GenBank中已发表的绵羊肺腺瘤病毒的基因序列,设计合成一对引物,对绵羊肺腺瘤病毒(Jaagsiekte sheep retrovirus,JSRV)内蒙株的gag基因中主要编码CA蛋白的基因段进行PCR扩增,产物经琼脂糖凝胶电泳分析,呈现一条约897bp的特异条带,将其回收后克隆入pMD-18 T载体中,并进行序列测定与分析。结果表明,与南非株(基因序列号NC-001494)的gag基因序列比较,核苷酸同源性为83%,推导出的氨基酸同源性为84%。与美国株(基因序列号AF105220)的gag基因序列比较,核苷酸同源性为81.5%,氨基酸同源性为83%。这是我国首次报道的绵羊肺腺瘤病毒的gag基因的一段序列,为我国科研工作者进行更深入的研究奠定基础。 展开更多

关键词 绵羊肺腺瘤病毒 GAG基因 克隆 序列分析 中国NM株 绵羊肺腺瘤病 SPA JSRV

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绵羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白致癌作用的研究进展 被引量：8

2

作者 张亚坤 刘淑英 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2012年第12期1315-1320,共6页

综述了绵羊肺腺瘤病毒(jaagsiekte sheep retrovirus,JSRV)的囊膜蛋白(envelope protein,Env)在致癌过程中的重要作用以及在JSRV致癌转化细胞时,PI3K-Akt-mTOR和Ras-Raf-MEK-MAPK这两个主要细胞信号转导通路,以期为JSRV和人肺癌的相关... 综述了绵羊肺腺瘤病毒(jaagsiekte sheep retrovirus,JSRV)的囊膜蛋白(envelope protein,Env)在致癌过程中的重要作用以及在JSRV致癌转化细胞时,PI3K-Akt-mTOR和Ras-Raf-MEK-MAPK这两个主要细胞信号转导通路,以期为JSRV和人肺癌的相关研究提供参考。 展开更多

关键词 绵羊肺腺瘤病毒 囊膜蛋白 致癌基因 信号转导

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自然感染绵羊肺腺瘤病毒羊肺组织线粒体自噬分子表达分析

3

作者 梁浚哲 段续接 +3 位作者 杜晓悦 张良 李慧萍 刘淑英 《中国农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第8期147-156,共10页

为分析自然感染绵羊肺腺瘤病毒(Jaagsiekte sheep retrovirus,JSRV)羊肺组织中线粒体的质量及自噬相关蛋白表达的变化,本研究将自然感染JSRV羊的肺组织作为研究对象,利用病理组织学、PCR和免疫组化法对自然感染JSRV羊肺组织进行鉴定。... 为分析自然感染绵羊肺腺瘤病毒(Jaagsiekte sheep retrovirus,JSRV)羊肺组织中线粒体的质量及自噬相关蛋白表达的变化,本研究将自然感染JSRV羊的肺组织作为研究对象,利用病理组织学、PCR和免疫组化法对自然感染JSRV羊肺组织进行鉴定。利用透射电镜技术观察病羊肺组织中线粒体形态结构变化,分别采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和蛋白免疫印迹法(WB)检测感染组羊肺组织中线粒体相关因子线粒体外膜蛋白20(Outer membrane translocase 20,TOMM20)、线粒体内膜蛋白(Inner membrane translocase 23,TIMM2(3)、热休克蛋白60(Heat shock proteins 60,HSP60)的mRNA和蛋白水平的相对表达量,利用WB检测病羊肺组织线粒体蛋白中自噬相关因子Beclin1、LC3和选择性自噬受体p62蛋白水平的相对表达量。结果表明:(1)PCR扩增的目的条带与JSRV env预期扩增片段大小一致。光镜下可见肺组织中肺泡Ⅱ型上皮细胞呈乳头状生长,且伸入肺泡中,同时免疫组化结果显示在增生的肺泡Ⅱ型细胞中检测到JSRV Env大量表达,而阴性对照组未检出。(2)与健康对照组相比,透射电镜观察到感染组羊组线粒体大量损伤,并且出现双层膜结构的线粒体自噬体包裹损伤的线粒体,TOMM20、TIMM23和HSP60的mRNA相对表达水平和蛋白相对表达水平(P<0.01)均极显著下降。(3)自噬因子Beclin1(P<0.05)和LC3(P<0.01)蛋白相对表达水平显著升高,p62相对表达显著下降(P<0.001)。综上,本研究发现自然感染JSRV羊肺组织中线粒体损伤严重并出现线粒体自噬现象,为JSRV的致病机制提供新的研究方向。 展开更多

关键词 绵羊肺腺瘤病毒 绵羊肺组织 线粒体损伤 线粒体自噬

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基于转录组学分析自然感染绵羊肺腺瘤病毒患羊肺肿瘤组织中转录差异基因及病毒致瘤机制的研究

4

作者 段续接 杨惠 +4 位作者 孙志伟 杜晓悦 张培 梁浚哲 刘淑英 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期185-194,共10页

绵羊肺腺瘤病(OPA)是由绵羊肺腺瘤病毒(JSRV)引起的绵羊传染性肺肿瘤疾病。为探究JSRV对绵羊肺脏的致瘤机制,本研究从自然感染JSRV的羊(OPA患羊)肺肿瘤组织和健康羊肺组织中提取总RNA,构建二者的cDNA文库后采用Illumina Hi Seq 4000高... 绵羊肺腺瘤病(OPA)是由绵羊肺腺瘤病毒(JSRV)引起的绵羊传染性肺肿瘤疾病。为探究JSRV对绵羊肺脏的致瘤机制,本研究从自然感染JSRV的羊(OPA患羊)肺肿瘤组织和健康羊肺组织中提取总RNA,构建二者的cDNA文库后采用Illumina Hi Seq 4000高通量测序平台进行转录组学测序(RNA-Seq),采用DESeqR筛选健康绵羊与患病绵羊肺组织中的转录差异基因,并以P<0.05和log2(Fold change)≥1筛选转录显著差异基因。通过GO和KEGG数据库对转录显著差异基因进行GO功能和KEGG信号通路的富集分析,并采用RT-qPCR对随机选择的10个转录显著差异基因进行验证。结果显示,与对照组相比,OPA羊肺肿瘤组织中共筛选到1 360个转录上调基因和783个转录下调基因,其中154个转录显著上调基因,212个转录显著下调基因。GO功能分析显示,转录显著差异基因显著富集在178个GO条目中,包括114个生物过程(BP)、19个细胞成分(CC)和45个分子功能(MF),主要涉及生长因子活性、复制后修复、NAD^(+)二磷酸酶活性、核苷代谢过程和鸟苷核苷酸交换因子活性等生物学功能。KEGG分析显示转录显著差异基因主要富集在细胞增殖、分化和肿瘤生成,如PI3K/Akt、MAPK和Hippo等信号通路。RT-qPCR结果显示,10个转录显著差异基因与RNA-Seq筛选结果均一致。本研究进一步通过RT-qPCR、western blot检测Hippo信号通路核心蛋白哺乳动物STE20样蛋白激酶1/2 (MST1/2)、大肿瘤抑制因子1/2 (LATS1/2)、YES相关蛋白1/2 (YAP1)在两组绵羊肺组织样品中的转录及表达水平和YAP1的磷酸化水平(p-YAP1);采用免疫组化试验(IHC)检测Hippo信号通路中上述核心蛋白在两组绵羊肺组织中的表达及定位。RT-qPCR结果显示,与对照组相比,OPA羊肺组织中MST1和YAP1 mRNA的转录水平均极显著上调(P<0.01、P<0.001),LATS1 mRNA的转录水平显著上调(P<0.05)。Western blot结果显示,MST1/2蛋白在59 ku、YAP1和p-YAP1蛋白在65 ku、L 展开更多

关键词 绵羊肺腺瘤病 绵羊肺腺瘤病毒 转录组学分析 Hippo信号通路

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绵羊肺腺瘤病毒NM株前病毒gag基因的克隆与序列分析 被引量：6

5

作者 刘淑英 马学恩 李景鹏 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第1期54-57,共4页

参照GenBank中已发表的绵羊肺腺瘤病毒(JSRV)的全基因序列,设计合成3对引物,对JSRVNM株的gag基因分3段进行PCR扩增,经琼脂糖凝胶电泳分析,分别呈3条531、888和949bp的特异条带,将其分别克隆入pMD 18T载体中,进行序列测定并拼接序列,得... 参照GenBank中已发表的绵羊肺腺瘤病毒(JSRV)的全基因序列,设计合成3对引物,对JSRVNM株的gag基因分3段进行PCR扩增,经琼脂糖凝胶电泳分析,分别呈3条531、888和949bp的特异条带,将其分别克隆入pMD 18T载体中,进行序列测定并拼接序列,得到完整的gag基因序列。分析结果表明,与南非代表株(基因序列号NC 001494)的gag基因序列比较,核苷酸同源性为89 0%,推导出的氨基酸同源性为90%。与美国代表株(基因序列号AF105220)的gag基因序列比较,核苷酸同源性为86 3%,氨基酸同源性为87%。 展开更多

关键词 GAG基因 肺腺瘤病 绵羊 氨基酸同源性 序列比较 序列分析 病毒 基因序列 核苷酸 克隆

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外源性绵羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白激活Akt/mTOR信号通路及调控Beclin1的研究 被引量：6

6

作者 孙晓林 刘淑英 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第4期251-256,共6页

为进一步探究外源性绵羊肺腺瘤病毒(exJSRV)囊膜蛋白(Env)的致病机制,本研究检测了自然感染绵羊肺腺瘤病(OPA)的绵羊肺组织中p-Akt和p-mTOR的表达定位、Akt和mTOR在肺组织中的磷酸化水平以及Beclin1在病肺组织中的表达水平,同时通过表达... 为进一步探究外源性绵羊肺腺瘤病毒(exJSRV)囊膜蛋白(Env)的致病机制,本研究检测了自然感染绵羊肺腺瘤病(OPA)的绵羊肺组织中p-Akt和p-mTOR的表达定位、Akt和mTOR在肺组织中的磷酸化水平以及Beclin1在病肺组织中的表达水平,同时通过表达exJSRV-env的重组表达质粒诱导转化NIH3T3细胞,检测诱导转化的细胞中Akt和mTOR的磷酸化水平、Beclin1的表达水平。此外,在诱导转化的细胞中添加mTOR抑制剂Rapamycin后,检测其对Beclin1表达的影响。结果显示,p-Akt和p-m TOR主要表达于自然感染OPA病变肺组织的肺泡上皮细胞和肿瘤细胞中,与健康肺组织比较,在自然感染OPA病变肺组织中的二者磷酸化水平升高显著(p<0.05),而Beclin1在自然感染OPA病肺组织中的表达降低显著。p-mTOR在转染env的NIH3T3细胞中的磷酸化水平极显著高于对照组细胞(p<0.01),Beclin1在转染env的NIH3T3细胞中的表达量极显著低于正常的NIH3T3细胞(p<0.01)。而添加mTOR抑制剂Rapamycin后转染env的NIH3T3细胞与对照组细胞相比,Beclin1的表达水平显著上调(p<0.05)。结果表明,自然感染OPA的病肺组织和转染env的NIH3T3细胞的Akt/mTOR信号通路被激活,并通过该通路抑制自噬,提示exJSRV-env可能通过抑制病变细胞的自噬促进肿瘤的形成。本研究为进一步探索JSRV Env诱导转化细胞及与细胞自噬之间的关系的研究奠定了基础。 展开更多

关键词 绵羊肺腺瘤 外源性绵羊肺腺瘤病毒 囊膜蛋白 AKT/MTOR 信号转导通路

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JSRV-env慢病毒过表达载体构建及其对NIH3T3细胞增殖的影响 被引量：5

7

作者 杨惠 刘淑英 《中国农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第7期120-127,共8页

为研究绵羊肺腺瘤病毒(Jaagsiekte sheep retrovirus,JSRV)囊膜蛋白(Envelope,env)对NIH3T3细胞(小鼠胚胎成纤维细胞)增殖的影响,构建pCMV-dR8.91-JSRV-env慢病毒过表达载体并感染NIH3T3细胞。将JSRV-env基因连接红色荧光慢病毒报告载体... 为研究绵羊肺腺瘤病毒(Jaagsiekte sheep retrovirus,JSRV)囊膜蛋白(Envelope,env)对NIH3T3细胞(小鼠胚胎成纤维细胞)增殖的影响,构建pCMV-dR8.91-JSRV-env慢病毒过表达载体并感染NIH3T3细胞。将JSRV-env基因连接红色荧光慢病毒报告载体pCMV-dR8.91,基因测序正确后将载体命名为pCMV-dR8.91-JSRV-env。将pCMV-dR8.91-JSRV-env重组质粒和包装辅助质粒共转染HEK 293T细胞包装产生JSRV-env重组慢病毒。将重组慢病毒悬液利用超速离心沉淀法浓缩,real-time PCR测定病毒滴度。浓缩病毒转导NIH3T3细胞72h后,噻唑蓝(MTT)检测细胞增殖情况。结果显示:env同源重组入pCMV-dR8.91载体,测序结果与预期序列一致;pCMV-dR8.91-JSRV-env与包装辅助质粒共转染HEK 293T细胞72h,real-time PCR验证JSRV-env过表达极显著(P<0.01),JSRV-env重组慢病毒平均滴度为2.99×10^8 IU/mL;MTT分析显示10μg JSR-env慢病毒感染NIH3T3细胞72h显著促进NIH3T3细胞增殖(P<0.05)。综上,成功构建了JSRV-env慢病毒过表达载体,证实JSRV-env能够促进NIH3T3细胞增殖。 展开更多

关键词 绵羊肺腺瘤病毒 囊膜基因 慢病毒 细胞增殖 致病机制

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绵羊肺腺瘤病毒检测方法的研究进展 被引量：5

8

作者 朱福余 于立新 +1 位作者 么宏强 马学恩 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2014年第4期236-241,共6页

绵羊肺腺瘤(OPA)是由β-反转录病毒属绵羊肺腺瘤病毒(JSRV)引起的一种肿瘤性传染病,该病潜伏期长,经呼吸道传播,冬季圈养种羊发病率高,目前无治疗措施,病死率为100%。OPA的持续存在对种羊生产形成了潜在威胁并造成较大经济损失,严重危... 绵羊肺腺瘤(OPA)是由β-反转录病毒属绵羊肺腺瘤病毒(JSRV)引起的一种肿瘤性传染病,该病潜伏期长,经呼吸道传播,冬季圈养种羊发病率高,目前无治疗措施,病死率为100%。OPA的持续存在对种羊生产形成了潜在威胁并造成较大经济损失,严重危害养羊业健康发展。所以,对OPA的早期精确诊断是防制本病的前提,尤其是在出入境检验检疫过程中对进出口羊的JSRV检测尤为重要。随着分子生物学技术的不断发展,JSRV分子生物学检测方法也得到不断的创新和改进。作者就近年来针对检测JSRV的聚合酶链式反应(PCR)、核酸探针杂交技术、酶联免疫吸附试验(ELISA)、环介导等温扩增技术(LAMP)等方法的研究概况作一综述,为寻找快速准确并适用于出入境检疫的JSRV检测方法和进一步发展研究新型JSRV检测方法提供参考。 展开更多

关键词 绵羊肺腺瘤 绵羊肺腺瘤反转录病毒 检测方法

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绵羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白引起绵羊绒毛膜滋养层细胞的恶性转化 被引量：5

9

作者 赵娟 徐斯日古楞 +1 位作者 李慧萍 刘淑英 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第5期1089-1095,共7页

为了明确绵羊肺腺瘤病毒(JSRV)囊膜蛋白(Env)的致瘤作用,将重组真核表达质粒pEGFP-C1/exJSRVenv和pEGFP-C1/enJSRV-env分别转染到永生化绵羊绒毛膜滋养层细胞(STCs)中,筛选最佳转染条件并利用软琼脂集落形成试验检测是否引起细胞的恶性... 为了明确绵羊肺腺瘤病毒(JSRV)囊膜蛋白(Env)的致瘤作用,将重组真核表达质粒pEGFP-C1/exJSRVenv和pEGFP-C1/enJSRV-env分别转染到永生化绵羊绒毛膜滋养层细胞(STCs)中,筛选最佳转染条件并利用软琼脂集落形成试验检测是否引起细胞的恶性转化;用平板克隆试验检测囊膜蛋白的表达对细胞增殖的影响。结果显示:在STCs中转染pEGFP-C1/exJSRV-env质粒后细胞在软琼脂中生长并产生集落,同时表现细胞接触抑制性消失;转染pEGFP-C1/enJSRV-env质粒的STCs则表现为不能在软琼脂中产生集落;平板克隆试验结果经SPSS软件分析,转染pEGFP-C1/exJSRV-env的绵羊绒毛膜滋养层细胞的克隆形成率显著高于转染pEGFP-C1/enJSRV-env细胞、pEGFP-C1空载体的细胞以及未转染的细胞(P<0.01)。exJSRV-Env的表达可以诱导STCs发生恶性转化以及细胞增殖。本试验可以为进一步探讨绵羊肺腺瘤逆转录病毒囊膜蛋白的功能提供理论依据,并为研究绵羊肺腺瘤病的致瘤机制提供新思路。 展开更多

关键词 绵羊肺腺瘤逆转录病毒 囊膜蛋白 恶性转化 细胞增殖

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外源性绵羊肺腺瘤病毒实时荧光RPA检测方法的建立

10

作者 刘然 张琳 刘淑英 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第2期278-284,共7页

为实现对外源性绵羊肺腺瘤病毒(exJSRV)的快速检测,根据基因组中序列保守的env基因设计特异性引物和探针,通过优化反应条件和反应体系,建立了exJSRV的实时荧光RPA检测方法,并通过灵敏度、特异性、重复性及样品检测进行评价。结果显示,... 为实现对外源性绵羊肺腺瘤病毒(exJSRV)的快速检测,根据基因组中序列保守的env基因设计特异性引物和探针,通过优化反应条件和反应体系,建立了exJSRV的实时荧光RPA检测方法,并通过灵敏度、特异性、重复性及样品检测进行评价。结果显示,该方法最佳反应温度为40℃,用时短,仅需20 min即可完成扩增;灵敏度高,最低可检测到10^(6)ng/L的cDNA模板,纯化后的cDNA模板最低可检测到10 ng/L,与PCR结果一致;特异性强,能准确检测到exJSRV,与小反刍兽疫病毒(PPRV)、羊败血性链球菌(OSS)、牛肠道病毒(BEV)、传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛副流感病毒3型(BPIV3)、肺炎支原体(MO)等继发呼吸道症状的病原无交叉反应;重复性好,对于相同质量浓度的模板cDNA检测结果一致;可有效检测出病羊肺组织、鼻液及外周血白细胞内的exJSRV,与PCR结果一致。结果表明,该方法可实现exJSRV的快速检测,为绵羊肺腺瘤病(OPA)的诊断及防控提供可靠依据。 展开更多

关键词 绵羊肺腺瘤 绵羊肺腺瘤病毒 重组酶聚合酶恒温扩增技术

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绵羊肺腺瘤病毒env基因致瘤机制 被引量：4

11

作者 孔汉金 张克山 +2 位作者 刘永杰 尚佑军 刘湘涛 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第5期504-508,共5页

绵羊肺腺瘤病是由外源性绵羊肺腺瘤病毒(exJSRV)感染引起的肺脏肿瘤性疾病,病毒囊膜基因(env)是引起细胞转化的主要因素。JSRV env蛋白通过与细胞受体结合激活多种信号转导系统,启动细胞内抑制细胞凋亡和刺激细胞增生从而引起细胞癌变。... 绵羊肺腺瘤病是由外源性绵羊肺腺瘤病毒(exJSRV)感染引起的肺脏肿瘤性疾病,病毒囊膜基因(env)是引起细胞转化的主要因素。JSRV env蛋白通过与细胞受体结合激活多种信号转导系统,启动细胞内抑制细胞凋亡和刺激细胞增生从而引起细胞癌变。对env致瘤机制的研究一直是揭示JSRV致病机理研究领域中的热点。本文就对JSRV编码的env基因的致瘤机制及研究进展作综述。 展开更多

关键词 绵羊肺腺瘤 囊膜蛋白 致瘤机制

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绵羊肺腺瘤病毒套式RT-PCR检测方法的建立 被引量：4

12

作者 王金良 李娇 +1 位作者 沈志强 张文杰 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2010年第9期929-933,共5页

根据GenBank中的绵羊肺腺瘤病毒(JSRV)基因组序列,应用Oligo6.0软件设计合成了2对引物,外部引物的扩增片段大小为467bp,内部引物的扩增片段大小为214bp,建立了一种快速检测JSRV的套式RT-PCR检测方法。试验结果显示,该检测方法与同属的... 根据GenBank中的绵羊肺腺瘤病毒(JSRV)基因组序列,应用Oligo6.0软件设计合成了2对引物,外部引物的扩增片段大小为467bp,内部引物的扩增片段大小为214bp,建立了一种快速检测JSRV的套式RT-PCR检测方法。试验结果显示,该检测方法与同属的几种绵羊易感的病毒均无交叉反应,比普通RT-PCR方法敏感性高,具有重复性好、特异性强、敏感性高等优点,可以准确快速地检测出极低含量的JSRV病原,为绵羊肺腺瘤病的快速诊断、净化及深入研究奠定了基础。 展开更多

关键词 绵羊肺腺瘤病毒 反转录聚合酶链反应 检测

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绵羊肺腺瘤病毒中国NM株gag基因3'端951 bp段的分子克隆与序列分析 被引量：4

13

作者 刘淑英 马学恩 李景鹏 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第3期165-168,共4页

究参照Genebank中已发表的绵羊肺腺瘤病毒的全基因序列,设计合成一对引物,对JSRV中国NM株的gag基因3'端中主要编码核衣壳(NC)蛋白的基因段进行PCR扩增,产物经琼脂糖凝胶电泳分析,呈现一条约951bp的特异条带,将其回收后克隆入pMD＿18... 究参照Genebank中已发表的绵羊肺腺瘤病毒的全基因序列,设计合成一对引物,对JSRV中国NM株的gag基因3'端中主要编码核衣壳(NC)蛋白的基因段进行PCR扩增,产物经琼脂糖凝胶电泳分析,呈现一条约951bp的特异条带,将其回收后克隆入pMD＿18T载体中,并进行序列测定。结果表明,与南非代表株(基因序列号NC＿001494)的gag基因序列比较,核苷酸同源性为95 4%,推导出的氨基酸同源性为95%。与美国代表株(基因序列号AF105220)的gag基因序列比较,核苷酸同源性为91 3%,氨基酸同源性为91%。这是我国首次报道的绵羊肺腺瘤病毒的gag基因的一段序列,为我国科研工作者进行更深入的研究奠定基础。 展开更多

关键词 绵羊肺腺瘤病毒 GAG基因 克隆 序列分析

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绵羊肺腺瘤病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用 被引量：3

14

作者 王金良 于新友 +2 位作者 沈志强 孙翠平 唐娜 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第11期1657-1661,1678,共6页

根据GenBank登录的绵羊肺腺瘤病毒gag基因序列设计1对特异性引物,经RT-PCR扩增出了276bp的片段。产物经回收与pMD18-T Vector连接后转化到基因工程菌DH5a中,提取重组质粒,经PCR及测序鉴定后,作为阳性模板建立SYBR GreenⅠ荧光定量PCR标... 根据GenBank登录的绵羊肺腺瘤病毒gag基因序列设计1对特异性引物,经RT-PCR扩增出了276bp的片段。产物经回收与pMD18-T Vector连接后转化到基因工程菌DH5a中,提取重组质粒,经PCR及测序鉴定后,作为阳性模板建立SYBR GreenⅠ荧光定量PCR标准曲线,并做敏感性试验、特异性试验、重复性试验和临床检测应用。结果表明,标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,产物Tm在82～82.5℃之间,灵敏度为2.22个拷贝/μL,特异性和重复性较好,较常规RT-PCR方法提前1h出检测结果。本试验建立了检测JSRV的SYBRGreenⅠ荧光定量PCR方法,为该病的早期快速诊断,并定量分析JSRV感染程度奠定了基础。 展开更多

关键词 绵羊肺腺瘤病毒 SYBR Green I 实时荧光定量PCR 标准曲线

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绵羊肺腺瘤病毒JSRV-2基因探针的制备与原位杂交检测 被引量：3

15

作者 刘淑英 齐景伟 马学恩 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第2期208-211,共4页

用地高辛随机引物法标记外源性exJSRV特异的JSRV-2片段,制备探针,用原位杂交法检测自然感染绵羊肺腺瘤病(OPA)的病肺组织中JSRV-NM的RNA及前病毒DNA,结果表明OPA患羊肺肿瘤细胞的胞浆和核内都有JSRV-2基因mRNA的表达,同时也检测到了前病... 用地高辛随机引物法标记外源性exJSRV特异的JSRV-2片段,制备探针,用原位杂交法检测自然感染绵羊肺腺瘤病(OPA)的病肺组织中JSRV-NM的RNA及前病毒DNA,结果表明OPA患羊肺肿瘤细胞的胞浆和核内都有JSRV-2基因mRNA的表达,同时也检测到了前病毒DNA,而相应的阴性对照无阳性信号,证实外源性JSRV-NM病毒具有特异性的DNA探针在检测致瘤性前病毒在宿主细胞中的整合具有可信度。 展开更多

关键词 绵羊肺腺瘤病毒 JSRV-2基因 探针 原位杂交

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绵羊基因组中内源性绵羊肺腺瘤病毒相关序列的确定 被引量：1

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作者 吴江鸿 张文广 +1 位作者 刘淑英 李金泉 《畜牧与兽医》 北大核心 2009年第3期15-18,共4页

绵羊都含有与绵羊肺腺瘤病毒（Jaagsiekte sheep retrovirus，JSRV）密切相关的15～20拷贝内源性绵羊肺腺瘤病毒（enJSRV）相关序列。宿主可利用内源性病毒来预防致病性反转录病毒的感染，一些内源性病毒可以有效地干扰相关外源性病毒... 绵羊都含有与绵羊肺腺瘤病毒（Jaagsiekte sheep retrovirus，JSRV）密切相关的15～20拷贝内源性绵羊肺腺瘤病毒（enJSRV）相关序列。宿主可利用内源性病毒来预防致病性反转录病毒的感染，一些内源性病毒可以有效地干扰相关外源性病毒的复制。本试验通过分子生物学手段确定了蒙占绵羊基因组中含有enJSRV6和enJSRV10两个内源性病毒基因而内蒙古白绒山羊中未发现。通过比较内、外源病毒LTR序列的酶切图谱，获得专一作用外源性病毒的核酸内切酶MspI、TfiI、BsaWI，如果将酶切与聚合酶链式反应（PCR）相结合，不需要经过测序就可分辨enJS—RV和外源性绵羊肺腺瘤病毒（exJSRV），形成“酶切-PCR”检测技术，将为绵羊肺腺瘤病的快速诊断提供了新的手段。 展开更多

关键词 蒙古羊 绵羊肺腺瘤病毒 内源性反转录病毒 外源性反转录病毒

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利用JSRV构建啮齿动物LPA模型研究进展 被引量：2

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作者 杨惠 刘淑英 《中国农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第11期98-105,共8页

针对绵羊肺腺瘤病毒(Jaagsiekte sheep retrovirus,JSRV)构建啮齿动物鳞屑样生长型肺腺癌(Lepidic predominant adenocarcinomas,LPA)模型的问题,采用文献检索的方式,以"JSRV"、"adenocarcinomas"、"mouse mod... 针对绵羊肺腺瘤病毒(Jaagsiekte sheep retrovirus,JSRV)构建啮齿动物鳞屑样生长型肺腺癌(Lepidic predominant adenocarcinomas,LPA)模型的问题,采用文献检索的方式,以"JSRV"、"adenocarcinomas"、"mouse model"为检索词,对利用JSRV构建啮齿动物LPA模型的相关文献进行归纳整理。结果表明:该模型主要构建方法为干扰质粒介导体内细胞转化或培育转基因动物;该模型中被激活的信号通路为肿瘤经典信号通路PI3K/Akt及MAPK信号通路;该模型具备相对完善的生物信息学数据支撑,是深入探讨LPA分子水平致病机制的良好模型。在LPA的致病机制以及LPA不同发病阶段靶向药物筛选方面有待进一步研究。 展开更多

关键词 绵羊肺腺瘤病毒 鳞屑样生长型肺腺癌 肿瘤模型 信号通路 致病机制

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内蒙古包头市1例绵羊肺腺瘤病的诊断与病毒env基因分析 被引量：1

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作者 段续接 杜晓悦 +5 位作者 张培 王金玲 丁玉林 张良 李慧萍 刘淑英 《内蒙古农业大学学报（自然科学版）》 CAS 2022年第5期16-22,共7页

绵羊肺腺瘤(Ovine pulmonary adenomatosis,OPA)是由绵羊肺腺瘤病毒(Jaagsiekte sheep retrovirus,JSRV)引起的慢性、进行性、接触性绵羊肺肿瘤疾病。本研究通过尸体剖检、病理组织学、PCR、免疫组织化学和蛋白免疫印迹等方法确诊了1例... 绵羊肺腺瘤(Ovine pulmonary adenomatosis,OPA)是由绵羊肺腺瘤病毒(Jaagsiekte sheep retrovirus,JSRV)引起的慢性、进行性、接触性绵羊肺肿瘤疾病。本研究通过尸体剖检、病理组织学、PCR、免疫组织化学和蛋白免疫印迹等方法确诊了1例绵羊肺腺瘤病,用病毒env基因测序结果进行基因结构和遗传进化分析。病理诊断结果显示,尸体剖检见肺肿大且质地坚实,肺表面有大量白色结节,肺叶上有数个有光泽的实变区,肺切面可见大面积实变区;光镜下可见肺泡Ⅱ型上皮细胞增生明显,呈立方状或柱状生长形成典型的“菜花样”腺瘤灶,肺泡腔内可见巨噬细胞。在病原(JSRV)的env和U3区分别设计两对引物的PCR检测结果显示,所扩增的目的条带大小与预期扩增片段大小一致,同时序列分析结果显示JSRV env与本实验室上传至GenBank中的参考序列JQ837489同源性为97.7%,JSRV env与JQ837489和新疆株KP691837聚为一支,亲缘关系较近;采用本实验室制备的JSRV的囊膜蛋白(Env)的多克隆抗体为一抗进行免疫组织化学检测,结果显示在增生的肺泡Ⅱ型上皮细胞中出现棕黄色深染的阳性信号;蛋白免疫印迹实验检测肺组织中JSRV Env相对表达量的结果显示,在80 kDa处表达特异性条带。研究结果表明,内蒙古包头地区已存在JSRV感染病例,这为今后OPA的诊断提供参考依据。 展开更多

关键词 绵羊肺腺瘤 绵羊肺腺瘤病毒 病理学 免疫组织化学 PCR

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绵羊肺腺瘤病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立 被引量：2

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作者 斯日古楞 么宏强 +1 位作者 马学恩 王升启 《畜牧与兽医》 北大核心 2011年第7期6-11,共6页

为建立检测绵羊肺腺瘤病毒(Jaagsiekte sheep retrovirus,JSRV)实时荧光定量PCR(Real-time qPCR)方法,根据外源性JSRV-NM株env基因序列,选其保守序列作为目的片段,设计引物和TaqMan探针,以自然病例的肺肿瘤组织基因组DNA为模板,经PCR扩... 为建立检测绵羊肺腺瘤病毒(Jaagsiekte sheep retrovirus,JSRV)实时荧光定量PCR(Real-time qPCR)方法,根据外源性JSRV-NM株env基因序列,选其保守序列作为目的片段,设计引物和TaqMan探针,以自然病例的肺肿瘤组织基因组DNA为模板,经PCR扩增目的基因、克隆,重组质粒鉴定,并严格定量后,梯度稀释作为阳性标准品,优化反应条件进行Real-time qPCR扩增,获得的标准曲线为:Y=-3.308X+47.848,线性相关系数为0.991;Ct值变异系数小,并且灵敏度高,初步建立了检测JSRV前病毒DNA的Real-time qPCR方法。应用该方法对不同来源(A、B、C、D、E组)的绵羊外周血及其他组织样品进行测定其前病毒载量。结果显示B组和C组外周血白细胞、肺脏、肺门淋巴结以及鼻液中检测均为阳性,并发现前病毒DNA的载量在肺脏中明显高于外周血白细胞;D组虽未发现有绵羊肺腺瘤(SPA)临床症状,但在肺门淋巴结里可以检测到;E组中1只绵羊的肺脏也检出低拷贝数的前病毒DNA,而在A组中检测结果均为阴性。本研究对检测未知羊群JSRV感染程度及研究SPA流行病学等均有重要意义。 展开更多

关键词 绵羊肺腺瘤病毒 实时荧光定量PCR TAQMAN探针 前病毒DNA

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北京地区绵羊肺腺瘤病的病理学及PCR诊断 被引量：1

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作者 王林 韦海涛 +5 位作者 李志军 王玉田 陈立本 李刚 梅力 冯小宇 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2014年第5期22-24,共3页

对北京某种羊场的疑似绵羊肺腺瘤病的羊进行临床诊断、病理组织学观察和PCR检测。结果显示,(1)"小推车试验"时从鼻腔里流出黏稠鼻液;(2)剖检可见肺脏肿大和实变,肺脏和气管内有大量泡沫性液体;(3)病理组织观察到肺脏上皮细胞... 对北京某种羊场的疑似绵羊肺腺瘤病的羊进行临床诊断、病理组织学观察和PCR检测。结果显示,(1)"小推车试验"时从鼻腔里流出黏稠鼻液;(2)剖检可见肺脏肿大和实变,肺脏和气管内有大量泡沫性液体;(3)病理组织观察到肺脏上皮细胞肿瘤性增生,突入肺泡腔;(4)PCR和半巢式PCR能扩增到176bp和129bp的特异性片段;(5)序列比对分析显示,U3区与外源性绵羊肺腺瘤病毒的核苷酸同源性为90.9%-97.7%。综合上述诊断结果确诊该种羊场的疑似病例为绵羊肺腺瘤病。 展开更多

关键词 绵羊肺腺瘤病 绵羊肺腺瘤病毒 病理组织学 PCR诊断

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