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吉富罗非鱼源无乳链球菌Sip-GAPDH融合基因的构建及其原核表达 被引量：2
1
作者 王蓓 李桂欢 +4 位作者 鲁义善 汤菊芬 黄郁葱 吴灶和 简纪常 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第7期137-142,共6页
利用重叠延伸(SOEing)PCR技术,将吉富罗非鱼(Oreochromis niloticus)源无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)ZQ0910株表面免疫原性蛋白(Surface immunogenic protein,Sip)基因与甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因通过Linker序列融合,构... 利用重叠延伸(SOEing)PCR技术,将吉富罗非鱼(Oreochromis niloticus)源无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)ZQ0910株表面免疫原性蛋白(Surface immunogenic protein,Sip)基因与甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因通过Linker序列融合,构建成为Sip-GAPDH融合基因。将其定向克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达。结果表明,重组质粒pET-32a-Sip-GAPDH在大肠杆菌BL21(DE3)中表达后所获得的融合蛋白Sip-GAPDH分子量为102.01 kD,表达最佳条件为37℃,IPTG浓度0.1 mmol/L,诱导5 h。Western blot鉴定结果表明融合基因得到了成功表达。 展开更多
关键词 无乳链球菌 Sip-GAPDH融合基因 重叠延伸pcr技术 原核表达
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利用重叠PCR实现乙肝表面抗原CTL表位的替换
2
作者 王文敬 黎诚耀 李明松 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第7期589-591,共3页
目的以磷酸酰肌醇蛋白聚糖-3蛋白(glypican-3,GPC3)的CTL表位EYILSLEEL替换HBsAg中内源性CTL表位LLD,构建用于预防和治疗乙肝的DNA疫苗。方法以重组表面抗原基因pcHBsAg质粒为模板,应用重叠延伸PCR扩增出含EYILSLEEL表位的HBsAg基因HBsA... 目的以磷酸酰肌醇蛋白聚糖-3蛋白(glypican-3,GPC3)的CTL表位EYILSLEEL替换HBsAg中内源性CTL表位LLD,构建用于预防和治疗乙肝的DNA疫苗。方法以重组表面抗原基因pcHBsAg质粒为模板,应用重叠延伸PCR扩增出含EYILSLEEL表位的HBsAg基因HBsAg/GPC3,将其插入pBSSK+载体中,构建出pBSSK/GPC3载体。利用DNA重组技术将其定向插入真核表达载体pcDNA3.1+中,将真核表达载体经PCR、酶切和测序鉴定,构建表达CTL表位EYILSLEEL的DNA疫苗。结果酶切和测序的结果显示序列无错配,获得了完整表达EYILSLEEL表位的真核质粒pcDNA3-HBsAg/GPC3。结论成功将EYILSLEEL表位替换HBsAg的内源性CTL表位,构建了pcDNA3-HBsAg/GPC3真核表达质粒。 展开更多
关键词 表位替换 磷酸酰肌醇蛋白聚糖-3蛋白 细胞毒T淋巴细胞表位 重叠延伸pcr
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GPC-3 CTL表位表达载体构建
3
作者 王文敬 黎诚耀 李明松 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第8期1548-1550,共3页
将重组的乙肝表面抗原(pcHBsAg)中多个CTL表位,用外源性的磷酸酰肌醇蛋白聚糖-3蛋白(GPC3)CTL表位序列替换,构建单拷贝和多拷贝DNA疫苗,获得不同位点的单拷贝或可同时表达多个CTL表位肽的真核表达质粒。以pcHBsAg质粒为模板,应用重叠延... 将重组的乙肝表面抗原(pcHBsAg)中多个CTL表位,用外源性的磷酸酰肌醇蛋白聚糖-3蛋白(GPC3)CTL表位序列替换,构建单拷贝和多拷贝DNA疫苗,获得不同位点的单拷贝或可同时表达多个CTL表位肽的真核表达质粒。以pcHBsAg质粒为模板,应用重叠延伸PCR扩增出含三个不同位点磷酸酰肌醇蛋白聚糖-3蛋白(GPC3)CTL表位EYILSLEEL(EYI)的HBsAg基因片段EYI1,及替换pcHBsAg中不同CTL表位的HBsAg基因片段EYI2、EYI3;分别将EYI1、EYI2、EYI3基因片段插入pBSSK+载体中,构建出含3拷贝EYI的pBSSK/EYI1、pBSSK/EYI2、pBSSK/EYI3载体。在此基础上,利用DNA重组技术将其分别定向插入真核表达载体pcDNA3.1+,构建表达EYI表位肽的DNA疫苗。真核表达载体经PCR、酶切和测序鉴定,结果显示:成功构建了pcDNA-EYI1/HBsAg、pcDNA-EYI2/HBsAg、pcDNA-EYI3/HBsAg真核表达质粒,为进一步测定以GPC3基因为基础的HBsAg多肽候选疫苗提供理论、实验依据。 展开更多
关键词 表面抗原 表位替换 磷酸酰肌醇蛋白聚糖-3蛋白 重叠延伸pcr
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重叠延伸PCR技术及其在基因工程上的应用 被引量：45
4
作者 徐芳 姚泉洪 +3 位作者 熊爱生 彭日荷 侯喜林 曹兵 《分子植物育种》 CAS CSCD 2006年第5期747-750,共4页
重叠延伸PCR技术(genesplicingbyoverlapextensionPCR,简称SOEPCR)由于采用具有互补末端的引物,使PCR产物形成了重叠链,从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸,将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。此技术利用PCR技术能够在体外进行有... 重叠延伸PCR技术(genesplicingbyoverlapextensionPCR,简称SOEPCR)由于采用具有互补末端的引物,使PCR产物形成了重叠链,从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸,将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。此技术利用PCR技术能够在体外进行有效的基因重组,而且不需要内切酶消化和连接酶处理,可利用这一技术很快获得其它依靠限制性内切酶消化的方法难以得到的产物。重叠延伸PCR技术成功的关键是重叠互补引物的设计。重叠延伸PCR在基因的定点突变、融合基因的构建、长片段基因的合成、基因敲除以及目的基因的扩增等方面有其广泛而独特的应用。本文综述了重叠延伸PCR的原理和目前的应用情况,并指出了此技术中的注意事项,展望了其应用前景。 展开更多
关键词 重叠延伸pcr 互补引物 基因工程 扩增反应
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泛素样小蛋白4(SUMO4)的克隆、原核表达、纯化及鉴定 被引量：10
5
作者 单黎然 杨振 +2 位作者 安宁 宋振 郭泽坤 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2008年第9期11-16,共6页
【目的】为人类泛素样小蛋白4(SUMO4)多克隆抗体制备和疾病研究奠定基础。【方法】根据Gen-Bank提供的核酸序列,设计7条单链DNA,采用重叠延伸PCR方法,合成SUMO4基因编码区。基因片段经限制性内切酶双酶切,构建到表达载体pGEX-4T-1中。... 【目的】为人类泛素样小蛋白4(SUMO4)多克隆抗体制备和疾病研究奠定基础。【方法】根据Gen-Bank提供的核酸序列,设计7条单链DNA,采用重叠延伸PCR方法,合成SUMO4基因编码区。基因片段经限制性内切酶双酶切,构建到表达载体pGEX-4T-1中。酶切、测序鉴定后,将重组子转染BL21 RIL菌株,表达及纯化融合蛋白。用SDS-PAGE和Western blot检测纯化效果,鉴定表达产物。【结果】成功合成了长度约为280 bp的SUMO4基因,经双酶切鉴定,SUMO4原核表达载体构建成功,插入片段测序正确。GST-SUMO4融合蛋白在终浓度1mmol/L IPTG、28℃诱导5 h后产量达到高峰,SDS-PAGE证实表达产物以可溶形式存在,分子量约为37 ku,GST亲和层析的纯化效果良好,Western blot验证融合蛋白分子量与预期值相符。【结论】SUMO4蛋白在大肠杆菌中高效表达,并以可溶性蛋白形式存在。 展开更多
关键词 人类泛素SUM04 重叠延伸pcr 原核表达 蛋白纯化
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SOE PCR重构SLA-Ⅰ复合体研究 被引量：6
6
作者 陈燕宇 何丹 +3 位作者 陈兆华 周巧妮 马文军 高凤山 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2010年第9期58-62,共5页
利用剪接重叠延伸PCR(SOE PCR)技术,中间加一富含甘氨酸/丝氨酸的linker(G4S)3,将SLA-Ⅰ重链基因SLA-2和轻链基因β2m连接,形成复合体基因链SLA-2-(G4S)3-β2m,然后将复合体基因链克隆入p2X表达质粒,导入受体菌TB1并进行表达。结果显示... 利用剪接重叠延伸PCR(SOE PCR)技术,中间加一富含甘氨酸/丝氨酸的linker(G4S)3,将SLA-Ⅰ重链基因SLA-2和轻链基因β2m连接,形成复合体基因链SLA-2-(G4S)3-β2m,然后将复合体基因链克隆入p2X表达质粒,导入受体菌TB1并进行表达。结果显示,利用SOE PCR技术成功得到了复合体基因链SLA-2-(G4S)3-β2m,并且克隆入p2X载体。SDS-PAGE检测表明,复合体基因导入宿主菌后获得了融合蛋白MBP-SLA-2-(G4S)3-β2m,大小为84.1 ku。试验结果为今后在体外进行相关基因重组表达提供参考。 展开更多
关键词 剪接重叠延伸 pcr SLA-Ⅰ 复合体
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VEGF189基因合成、原核表达及鉴定 被引量：4
7
作者 陈丹 王宏 +4 位作者 朱中松 向军俭 杨琴 赵鑫 邓宁 《免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第4期469-472,共4页
目的获得编码VEGF189蛋白的基因,并通过原核表达系统表达VEGF189融合蛋白。方法应用SOE PCR技术合成VEGF189基因,克隆入pET-32a(+)原核表达载体,转化E.coliBL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,进行SDS-PAGE和Western blot检测,表达产物经... 目的获得编码VEGF189蛋白的基因,并通过原核表达系统表达VEGF189融合蛋白。方法应用SOE PCR技术合成VEGF189基因,克隆入pET-32a(+)原核表达载体,转化E.coliBL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,进行SDS-PAGE和Western blot检测,表达产物经HisTrapTMHP亲和柱层析纯化,测定蛋白浓度。结果DNA测序分析表明,合成的VEGF189基因与文献报道相一致。在大肠杆菌BL21(DE3)中表达的Trx-VEGF189融合蛋白,以包涵体和可溶2种形式存在。表达产物可被兔抗鼠VEGF多抗特异识别。经HisTrapTMHP亲和柱纯化,获得纯度达85%的融合蛋白。结论成功合成VEGF189基因,并在原核表达系统中获得高表达,为研制高效抗肿瘤的VEGF抗体和疫苗奠定了前期基础。 展开更多
关键词 VEGF189 soepcr 原核表达
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DREB1C-GFP融合基因植物表达载体的构建 被引量：2
8
作者 王涌鑫 李聪 《分子植物育种》 CAS CSCD 2008年第3期603-607,共5页
为了便于转基因植株的分子检测,利用重叠延伸PCR(gene splicing by overlap extension PCR,SOE PCR)方法克隆来自于水母的绿色荧光蛋白基因(GFP)和来自于拟南芥的目的基因DREB1C转录因子,并对其进行改造获得融合基因。通过酶切和连接,... 为了便于转基因植株的分子检测,利用重叠延伸PCR(gene splicing by overlap extension PCR,SOE PCR)方法克隆来自于水母的绿色荧光蛋白基因(GFP)和来自于拟南芥的目的基因DREB1C转录因子,并对其进行改造获得融合基因。通过酶切和连接,将融合基因构建到表达载体pCAMBIA1301上,获得了具有DERB1C和GFP基因的重组表达载体pDR1-GFP,酶切和测序结果表明,该融合基因与设计相符。 展开更多
关键词 绿色荧光蛋白基因(GFP) DREB1C转录因子 soe pcr 载体构建
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拟南芥WUS基因的克隆及植物表达载体的构建与鉴定 被引量：2
9
作者 毕政鸿 李哲 《中国农学通报》 CSCD 2013年第18期119-126,共8页
为了研究AtWUS基因在橡胶树胚性易碎愈伤组织中的表达对体细胞胚发生的生物学作用,用构建的根癌农杆菌EHA105(携带pCAMBIA2301-35S-AtWUS)对橡胶树胚性易碎愈伤组织进行转化。根据已报道的AtWUS序列设计特异引物,进行RT-PCR和序列分析,... 为了研究AtWUS基因在橡胶树胚性易碎愈伤组织中的表达对体细胞胚发生的生物学作用,用构建的根癌农杆菌EHA105(携带pCAMBIA2301-35S-AtWUS)对橡胶树胚性易碎愈伤组织进行转化。根据已报道的AtWUS序列设计特异引物,进行RT-PCR和序列分析,同时用重叠延伸PCR技术(gene splicing by overlap extension PCR,简称)构建AtWUS-EGFP融合基因。结果表明:与GenBank上EGFP基因和拟南芥AtWUS序列同源性为100%,分别构建了pCAMBIA2301-35S-AtWUS(含有GUS和NPTII基因)和pER8-AtWUS-EGFP(含有HPTII基因)载体,采用电击转化法转进根癌农杆菌EHA105中。最后,通过GUS检测法鉴定了pCAMBIA2301-35S-AtWUS已经整合到橡胶树中。本研究分别成功构建了组成型植物表达载体pCAMBIA2301-35S-AtWUS和诱导型植物表达载体pER8-AtWUS-EGFP,为橡胶树遗传转化的研究奠定了基础。 展开更多
关键词 AtWUS基因 EGFP基因 融合基因 重叠延伸pcr 橡胶树
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应用SOE PCR方法构建新城疫病毒基因起始片段的研究 被引量：1
10
作者 南福龙 陈兴 +7 位作者 张赫 解长占 崔卓栋 张萍 张金勇 庄忻宇 鲁会军 金宁一 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2017年第3期193-196,共4页
目的以猪源新城疫病毒JL02/2000株为模板,构建新城疫病毒反向遗传研究所需的基因起始片段。方法将NDV起始片段(ND1,226-4 916bp)设计拆分为ND1-1、ND1-2、ND1-3、ND1-4的4个约1.2kb的小片段,分别PCR扩增各片段,后采用SOE PCR技术将ND1-1... 目的以猪源新城疫病毒JL02/2000株为模板,构建新城疫病毒反向遗传研究所需的基因起始片段。方法将NDV起始片段(ND1,226-4 916bp)设计拆分为ND1-1、ND1-2、ND1-3、ND1-4的4个约1.2kb的小片段,分别PCR扩增各片段,后采用SOE PCR技术将ND1-1、ND1-2拼接成中间片段ND1-1-2,将ND1-3、ND1-4拼接为ND1-3-4,再经第二次SOE-PCR整合拼接ND1-1-2和ND1-3-4片段,完成NDV起始片段ND1的构建,并连接到pCI载体上,构建pCIND1质粒,最后经酶切PCI-ND1质粒并送测序鉴定目的片段是否构建正确并成功连接到pCI载体上。结果经PCR扩增得到ND1-1、ND1-2、ND1-3、ND1-4共4个分别约1 200bp大小的片段,经第一轮SOE-PCR得到ND1-1-2和ND1-3-4两个2 200bp左右的片段,第二轮SOE-PCR得到4 900bp左右的ND1片段。连接产物PCI-ND1质粒经酶切和测序鉴定片段大小和序列与预期相符。结论成功构建了新城疫病毒基因起始片段(226-4 916bp),为构建新城疫病毒全长基因奠定了基础。 展开更多
关键词 新城疫病毒 soe pcr 基因克隆 拼接
原文传递
重组枯草芽孢杆菌诱导表达AiiA及酶活性鉴定 被引量：1
11
作者 梁倩怡 明飞平 +8 位作者 贾军皓 赵培静 李姣清 邓锦波 张淑霞 曾敏 蔡海明 马苗鹏 张玲华 《生物技术》 CAS 2018年第6期531-536,共6页
[目的]由于AiiA(Autoinducer inactivation,AiiA)蛋白能有效降解AHLs(N-acyl-homoserine,AHLs),导致病原菌由于群体淬灭(Quornm quenching,QQ)失去生存优势而抑制其致病能力;利用强启动子构建能高效表达AiiA蛋白的枯草芽孢杆菌,检验枯... [目的]由于AiiA(Autoinducer inactivation,AiiA)蛋白能有效降解AHLs(N-acyl-homoserine,AHLs),导致病原菌由于群体淬灭(Quornm quenching,QQ)失去生存优势而抑制其致病能力;利用强启动子构建能高效表达AiiA蛋白的枯草芽孢杆菌,检验枯草芽孢杆菌中Pspac启动子表达AiiA蛋白的能力,寻求有效生物防治手段防治病原菌侵害。[方法]通过已知的aiiA基因序列和启动子Pspac序列设计引物,经搭桥PCR搭连启动子Pspac和aiiA基因,构建重组表达载体Pspac-aiiA-PHY300PLK,经酶活反应确定重组菌活性。[结果]成功克隆并搭连Pspac启动子和aiiA基因,AiiA蛋白成功在重组枯草芽孢杆菌C11中表达。经酶活检验,野生菌株和重组菌株Pspac-aiiA-C11有降解信号分子AHLs的能力,但重组菌降解能力更强。[结论]重组菌Pspac-aiiA-C11较野生菌株有更强的降解AHLs效力;要利用工程菌进行生物防治还需进一步提高工程菌表达AiiA蛋白的能力及稳定性。 展开更多
关键词 群体感应 AHLs信号分子 AIIA基因 Pspac启动子 桥式pcr 枯草芽孢杆菌
原文传递
HIV-1 HXB2株ta(tB41-101N)融合基因原核表达质粒的构建及表达
12
作者 廖文婷 陈璐 +6 位作者 曹洁 陈秋莉 王锦红 唐萍 庞强 黄德胜 潘卫 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2009年第11期1049-1053,共5页
目的构建HIV-1HXB2株ta(tB41-101N)融合基因原核表达质粒,表达并纯化Ta(tB41-101N)融合蛋白,为进一步研究其免疫原性奠定基础。方法在HIV-1HXB2株天然Tat蛋白N-端添加Tat41-101位氨基酸(aa),采用PCR法从HIV-1HXB2株tat基因中扩增分别编... 目的构建HIV-1HXB2株ta(tB41-101N)融合基因原核表达质粒,表达并纯化Ta(tB41-101N)融合蛋白,为进一步研究其免疫原性奠定基础。方法在HIV-1HXB2株天然Tat蛋白N-端添加Tat41-101位氨基酸(aa),采用PCR法从HIV-1HXB2株tat基因中扩增分别编码Tat41-101aa和Tat1-101aa的tat41-101和tat1-101两个基因片段,重叠延伸PCR法扩增其融合基因ta(tB41-101N),并构建其原核表达质粒pET32a-ta(tB41-101N),经双酶切及测序验证后,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。融合蛋白经Ni2+-NTA柱亲和层析纯化后,进行SDS-PAGE、Westernblot及ELISA鉴定。结果重叠延伸PCR扩增出约500bp的ta(tB41-101N)融合基因,酶切及测序结果表明重组表达质粒pET32a-ta(tB41-101N)构建正确。SDS-PAGE分析显示,表达的Ta(tB41-101N)融合蛋白相对分子质量约为36000,约占菌体总蛋白的7%,纯化后纯度约为60%;Westernblot和ELISA分析显示,Ta(tB41-101N)融合蛋白与小鼠抗Tat单抗及抗-HIV阳性血清(抗Tat抗体阳性)均呈特异性阳性反应。结论已成功构建了HIV-1HXB2株ta(tB41-101N)融合基因原核表达质粒,并表达了其融合蛋白,该蛋白较好地保留了天然Tat蛋白的免疫反应性,为Tat新型疫苗的研究奠定了基础。 展开更多
关键词 HIV-1 TAT蛋白 融合蛋白 原核表达 重叠延伸pcr
原文传递
腺病毒反向重复序列ITRs的人工合成与克隆
13
作者 王昆 葛菁萍 +4 位作者 李梅 隋栋 高冬妮 楼庄伟 平文祥 《黑龙江大学自然科学学报》 CAS 北大核心 2009年第4期500-503,共4页
为获得高GC含量(72%)的腺伴随病毒AAV反向末端重复序列ITRs(178 bp),以自行设计的4段寡核苷酸引物(约59 bp)为模板,采用融合PCR方法将其人工合成。回收目的片段后,通过TA克隆、PCR和酶切鉴定获得8个阳性转化子。经测序鉴定,得到了5个序... 为获得高GC含量(72%)的腺伴随病毒AAV反向末端重复序列ITRs(178 bp),以自行设计的4段寡核苷酸引物(约59 bp)为模板,采用融合PCR方法将其人工合成。回收目的片段后,通过TA克隆、PCR和酶切鉴定获得8个阳性转化子。经测序鉴定,得到了5个序列完全正确的克隆。本实验为研究含有ITRs的重组杆状病毒介导外源基因在哺乳动物细胞中表达持续时间的影响奠定了基础。 展开更多
关键词 反向末端重复序列 soe pcr 基因合成
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用SOE PCR方法获得新城疫病毒La Sota株全基因组cDNA
14
作者 葛菁萍 宋姗姗 +4 位作者 唐晓艳 高冬妮 张贺楠 楼庄伟 平文祥 《中国农学通报》 CSCD 2012年第15期152-157,共6页
为了获得新城疫病毒La Sota株全基因组cDNA。根据SOE PCR方法要求设计引物,对NDV LaSota株进行分段扩增,然后应用SOE PCR方法连接各片段,全基因连接可得到约15000 bp的扩增片段,所得到的产物为NDV La Sota株全基因组cDNA。结果表明:采用... 为了获得新城疫病毒La Sota株全基因组cDNA。根据SOE PCR方法要求设计引物,对NDV LaSota株进行分段扩增,然后应用SOE PCR方法连接各片段,全基因连接可得到约15000 bp的扩增片段,所得到的产物为NDV La Sota株全基因组cDNA。结果表明:采用SOE PCR方法合成的基因序列经测序及酶切鉴定,与GenBank上登陆的NDV La Sota株全基因组序列基本一致。本研究为构建新城疫LaSota株的感染性cDNA奠定了物质基础;并为进一步研究NDV的生物学特性、结构与功能的关系,探讨影响NDV毒力的因素、及研制新型疫苗载体提供了可靠依据。 展开更多
关键词 新城疫病毒 La SOTA soe pcr
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重组人血管能抑制素分泌型表达载体的构建及其生物学效应研究 被引量：1
15
作者 李玉英 钱桂生 +5 位作者 黄桂君 陈枫 余时沧 王兴友 陈维中 李淑平 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2004年第12期1055-1058,共4页
目的　构建表达分泌型人血管能抑制素 (canstatin)蛋白的真核表达载体 ,观察其生物学效应。方法　以SOEPCR法将canstatin及癌胚抗原 (CEA)引导肽cDNA体外连接 ,并定向克隆到真核蛋白表达载体pCMV Script上 ,脂质体介导转染HUVEC及A5 4 ... 目的　构建表达分泌型人血管能抑制素 (canstatin)蛋白的真核表达载体 ,观察其生物学效应。方法　以SOEPCR法将canstatin及癌胚抗原 (CEA)引导肽cDNA体外连接 ,并定向克隆到真核蛋白表达载体pCMV Script上 ,脂质体介导转染HUVEC及A5 4 9细胞 ,荧光定量PCR法检测转染细胞canstatin基因表达量 ,并采用多种方法检测该重组载体的生物学活性。结果　成功构建canstatin分泌型载体 ,在其转染的肿瘤细胞和人脐静脉内皮细胞中均检测到不同拷贝数的表达。转染后HUVEC生长增殖缓慢 ,出现G0 ～G1期阻滞并伴有大量凋亡 ,与空载体转染组相比差异有统计学意义 (P <0 0 5 ) ;而A5 4 9细胞转染后与空载体转染组在以上几个方面差异均无统计学意义 (P >0 0 5 )。重组载体转染A5 4 9细胞上清液干预的鸡胚绒毛尿囊膜血管生成明显减少 ,且颜色苍白、轮廓模糊 ,空载体转染组和未干预组血管生长旺盛、脉络清晰。结论　SOE法构建的含有CEA引导肽的canstatin分泌型表达载体能在转染的内皮细胞及肺癌细胞中稳定表达 ,可有效抑制内皮细胞生长增殖并诱导凋亡。重组载体转染的细胞可分泌有生物学活性的canstatin。 展开更多
关键词 人血管能抑制素 载体蛋白质类 肽类 重叠延伸P(R
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抗H5N1亚型高致病性禽流感猴源噬菌体scFv的构建和表达
16
作者 陈樱 邓国华 陈化兰 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第4期249-253,共5页
为探索治疗禽流感的方法,本实验从免疫H5N1亚型禽流感疫苗的猕猴淋巴细胞中提取总mRNA并扩增重链和轻链可变区(VH、Vλ和Vκ),用重叠延伸PCR方法构建VH-Linker-Vλ和VH-Linker-Vκ形式的单链抗体(scFv),采用噬菌体展示技术构建了噬菌体... 为探索治疗禽流感的方法,本实验从免疫H5N1亚型禽流感疫苗的猕猴淋巴细胞中提取总mRNA并扩增重链和轻链可变区(VH、Vλ和Vκ),用重叠延伸PCR方法构建VH-Linker-Vλ和VH-Linker-Vκ形式的单链抗体(scFv),采用噬菌体展示技术构建了噬菌体抗体库,从2.2×106的噬菌体库中淘选得到具有较高亲和力的H6株scFv,并通过ELISA、SDS-PAGE、western blot、间接免疫荧光(IFA)和竞争抑制ELISA对其进行鉴定,证实所获得的scFv为32ku,并且能与病毒发生特异性结合。IgBlast序列分析发现,所得到的scFv基因Vλ与人免疫球蛋白胚系基因同源性达91.5%,而VH同源性为75%。本研究所得到的猴源抗体可变区为人源化抗体的构建以及禽流感的治疗奠定了基础。 展开更多
关键词 猴源scFv 重叠延伸pcr 噬菌体抗体库 间接免疫荧光
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干扰素调节因子3引导RNA真核表达载体的构建
17
作者 鞠思雨 侯卓岩 +5 位作者 王晰 姜生远 李佳起 吕海菲 刘文 张之勇 《中华临床实验室管理电子杂志》 2022年第4期215-221,共7页
目的通过构建干扰素调节因子3(IRF3)gRNA真核表达载体,研究IRF3介导的转录非依赖性细胞凋亡的分子机制。方法通过分析IRF3的分子结构,在CHOPCHOP网站设计IRF3分子gRNA的序列,并在pLenti-U6-gRNA-PGK-Neo表达载体上ClaI和NheI限制性内切... 目的通过构建干扰素调节因子3(IRF3)gRNA真核表达载体,研究IRF3介导的转录非依赖性细胞凋亡的分子机制。方法通过分析IRF3的分子结构,在CHOPCHOP网站设计IRF3分子gRNA的序列,并在pLenti-U6-gRNA-PGK-Neo表达载体上ClaI和NheI限制性内切酶的位点处设计两对引物,通过重叠延伸PCR法扩增生成IRF3 gRNA的表达模块,通过TA克隆的方法构建到pGM-simple T克隆载体中,然后用双酶切的方法将IRF3 gRNA的表达模块亚克隆构建到表达载体中,通过PCR和Sanger测序的方法筛选并鉴定pLenti-U6-IRF3-gRNA表达载体。结果在IRF3的BH3样结构域和C端磷酸化结构域之间获得IRF3的gRNA序列。通过重叠延伸PCR扩增得到IRF3 gRNA的表达模块,通过TA克隆得到克隆载体pGM-simple T-IRF3-gRNA。通过双酶切的方法,将IRF3 gRNA表达模块亚克隆至pLenti-U6-gRNA-PGK-Neo真核表达载体,通过Sanger测序鉴定最终得到pLenti-U6-IRF3-gRNA表达载体。结论通过重叠延伸法成功构建pLenti-U6-IRF3-gRNA表达载体,为研究IRF3诱导细胞凋亡的转录非依赖性分子机制奠定了基础。 展开更多
关键词 干扰素调节因子3 重叠延伸pcr CRISPR-Cas9 引导RNA
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小鼠鸟氨酸脱羧酶抗酶1功能基因的克隆及原核表达
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作者 刘梦瑶 韩钰 +2 位作者 蔡富强 何玲 王艳林 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2010年第2期138-141,149,共5页
目的克隆小鼠鸟氨酸脱羧酶抗酶1(OAZ1)功能基因,原核表达并纯化OAZ1重组蛋白。方法采用RT-PCR法从小鼠黑色素瘤细胞总RNA中扩增OAZ1基因,通过重叠延伸PCR技术构建无需移码即可全长翻译的功能基因,并构建重组表达质粒pET15b/OAZ1-T,转化... 目的克隆小鼠鸟氨酸脱羧酶抗酶1(OAZ1)功能基因,原核表达并纯化OAZ1重组蛋白。方法采用RT-PCR法从小鼠黑色素瘤细胞总RNA中扩增OAZ1基因,通过重叠延伸PCR技术构建无需移码即可全长翻译的功能基因,并构建重组表达质粒pET15b/OAZ1-T,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经Ni2+-NTA亲和层析纯化后,进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果重叠PCR法扩增出692bp的OAZ1功能基因,重组表达质粒经酶切及测序鉴定正确,重组蛋白可在大肠杆菌中以包涵体形式高效表达。纯化的重组蛋白纯度可达79.96%,且可与抗His标签抗体特异性结合。结论已成功克隆了小鼠OAZ1功能基因,原核表达并纯化了重组OAZ1蛋白。 展开更多
关键词 鸟氨酸脱羧酶抗酶1 功能基因 重叠延伸pcr 原核表达
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改进重叠延伸PCR技术构建定点双突变 被引量：6
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作者 徐书景 张跃灵 +3 位作者 张妍 赵宝华 鞠建松 马延和 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第10期49-54,共6页
目的:DNA片段中快速构建位点不同的定点双突变体。方法:借鉴DNA shuffling技术中DNA小片段延伸扩增获得全长DNA片段的工作原理,与常规基因定点突变技术相结合,改进重叠延伸PCR技术构建定点双突变。结果:对嗜酸热脂肪杆菌(Alicyclobacill... 目的:DNA片段中快速构建位点不同的定点双突变体。方法:借鉴DNA shuffling技术中DNA小片段延伸扩增获得全长DNA片段的工作原理,与常规基因定点突变技术相结合,改进重叠延伸PCR技术构建定点双突变。结果:对嗜酸热脂肪杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)Tc-12-31的甘露聚糖酶基因AamanA中两个可能的活性位点E151和E231进行双点突变,先后经过无引物和有引物两步PCR,扩增获得全长DNA,测序结果表明得到预期的定点双突变体;酶活性检测和薄层层析结果表明双点突变体丧失了酶的活性。结论:改良的重叠PCR技术,能经济、简便、高效地获得双点定点突变体,在酶的催化机理的阐述、蛋白质结构改造等分子生物学领域中具有较高的应用价值。 展开更多
关键词 重叠延伸pcr 定点双突变 甘露聚糖酶
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hGH-双精氨酸C肽人胰岛素原基因的克隆表达及纯化研究 被引量：1
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作者 胡兵 黄超 +3 位作者 李文静 邓柳红 肖苏生 张春发 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第12期96-101,共6页
旨在提高基因重组人胰岛素在大肠杆菌中表达的稳定性及表达包涵体蛋白的复性水平。在人胰岛素原N端前融合人生长素N端的一段序列来充当前导肽,同时将C肽设计为两个精氨酸,分10段合成长链寡核苷酸链,利用重叠延伸PCR技术(SOE PCR)扩增得... 旨在提高基因重组人胰岛素在大肠杆菌中表达的稳定性及表达包涵体蛋白的复性水平。在人胰岛素原N端前融合人生长素N端的一段序列来充当前导肽,同时将C肽设计为两个精氨酸,分10段合成长链寡核苷酸链,利用重叠延伸PCR技术(SOE PCR)扩增得到该基因片段。与表达载体PET-30a连接,转化E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的融合蛋白采用Ni-NTA亲和层析纯化,纯化后的蛋白经复性、冻干等步骤后用胰蛋白酶,羧肽酶B双酶切再过DEAE Sepharose FastFlow阴离子交换柱,收集洗脱峰。对制备所得的胰岛素用SDS-PAGE,Western blot进行性质鉴定,及皮下注射小鼠测定生物活性。结果显示,目的蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中得到了表达,表达产物以不溶性包涵体形式纯在,约占大肠杆菌总蛋白的30%。经Ni-NTA亲和层析得到的重组蛋白纯度为85%,DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换纯化得到单组分胰岛素。Western Blot显示制备所得的胰岛素具有胰岛素免疫原性,皮下给药注射小鼠活性测定表明具有明显的降血糖活性。获得了一种高效生产基因重组人胰岛素的方法,为研究胰岛素类似物奠定了前期基础同时也为今后探索胰岛素的非注射给药途径提供了原料。 展开更多
关键词 hGH-双精氨酸C肽人胰岛素原 重叠延伸pcr 融合蛋白表达 纯化 活性测定
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