寻常疣和跖疣HPV型别及与临床特征关系的差异性 被引量：20

1

作者 明星 李秀翠 +7 位作者 董强 宗丽娜 尹萌萌 王泽锟 葛芸 李京 梁龙 吕世超 《中国皮肤性病学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2020年第11期1233-1237,共5页

目的探讨寻常疣和跖疣患者的主要HPV型别及与临床特征关系的差异。方法记录患者的临床信息;使用PCR、基因测序和TA克隆技术检测HPV型别,分别采用构成比和组间、组内卡方检验比较寻常疣和跖疣患者的主要HPV型别及与临床特征关系的差异。... 目的探讨寻常疣和跖疣患者的主要HPV型别及与临床特征关系的差异。方法记录患者的临床信息;使用PCR、基因测序和TA克隆技术检测HPV型别,分别采用构成比和组间、组内卡方检验比较寻常疣和跖疣患者的主要HPV型别及与临床特征关系的差异。结果mu属的HPV1和α属的HPV2、27和57是寻常疣和跖疣患者的共同主要型别,α属的HPV7是寻常疣患者的主要型别。HPV1型别跖疣患者除和HPV1型别寻常疣患者一样具有疣体单发、疼痛症状比例高的临床特征外,还具有更易感染青少年(≤17岁)、病程短(≤12个月)及疣体中等大小(0.5~1.0 cm)的临床特征。HPV7型别寻常疣好发于男性患者,HPV27型别寻常疣老年患者较HPV2、57型别寻常疣老年患者更多见。结论寻常疣和跖疣患者的主要HPV型别及与临床特征的关系均存在差异。 展开更多

关键词 人乳头状瘤病毒 疣 临床特征 PCR ta克隆

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TA克隆的应用研究 被引量：9

2

作者 栾怡 于修平 +4 位作者 宋长芹 卞继峰 赵蔚明 周亚滨 贾继辉 《山东医科大学学报》 2001年第3期201-202,共2页

目的 :探讨用于PCR扩增产物快速高效的克隆技术。方法 :为制备T载体 ,用SmaI消化质粒 pUC18成纯末端 ,纯化后与TaqDNA聚合酶及dTTP ,75℃反应 2h ,构建成加上T尾的线性 pUC18载体。将由质粒 pBR32 2 HPV16中PCR扩增获得早期蛋白E6的基... 目的 :探讨用于PCR扩增产物快速高效的克隆技术。方法 :为制备T载体 ,用SmaI消化质粒 pUC18成纯末端 ,纯化后与TaqDNA聚合酶及dTTP ,75℃反应 2h ,构建成加上T尾的线性 pUC18载体。将由质粒 pBR32 2 HPV16中PCR扩增获得早期蛋白E6的基因扩增产物 ,根据TA克隆策略克隆至pUC18 T载体中 ,经PCR、限制性酶切分析鉴定重组子 ,并对TA克隆连接条件做了探讨。 结果 :获得重组质粒 pUC18 E6。 结论 :TA克隆采用低温延时连接 ,阳性克隆率高 ,是高效。 展开更多

关键词 ta克隆 聚合酶链反应 乳头状瘤病毒 基因 E6

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使用与Gateway技术兼容的T载体获得入门克隆 被引量：10

3

作者 陈其军 安瑞 +2 位作者 周海梦 陈珈 王学臣 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2004年第10期951-954,共4页

与Gateway技术兼容的农杆菌双元载体系统已开始应用于植物功能基因组的研究 ,但应用这些载体系统的一个瓶颈问题 ,是如何简单、经济和高效地将PCR产物或其他来源的目的DNA片段构建到入门载体上获得入门克隆 .为此 ,将传统的TA克隆技术与... 与Gateway技术兼容的农杆菌双元载体系统已开始应用于植物功能基因组的研究 ,但应用这些载体系统的一个瓶颈问题 ,是如何简单、经济和高效地将PCR产物或其他来源的目的DNA片段构建到入门载体上获得入门克隆 .为此 ,将传统的TA克隆技术与Gateway重组克隆技术进行整合 ,构建了与Gateway技术兼容的两种TA克隆载体 ,用于在克隆PCR产物或其他来源的目的DNA片段的同时获得入门克隆 .利用兼容Gateway技术的TA克隆载体有效地解决了上述瓶颈问题 . 展开更多

关键词 Gateway克隆技术 ta克隆技术 入门载体 T载体 入门克隆

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利用非培养技术研究古井贡酒大曲中的细菌群落结构 被引量：15

4

作者 张会敏 束莹 +3 位作者 周庆伍 李安军 何宏魁 张治洲 《现代食品科技》 EI CAS 北大核心 2014年第4期44-49,共6页

淡雅型白酒古井贡酒大曲中的微生物群落结构一直未在分子水平上得到解析。本文采用构建16s rDNA克隆文库的非培养方法对古井贡酒中温大曲和高温大曲进行细菌群落结构及其多样性研究。所有克隆菌株归为36个OUT,分别属于厚壁菌门(Firmicut... 淡雅型白酒古井贡酒大曲中的微生物群落结构一直未在分子水平上得到解析。本文采用构建16s rDNA克隆文库的非培养方法对古井贡酒中温大曲和高温大曲进行细菌群落结构及其多样性研究。所有克隆菌株归为36个OUT,分别属于厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)和一些未培养菌类,其中厚壁菌门占多数。总体来说,中温大曲明显要比高温大曲细菌多样性更丰富一些。高温大曲的菌种相对比较单一,绝大多数为高温放线菌Thermoactinomyces sanguinis,而且仅存在于高温大曲中,占到高温大曲表面菌群的79.5%,高温大曲曲心菌群的98.5%。中温大曲的两个样本差距比较大。样本S1的优势菌为枝芽孢菌属(Virgibacillus sp.),占85.3%,另外还有少量的未培养菌类(12.9%)。中温大曲S2的细菌多样性比较丰富,优势菌属为乳杆菌属Lactobacillus(25.2%)、葡萄球菌属Staphylococcus(14.3%)、芽孢杆菌属Bacillus(13.4%)和各种未培养菌类(16.8%)。古井大曲中存在大量潜在新种,需要进一步鉴定。 展开更多

关键词 古井贡酒 中温大曲 高温大曲 细菌群落 ta克隆

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pET15b-PEP-1-CAT原核表达质粒的构建及PEP-1-CAT融合蛋白的表达与纯化 被引量：12

5

作者 姚玲玲 王家宁 +1 位作者 黄永章 郭凌郧 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第9期1319-1325,共7页

目的构建pET15b-PEP-1-CAT原核表达质粒,并表达、纯化得到融合蛋白PEP-1-CAT,为防治与氧化应激有关的疾病奠定基础。方法设计并合成两端分别带SalI和BglII酶切位点的CAT引物,用PCR方法以pZeoSV2(+)-CAT质粒为模板,特异性扩增CAT全长cDN... 目的构建pET15b-PEP-1-CAT原核表达质粒,并表达、纯化得到融合蛋白PEP-1-CAT,为防治与氧化应激有关的疾病奠定基础。方法设计并合成两端分别带SalI和BglII酶切位点的CAT引物,用PCR方法以pZeoSV2(+)-CAT质粒为模板,特异性扩增CAT全长cDNA。将扩增的CATcDNA与dATP反应,利用TaqDNA聚合酶具有的非模板依赖性末端转移酶活性在CATcDNA的3'末端加“A”并纯化,然后应用TA克隆策略将纯化后的CATcDNA插入至中间载体pGEM-TEasyVector中得到pGEM-T-CAT。人工合成编码PEP-1的双链寡核苷酸,两端分别引入NdeI和XhoI酶切位点,将其插入pET15b中得到重组质粒pET15b-PEP-1。pGEM-T-CAT和pET15b-PEP-1分别经SalI-BglII和XhoI-BamHI双酶切,利用同尾酶(SalI与XhoI,BglII与BamHI)能酶切产生相同黏性末端的特性,将回收得到的CATcDNA片段与pET15b-PEP-1相连,构建出重组质粒pET15b-PEP-1-CAT,经PCR及酶切鉴定,并通过核苷酸序列测序证实。将鉴定正确的pET15b-PEP-1-CAT重组质粒转化BL21(DE3),用IPTG诱导目的蛋白表达。然后利用重组蛋白N端的组氨酸“标签”(His-tag)对其进行金属螯合亲和层析纯化。结果测序分析证实,克隆入pET15b的PEP-1序列与设计合成的PEP-1序列一致,CAT序列与GeneBank中登录号为“AY028632”的CATcDNA序列一致。SDS-PAGE和Westernblot结果表明,pET15b-PEP-1-CAT在E.coli中获得可溶性高表达,经Ni2+-NTA-树脂柱亲和层析纯化得到了PAGE纯的融合蛋白PEP-1-CAT,并在体外检测到其具有特异的过氧化氢酶活性,活性值为77.15U/g。结论成功构建了原核表达载体pET15b-PEP-1-CAT,并经表达、纯化得到可以天然活性形式穿透细胞的重组过氧化氢酶蛋白,从而为防治心肌缺血再灌注损伤等与氧化应激有关的疾病奠定了基础。 展开更多

关键词 原核表达 过氧化氢酶 ta克隆 同尾酶 融合蛋白

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利用同尾酶技术构建pET15b-PEP-1-CAT重组质粒 被引量：9

6

作者 姚玲玲 王家宁 +1 位作者 黄永章 郭凌郧 《郧阳医学院学报》 2006年第1期1-5,F0002,共6页

目的:利用同尾酶技术构建pET15b-PEP-1-CAT重组质粒,为制备PEP-1-CAT融合蛋白进而为防治心肌缺血再灌注损伤奠定基础。方法:设计并合成两端分别带SalⅠ和BglⅡ酶切位点的CAT引物,用PCR方法以pZeoSV2(+)-CAT质粒为模板,特异性扩增CAT全长... 目的:利用同尾酶技术构建pET15b-PEP-1-CAT重组质粒,为制备PEP-1-CAT融合蛋白进而为防治心肌缺血再灌注损伤奠定基础。方法:设计并合成两端分别带SalⅠ和BglⅡ酶切位点的CAT引物,用PCR方法以pZeoSV2(+)-CAT质粒为模板,特异性扩增CAT全长cDNA。将扩增的CAT cDNA与dATP反应,利用Taq DNA聚合酶具有的非模板依赖性末端转移酶活性在CAT cDNA的3′末端加"A"并纯化,然后应用TA克隆策略将纯化后的CAT cDNA插入至中间载体pGEM-T Easy Vector中,经PCR、限制性酶切分析鉴定重组子pGEM-T-CAT。人工合成编码PEP-1的双链寡核苷酸,两端分别引入NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点,将其插入pET15b中得到重组质粒pET15b-PEP-1,然后酶切鉴定。pGEM-T-CAT和pET15b-PEP-1分别经SalⅠ-BglⅡ和XhoⅠ-BamHⅠ双酶切,利用同尾酶(SalⅠ与XhoⅠ,BglⅡ与BamHⅠ)能酶切产生相同黏性末端的特性,将回收得到的CAT cDNA片段与pET15b-PEP-1相连,构建出重组质粒pET15b-PEP-1-CAT,经PCR及酶切鉴定,并通过核苷酸序列测序证实。结果:获得pET15b-PEP-1-CAT重组子,经测序分析证实,克隆入pET15b的PEP-1序列与设计合成的PEP-1序列一致,CAT序列与GeneBank中登录号为“AY028632”的CAT cDNA序列一致。结论:pET15b-PEP-1-CAT的成功构建为产生融合蛋白H is tag-PEP-1-CAT进而为防治心肌缺血再灌注损伤奠定了基础。 展开更多

关键词 同尾酶 过氧化氢酶 ta克隆 DNA重组 PEP-1肽

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构建定向T载体用于基因克隆和表达 被引量：10

7

作者 钟星 翟超 +5 位作者 陈亮 余晓岚 蒋思婧 严红 杨登想 马立新 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第4期510-519,共10页

传统的T载体克隆方法需要烦琐的后续步骤来筛选和鉴定重组子,并且无法实现目的基因的定向克隆。为了克服这些问题,本研究在pET-23a(+)的基础上构建了定向T载体pETG,首先通过定点诱变消除pET-23a(+)上的两个BfuⅠ位点得到PET-23aM;设计... 传统的T载体克隆方法需要烦琐的后续步骤来筛选和鉴定重组子,并且无法实现目的基因的定向克隆。为了克服这些问题,本研究在pET-23a(+)的基础上构建了定向T载体pETG,首先通过定点诱变消除pET-23a(+)上的两个BfuⅠ位点得到PET-23aM;设计一对引物在5端各引入一个BfuⅠ位点,下游引物紧邻BfuⅠ位点引入13 bp的部分LacO序列,用该引物从pHBM2002上扩增Prrn-gfp表达盒,插入PET-23aM的NdeⅠ和XhoⅠ位点,得到定向T载体pETG。PCR扩增的目的基因通过下游引物引入7 bp剩余的LacO序列,该基因片段与BfuⅠ酶切制备的定向T载体连接、转化大肠杆菌DH10β感受态细胞,通过补加了X-gal的平板筛选蓝色重组子。质粒酶切和PCR鉴定表明蓝色菌落全部为定向插入的重组子,重组效率100%,利用本方法成功地定向克隆了103个人类肝蛋白编码基因cDNA,克隆过程无需复杂的步骤筛选鉴定重组子。随机选择了其中的8个基因的克隆进行表达,结果显示8个克隆均在大肠杆菌中获得成功表达。该结果表明定向T载体构建成功,并且该载体非常适合基因的克隆和表达。 展开更多

关键词 ta克隆 PCR克隆 重组子筛选 蛋白质表达

原文传递

原核表达质粒pET15b-PEP-1-SOD1的构建 被引量：9

8

作者 丁鹏 王家宁 +1 位作者 黄永章 杨波 《新乡医学院学报》 CAS 2006年第2期141-144,共4页

目的构建pET15b-PEP-1-SOD1原核表达质粒。方法通过设计含有特定酶切位点的引物,以含有全长人SOD1 cDNA的质粒(pBluescript II SK-SOD1)为模板,扩增出SOD1 cDNA,将SOD1 cDNA和人工合成的编码PEP-1的双链寡核苷酸克隆至pET15b原核表达载... 目的构建pET15b-PEP-1-SOD1原核表达质粒。方法通过设计含有特定酶切位点的引物,以含有全长人SOD1 cDNA的质粒(pBluescript II SK-SOD1)为模板,扩增出SOD1 cDNA,将SOD1 cDNA和人工合成的编码PEP-1的双链寡核苷酸克隆至pET15b原核表达载体上,进行酶切鉴定及测序分析。结果pET15b-PEP-1-SOD1重组质粒经酶切鉴定含有SOD1 cDNA和编码PEP-1的片段,测序分析证实分别与GeneBank“AB087266”登录的人SOD1 cDNA和合成的PEP-1编码序列完全一致。结论成功地构建了pET15b-PEP-1-SOD1重组质粒,为制备PEP-1-SOD1融合蛋白提供了表达载体。 展开更多

关键词 铜 锌-超氧化物歧化酶 ta克隆 基因重组 蛋白转导域 PEP-1肽

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PEP-1-SOD1融合蛋白的表达及纯化 被引量：7

9

作者 丁鹏 王家宁 +2 位作者 杨波 黄永章 骆丽娜 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2006年第3期240-243,共4页

目的构建原核表达载体pET15bPEP1SOD1,并进行PEP1SOD1融合蛋白表达和纯化。方法以pBluescriptIISKSOD1质粒为模板,PCR扩增SOD1cDNA。经酶切后,分别构建原核表达载体pET15bSOD1和pET15bPEP1SOD1,经测序证实构建成功后,分别转化E.coliBL21... 目的构建原核表达载体pET15bPEP1SOD1,并进行PEP1SOD1融合蛋白表达和纯化。方法以pBluescriptIISKSOD1质粒为模板,PCR扩增SOD1cDNA。经酶切后,分别构建原核表达载体pET15bSOD1和pET15bPEP1SOD1,经测序证实构建成功后,分别转化E.coliBL21(DE3),表达SOD1和PEP1SOD1融合蛋白,并进行鉴定。结果SDSPAGE和Westernblot分析表明,分别在相对分子质量22000和26000处出现SOD1和PEP1SOD1目标表达条带,目的蛋白占菌体总蛋白的30%,两种表达蛋白以天然的、可溶性的形式存在。结论已成功地制备出SOD1和PEP1SOD1融合蛋白。 展开更多

关键词 铜 锌-超氧化物歧化酶 原核表达 ta克隆 PEP-1肽 融合蛋白

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利用非培养技术初步研究古井贡酒窖泥细菌群落结构 被引量：9

10

作者 张会敏 李天婵 +4 位作者 孙美青 周庆伍 李安军 何宏魁 张治洲 《食品工业科技》 CAS CSCD 北大核心 2014年第13期200-206,228,共8页

采用构建16S rDNA克隆文库的非培养方法,对古井贡酒窖泥细菌的群落结构及其多样性进行研究。结果表明:文库含有57个分类操作单元(OTU),793个克隆中未知菌类占60.78%,其中5个克隆得不到任何比对信息,占0.63%。已知菌类分别属于Firmicutes... 采用构建16S rDNA克隆文库的非培养方法,对古井贡酒窖泥细菌的群落结构及其多样性进行研究。结果表明:文库含有57个分类操作单元(OTU),793个克隆中未知菌类占60.78%,其中5个克隆得不到任何比对信息,占0.63%。已知菌类分别属于Firmicutes(31.16%)、Proteobacteria(3.55%)、Bacteroidetes(3.79%)、Synergistetes(0.63%)、Actinobacteria的Atopobium(0.13%)。已知菌类也多半为非培养细菌,其中Firmicutes占多数,但是其中也有一半的细菌相似度偏低,需要进一步验证。 展开更多

关键词 古井贡酒 窖泥 细菌群落 ta克隆

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亚热带两种森林土壤担子菌漆酶基因多样性比较 被引量：7

11

作者 陈香碧 苏以荣 +5 位作者 何寻阳 胡乐宁 梁月明 冯书珍 葛云辉 肖伟 《应用生态学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第10期2699-2704,共6页

漆酶是降解森林凋落物中木质素的关键酶之一,直接影响着森林生态系统碳循环过程.运用TA克隆、测序技术,研究了两种亚热带森林(原生常绿落叶阔叶混交林和人工马尾松林)凋落物层(O层)和土壤表层(A层,0～20cm)降解木质素的担子菌漆酶基因... 漆酶是降解森林凋落物中木质素的关键酶之一,直接影响着森林生态系统碳循环过程.运用TA克隆、测序技术,研究了两种亚热带森林(原生常绿落叶阔叶混交林和人工马尾松林)凋落物层(O层)和土壤表层(A层,0～20cm)降解木质素的担子菌漆酶基因多样性.结果表明:同一土壤层位,原生林土壤中担子菌漆酶基因多样性和种群丰富度高于马尾松林;同一森林生态系统,原生林土壤O层中担子菌漆酶基因多样性和种群丰富度略高于土壤A层,而马尾松林则O层明显低于A层;两森林土壤具有相同含漆酶基因的担子菌优势种群,且大部分优势种群与伞菌目小菇属或侧耳属有较高的氨基酸相似性;与原生林土壤A层和马尾松林土壤O层相比,原生林土壤O层和马尾松林土壤A层中含漆酶基因的担子菌种群分布相对均匀;马尾松林O层与A层之间漆酶基因核苷酸序列的相似性较原生林土壤O层与A层之间的高.表明植被和土壤层位显著影响漆酶基因多样性和群落结构,而植被和土壤层位引起的担子菌可利用底物和土壤pH值的差异可能直接驱动这种影响. 展开更多

关键词 漆酶 森林生态系统 基因多样性 ta克隆 植被

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成人跖疣人乳头瘤病毒分型及与临床特征的关系 被引量：6

12

作者 董强 杨番 +10 位作者 任英云 夏天保 尹萌萌 王泽锟 米霞 刘军连 曹晓佳 刘建军 葛芸 梁龙 吕世超 《中华皮肤科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2017年第10期748-750,共3页

目的检测成人跖疣乳头瘤病毒（HPV）型别，并探讨HPV分型与临床特征的关系。方法采用PCR扩增、基因测序和TA克隆技术检测221例跖疣患者疣体的HPV型，记录患者的年龄、病程、症状和疣体数。结果221例标本中，HPV阳性率为97％（215／221... 目的检测成人跖疣乳头瘤病毒（HPV）型别，并探讨HPV分型与临床特征的关系。方法采用PCR扩增、基因测序和TA克隆技术检测221例跖疣患者疣体的HPV型，记录患者的年龄、病程、症状和疣体数。结果221例标本中，HPV阳性率为97％（215／221）。单一HPV型占96％（206／215），HPV27、2、57和7（Alpha属）分别占44．7％（92／206）、12．1％（25／206）、7．3％（15／206）和0．5％（1／206）；HPV65（Gamma属）占0．5％（1／206）；HPV1、63（Mu属）占33．5％（69／206）和1．5％（3／206）。HPV27、2和57三型感染者之间年龄、病程、疣体个数、疼痛发生率和性别比较，差异均无统计学意义。与HPV27感染者相比，HPV1感染者与年龄≤30岁、病程≤1年、疣体数≤2个和疼痛高发生率相关。结论HPV27、2、57和1是感染成人跖疣患者的主要HPV型。HPV型与患者的临床特征间存在相关性。 展开更多

关键词 乳头状瘤病毒科 基因分型技术 疣 PCR 临床特征 ta克隆

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具有除草剂抗性的TA克隆植物表达载体的构建 被引量：5

13

作者 李梦婷 谭文雍 +2 位作者 孙铭阳 李永光 李文滨 《基因组学与应用生物学》 CAS CSCD 北大核心 2015年第11期2436-2440,共5页

TA克隆载体由于能够用于PCR产物的快速克隆且操作简单,因此被广泛应用。p CXSN是以TA克隆为连接方式的植物表达载体,T-DNA区筛选标记为潮霉素抗性基因。本实验利用抗除草剂基因bar、gdh A替换载体上的潮霉素基因,构建了两种可以直接连接... TA克隆载体由于能够用于PCR产物的快速克隆且操作简单,因此被广泛应用。p CXSN是以TA克隆为连接方式的植物表达载体,T-DNA区筛选标记为潮霉素抗性基因。本实验利用抗除草剂基因bar、gdh A替换载体上的潮霉素基因,构建了两种可以直接连接PCR产物的TA克隆植物表达载体,获得的含有除草剂抗性基因的p CXSN表达载体适合用于基因的正义和反义表达,不需要添加酶切位点,可以直接连接PCR产物,节省载体构建的步骤和时间。 展开更多

关键词 植物表达载体 ta克隆 除草剂

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利用 TA 克隆的方法简便构建入门克隆 被引量：5

14

作者 殷宪伦 王春涛 +2 位作者 孔祥翔 杨永平 胡向阳 《植物分类与资源学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第4期397-402,共6页

Gateway 技术是一种通用型克隆方法,其基于λ噬菌体位点特异性重组,将目的 DNA 快速克隆到各种与 Gateway 技术兼容的目的载体上,不需要进行酶切和连接反应。但存在获得入门克隆过程中相关反应酶制剂价格昂贵,且药品订购时间较长等问题... Gateway 技术是一种通用型克隆方法,其基于λ噬菌体位点特异性重组,将目的 DNA 快速克隆到各种与 Gateway 技术兼容的目的载体上,不需要进行酶切和连接反应。但存在获得入门克隆过程中相关反应酶制剂价格昂贵,且药品订购时间较长等问题。通过对入门载体 pDONR207 的改造,使之产生 3’端具有单个 T-末端的线性化的入门载体,采用 TA 克隆的方法替代 BP 反应,从而简便、经济和快速地获得入门克隆。利用改造后的 Gateway 技术构建拟南芥 SOS2 基因的原核表达载体和真核表达载体,通过原核表达和原生质体瞬时表达证明通过此方法构建的表达载体在原核细胞和真核细胞中都得到了很好的表达。 展开更多

关键词 GATEWAY技术 ta克隆 入门克隆 原核表达 拟南芥原生质体瞬时表达

原文传递

TA载体pEASY-T1 Simple在基因克隆中的新应用 被引量：4

15

作者 杨文丽 丁博 +3 位作者 王俊斌 李明 吕芳芳 谢晓东 《天津农学院学报》 CAS 2011年第2期13-15,19,共4页

在基因克隆操作中,由于常用克隆载体多克隆位点的酶切位点数目有限,造成一些DNA片段的克隆、连接受限。为解决这一问题,本文利用pEASY-T1 S imp le载体无酶切位点的特点,通过TA克隆的方法引入多个单一酶切位点,并对所构建的克隆载体进... 在基因克隆操作中,由于常用克隆载体多克隆位点的酶切位点数目有限,造成一些DNA片段的克隆、连接受限。为解决这一问题,本文利用pEASY-T1 S imp le载体无酶切位点的特点,通过TA克隆的方法引入多个单一酶切位点,并对所构建的克隆载体进行了验证。最后证明,这种方法可高效构建含有不同多克隆位点的载体,克服了对常用克隆载体的依赖,大大提高了基因操作的灵活性和有效性。 展开更多

关键词 ta克隆 pEASY-T1 SIMPLE 多克隆位点

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改进重叠延伸PCR克隆tau基因6种同工异构体 被引量：3

16

作者 李诺敏 刘可夫 +5 位作者 李灵芸 何放 顾文彬 董一名 邓玉林 庆宏 《北京理工大学学报》 EI CAS CSCD 北大核心 2013年第8期871-875,共5页

采用一种改进的重叠延伸PCR技术,通过2次PCR的方法,对人tau基因进行剪切和拼接,实现了tau基因的6种同工异构体的克隆;然后将6种tau基因克隆到真核载体pcDNA4上,通过western blot在蛋白水平验证了tau蛋白的表达.结果表明,这种改进重叠延... 采用一种改进的重叠延伸PCR技术,通过2次PCR的方法,对人tau基因进行剪切和拼接,实现了tau基因的6种同工异构体的克隆;然后将6种tau基因克隆到真核载体pcDNA4上,通过western blot在蛋白水平验证了tau蛋白的表达.结果表明,这种改进重叠延伸PCR方法能够对基因进行多个位置的剪切和连接,由于该法在基因重组过程中无需利用限制性内切酶,因此具有很大的灵活性和简便性. 展开更多

关键词 taU蛋白 重叠延伸PCR 真核表达载体 ta克隆

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基于Xcm I酶切的pUC19-T载体的构建 被引量：3

17

作者 孙程龙 李业伟 +2 位作者 王颖 宫婷 扈荣良 《安徽农业科学》 CAS 北大核心 2011年第17期10182-10184,共3页

[目的]构建以pUC19质粒为基础可利用XcmI内切酶制备的T载体。[方法]化学合成2条含有双XcmI酶切位点的互补寡聚核苷酸链,经过变性、复性后克隆入pUC19质粒的HindIII和BamHI位点之间,通过XcmI酶切后得到一个线性化的带有3'末端突出一... [目的]构建以pUC19质粒为基础可利用XcmI内切酶制备的T载体。[方法]化学合成2条含有双XcmI酶切位点的互补寡聚核苷酸链,经过变性、复性后克隆入pUC19质粒的HindIII和BamHI位点之间,通过XcmI酶切后得到一个线性化的带有3'末端突出一个T碱基的T载体。[结果]经TA克隆验证,制备的pUC19-HB-T载体对PCR产物的克隆率达到95%以上。[结论]构建的pUC19-HB-T载体可用于PCR产物的克隆、测序及后续分子生物学操作。 展开更多

关键词 T载体 Xcm I限制性内切酶 ta克隆

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小偃麦异附加系TaTGA4转录因子基因的克隆与生物信息学分析 被引量：3

18

作者 牛祖彪 李娜 +5 位作者 惠文荣 宋静 黄春丽 高居荣 王洪刚 封德顺 《分子植物育种》 CAS CSCD 北大核心 2015年第1期91-97,共7页

本研究利用Genefishing技术,从经过白粉病菌E09诱导处理12 h的高抗白粉病菌小偃麦(小麦-中间偃麦草异附加系)种质SN6306的c DNA中获得上调表达差异片段,经克隆测序,获得一个375 bp的序列。在NCBI数据库和小麦全长数据库Tri FLDB中进行... 本研究利用Genefishing技术,从经过白粉病菌E09诱导处理12 h的高抗白粉病菌小偃麦(小麦-中间偃麦草异附加系)种质SN6306的c DNA中获得上调表达差异片段,经克隆测序,获得一个375 bp的序列。在NCBI数据库和小麦全长数据库Tri FLDB中进行相似性比对,预测其为TGA4转录因子的一段序列。设计序列的特异引物,经PCR扩增,从SN6306中克隆到小麦Ta TGA4基因的c DNA全长序列,并对该基因及其所编码的氨基酸序列进行了生物信息学分析。结果表明,Ta TGA4基因序列的开放阅读框长度为1 221 bp,编码含406个氨基酸残基的蛋白。BLASTP相似性比对分析显示,Ta TGA4含有b_ZIP1超家族与DOG1超家族两个保守结构域,且该蛋白与小麦的近缘物种节节麦中的同源蛋白一致性达到92%,与乌拉尔图小麦中的同源蛋白一致性达到90%。从多序列联配及系统进化树分析中可以推断出Ta TGA4属于TGA4转录因子类。本研究可为Ta TGA4基因在小麦抗白粉病中的功能研究打下基础。 展开更多

关键词 小偃麦异附加系 转录因子 ta TGA4 基因克隆 生物信息分析

原文传递

3株致病性鸡大肠杆菌P型菌毛结构基因的克隆、序列测定及同源性分析 被引量：1

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作者 苗玉和 王文成 张贵刚 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第3期250-252,共3页

用鸡致病性大肠杆菌分离株O1、O2和O78的基因组DNA做为模板,PCR分别扩增出了0.55kb的P型菌毛结构基因(papA)。将扩增得到的3个papA基因片段分别克隆进pGEM-T○R载体中,转化至受体菌JM109中,用Amp/IPTG/X-gal琼脂平板蓝白菌落筛选法,得... 用鸡致病性大肠杆菌分离株O1、O2和O78的基因组DNA做为模板,PCR分别扩增出了0.55kb的P型菌毛结构基因(papA)。将扩增得到的3个papA基因片段分别克隆进pGEM-T○R载体中,转化至受体菌JM109中,用Amp/IPTG/X-gal琼脂平板蓝白菌落筛选法,得到含阳性重组子的菌株,提取质粒后用BamH和Sal双酶切进行鉴定。所得阳性重组子进行DNA序列测定,测序结果经DNAStar核酸分析软件包分析比较,结果表明,所构建的克隆质粒中均含有相应完整papA基因,其开放式阅读框架大小为549bp,编码182个氨基酸。此3株菌的P型菌毛结构基因的同源性为98.9%～100%,其中O1株和O78株的P型菌毛基因的ORF序列100%相同,O2株有2个碱基与前两者不同。 展开更多

关键词 结构基因 P型菌毛 鸡大肠杆菌 同源性分析 克隆 鸡致病性大肠杆菌 DNA序列测定 基因组DNA 分析软件包 基因片段 琼脂平板 IPTG 分析比较 Star 菌毛基因 重组子 分离株 PCR 受体菌 筛选法 Amp Sal 双酶切 开放式 氨基酸

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天然高产脂肪酶细菌的分离鉴定及脂肪酶基因的分析 被引量：1

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作者 张迎光 施晓聪 +2 位作者 林全思 王震 吕建新 《温州医学院学报》 CAS 2009年第6期541-545,共5页

目的:从环境中分离高产脂肪酶的细菌,并克隆其脂肪酶基因。方法:从天然高油脂含量土壤筛选高产脂肪酶的细菌,鉴定菌种后,设计相应引物PCR扩增脂肪酶基因并进行TA克隆,重组载体转入E.coli DH5α构建工程菌,双酶切及测序鉴定脂肪酶基因。... 目的:从环境中分离高产脂肪酶的细菌,并克隆其脂肪酶基因。方法:从天然高油脂含量土壤筛选高产脂肪酶的细菌,鉴定菌种后,设计相应引物PCR扩增脂肪酶基因并进行TA克隆,重组载体转入E.coli DH5α构建工程菌,双酶切及测序鉴定脂肪酶基因。结果:经过微生物菌种鉴定获得4株高活力菌,其中一株金葡菌产酶最高,利用PCR技术成功扩增脂肪酶基因,该基因经过克隆测序及其双酶切鉴定证实为新发现的突变脂肪酶基因,其二级结构与标准基因(EU310372)有较大不同。结论:成功分离一株高产脂肪酶的菌株——金黄色葡萄球菌,克隆的脂肪酶基因为新发现的突变型。 展开更多

关键词 脂肪酶基因 PCR ta克隆

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