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GII.3型诺如病毒GZ31597株变异情况及与受体组织血型抗原结合模式分析 被引量:4
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作者 王婧 张会芳 +7 位作者 靳淼 谢华萍 孔翔羽 冯微宏 李宇宁 胡贵方 何雅青 段招军 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期37-44,共8页
诺如病毒(Noroviruses,NoVs)是引起非菌型胃肠炎暴发流行的主要病原体之一。为了解我国GII.3型NoVs毒株的变异以及受体结合模式,本研究对来自2015年一起中国广州NoVs胃肠炎暴发的GII.3型毒株GZ31597株进行聚合酶区和完整VP1区基因扩增... 诺如病毒(Noroviruses,NoVs)是引起非菌型胃肠炎暴发流行的主要病原体之一。为了解我国GII.3型NoVs毒株的变异以及受体结合模式,本研究对来自2015年一起中国广州NoVs胃肠炎暴发的GII.3型毒株GZ31597株进行聚合酶区和完整VP1区基因扩增、序列测定和序列分析,并表达VP1突出区蛋白(P蛋白),通过P蛋白与不同血型唾液样本的酶免疫分析法(EIA)测定实验确定其组织血型抗原(Histo-blood group antigens,HBGAs)结合模式。GZ31597株聚合酶和VP1基因系统进化分析表明,GZ31597株为GII.P12/GII.3-SubD基因型(聚合酶/衣壳区),该毒株较先前的GII.3毒株相比,在既是抗原表位又是HBGAs受体结合位点的氨基酸385残基发生了氨基酸转换。根据Western Blotting结果,证实P蛋白成功表达。唾液结合分析结果显示,该毒株P蛋白与A、B、AB、O型分泌型以及O型非分泌型唾液均可以结合,但结合值相对低。本研究表明该GII.P12/GII.3-SubD亚型的GII.3毒株在长期的流行过程中,通过氨基酸的转换,改变抗原性和受体结合活性,使GII.3型毒株在人群中继续流行。通过探索GII.3型NoVs在人群中长期广泛流行的原因,为GII.3型诺如病毒性胃肠炎的预防和控制提供重要依据。 展开更多
关键词 诺如病毒(NoVs) GII.3基因型 进化 组织血型抗原(HBGAs) p蛋白
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GⅡ.2[P16]型诺如病毒P蛋白的可溶表达、纯化及其抗原特性分析
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作者 李攀 刘术敏 +3 位作者 刘晓雅 程英杰 吴常伟 黄恩启 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2024年第8期952-956,共5页
目的获得可溶表达的GⅡ.2[P16]型诺如病毒(norovirus,NV)P蛋白,并分析其抗原特性。方法通过优化合成GⅡ.2[P16]型NV P蛋白基因并克隆至pET-28a(+)载体上,构建重组质粒GⅡ.2-NV-pET-28a,转化DH5α感受态细胞,通过对表达菌种的优化,使P蛋... 目的获得可溶表达的GⅡ.2[P16]型诺如病毒(norovirus,NV)P蛋白,并分析其抗原特性。方法通过优化合成GⅡ.2[P16]型NV P蛋白基因并克隆至pET-28a(+)载体上,构建重组质粒GⅡ.2-NV-pET-28a,转化DH5α感受态细胞,通过对表达菌种的优化,使P蛋白以可溶性形式表达。表达的P蛋白经Ni-NTA亲和层析纯化后,采用Western blot法检测纯化蛋白抗原性;体积排阻高效液相色谱(size exclusion high performance liquid chromatography,SECHPLC)法检测抗原纯度;ELISA法鉴定抗原抗体结合能力。结果重组BL21 Star(DE3)pLySs工程菌目的蛋白以可溶形式高表达,经亲和层析纯化后,GⅡ.2 P蛋白纯度为95.53%,且抗原性较好。结论用原核表达菌种成功制备了可溶性表达的NV P蛋白,并明确了P蛋白的抗原性,为GⅡ.2[P16]型NV检测试剂盒和重组亚单位疫苗的研制奠定了基础。 展开更多
关键词 诺如病毒 GⅡ.2[p16] p蛋白 可溶性表达
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狂犬病病毒P基因的原核表达及间接ELISA方法的应用 被引量:4
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作者 赵刚 李刚 +1 位作者 陈铁桥 范晓娟 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第2期163-167,共5页
目的以狂犬病病毒P蛋白作为检测抗原,用间接ELISA方法检测狂犬病病毒抗体。方法根据GenBank发表的狂犬病病毒(Rabies Virus,RV)LEP-Flury株的基因序列设计引物,通过RT-PCR扩增出P基因的全长序列,克隆于pGM-T载体中,获得重组质粒pGM-T-P... 目的以狂犬病病毒P蛋白作为检测抗原,用间接ELISA方法检测狂犬病病毒抗体。方法根据GenBank发表的狂犬病病毒(Rabies Virus,RV)LEP-Flury株的基因序列设计引物,通过RT-PCR扩增出P基因的全长序列,克隆于pGM-T载体中,获得重组质粒pGM-T-P,将重组质粒用限制性内切酶NotI和EcoRI进行双酶切,酶切产物定向克隆于原核表达载体pET-32a(+)中,构建原核重组表达质粒pET-32a-P,阳性重组质粒转化原核表达宿主菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达。SDS-PAGE和Western-blot分析确定蛋白表达量和特异性。用纯化的蛋白作为诊断抗原,通过对反应条件的优化,初步将间接ELISA方法应用于狂犬病病毒抗体的检测中。结果扩增RV P基因,构建了克隆质粒pGM-T-P、原核表达质粒pET-32a-P,高效表达了主要以可溶性形式存在的P蛋白,并能与RV阳性血清发生特异性反应。用表达的狂犬病病毒重组P蛋白建立了用于RV抗体检测的间接ELISA方法。结论成功表达了磷蛋白,用其作为固化抗原以间接ELISA方法检测RV抗体。 展开更多
关键词 狂犬病病毒LEp—Flury株 p基因 p蛋白 原核表达 间接ELISA
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狂犬病病毒GX074株P-M^(S20F)突变体构建及其生长特性鉴定
4
作者 彭璟 李文芳 +3 位作者 陆丽莹 韦显凯 李晓宁 罗廷荣 《南方农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第1期253-262,共10页
【目的】明确狂犬病病毒(RABV)强毒株GX074的P蛋白和M蛋白第20位苯丙氨酸(Phe)替换至弱毒株r RC-HL的重组突变体在宿主细胞内的生长特性,为P蛋白和M蛋白转录复制机理研究提供理论依据。【方法】运用反向遗传技术以强毒株GX074的M蛋白第2... 【目的】明确狂犬病病毒(RABV)强毒株GX074的P蛋白和M蛋白第20位苯丙氨酸(Phe)替换至弱毒株r RC-HL的重组突变体在宿主细胞内的生长特性,为P蛋白和M蛋白转录复制机理研究提供理论依据。【方法】运用反向遗传技术以强毒株GX074的M蛋白第20位Phe替换弱毒株r RC-HL(GX074P)的M蛋白第20位丝氨酸(Ser),构建r RC-HL(GX074P-M^(S20F))突变体感染性c DNA克隆并拯救病毒。以重组突变体感染BSR/T7-9细胞,进行多步生长曲线测定,比较重组突变体与亲本毒株的生长能力,采用Western blotting检测N蛋白、P蛋白和M蛋白相对表达水平,利用实时荧光定量PCR检测N基因、P基因和M基因的相对表达量。【结果】经RT-PCR和测序鉴定,拯救的突变体r RC-HL(GX074P-M^(S20F))M蛋白第20位Ser成功替换为Phe。多步生长曲线测定结果显示,构建的重组突变体在感染24、48、72和96 h后,病毒滴度均高于亲本弱毒株r RC-HL和对照弱毒株r RC-HL(GX074PM1),平均约为亲本弱毒株r RC-HL的10倍。在蛋白表达水平上,r RC-HL(GX074P-M^(S20F))毒株在感染48 h后,N蛋白和M蛋白相对表达水平均极显著高于亲本弱毒株r RC-HL(P<0.01),说明强毒株GX074的P蛋白联合M蛋白第20位Phe替换至弱毒株r RC-HL后,增加了突变体N蛋白和M蛋白表达。感染24和48 h后,r RC-HL(GX074P-M^(S20F))毒株N基因、P基因和M基因的相对表达量均高于亲本弱毒株r RC-HL和对照弱毒株r RC-HL(GX074PM1)。【结论】强毒株GX074的M蛋白第20位Phe替换可提高病毒的增殖能力,同时增强病毒的复制与转录能力,M蛋白第20位Phe可能是影响病毒复制和转录的关键位点。 展开更多
关键词 狂犬病病毒(RABV) p蛋白 M蛋白 生长特性 反向遗传
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GI.5和GII.4诺如病毒P蛋白的克隆表达及与长牡蛎类HBGAs的结合特性
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作者 佟利惠 杨敏 +3 位作者 王珊珊 王大军 王明丽 周德庆 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2024年第2期113-119,共7页
为明确人诺如病毒(human norovirus,HuNoV)与长牡蛎类组织血型抗原(histo-blood group antigens,HBGAs)的结合特性,本实验运用大肠杆菌表达系统,克隆表达了基因簇I.5(genogroup I.5,GI.5)和GII.4 HuNoV P蛋白,采用酶联免疫吸附测定研究H... 为明确人诺如病毒(human norovirus,HuNoV)与长牡蛎类组织血型抗原(histo-blood group antigens,HBGAs)的结合特性,本实验运用大肠杆菌表达系统,克隆表达了基因簇I.5(genogroup I.5,GI.5)和GII.4 HuNoV P蛋白,采用酶联免疫吸附测定研究HuNoV P蛋白与唾液HBGAs和长牡蛎类HBGAs的结合特性。结果表明,GII.4 HuNoV与唾液A型、B型、AB型和O型HBGAs均有较好的结合,而GI.5 HuNoV与B型HBGAs结合较弱,与O型HBGAs具有明显的结合优势。GI.5和GII.4 HuNoV在长牡蛎鳃、消化腺和外套膜中均可富集,其中在消化腺中富集最多,二者主要与类A型和H1型HBGAs结合,GII.4HuNoV与类Lea型、Leb型、Lex型和Ley型HBGAs有不同程度的结合,而GI.5 HuNoV与类Leb型HBGAs仅微弱结合,与类H1型HBGAs具有明显结合优势。综上,不同型别HuNoV与HBGAs的结合特性不尽相同,GII.4HuNoV具有广谱结合特性,GI.5HuNoV具有选择结合特性。 展开更多
关键词 人诺如病毒 p蛋白 长牡蛎 组织血型抗原 结合特性
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小反刍兽疫病毒Nigeria75/1株磷蛋白的表达及磷酸化位点的预测 被引量:3
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作者 金红岩 封家旺 +4 位作者 李文超 程朝飞 隋修锟 黄华欣 李刚 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2013年第12期1252-1256,共5页
为深入研究小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)P蛋白对病毒复制的影响,以小反刍兽疫病毒Nigeria75/1株为研究对象,通过RT-PCR法扩增P基因,将扩增出的P基因克隆到pGEX-6P-1原核表达载体中,成功构建pGEX-6P-1-PPRV-P... 为深入研究小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)P蛋白对病毒复制的影响,以小反刍兽疫病毒Nigeria75/1株为研究对象,通过RT-PCR法扩增P基因,将扩增出的P基因克隆到pGEX-6P-1原核表达载体中,成功构建pGEX-6P-1-PPRV-P表达载体,测序鉴定无误后转化至表达宿主菌BL21(DE3)plysS中进行IPTG诱导表达,并通过在线软件预测了P蛋白的磷酸化位点。结果显示,pGEX-6P-1-PPRV-P重组菌在IPTG浓度1.0mmol/L时经37℃诱导4h,目的基因可正确表达,并以可溶性的形式存在。经Western-blot鉴定,目的蛋白可与PPRV Nigeria75/1株病毒小鼠阳性血清发生特异性的免疫印迹反应,证明表达的蛋白具有较好的反应原性。经综合预测分析,可能被磷酸化的位点有46个,其中PKC、PKA、CKII/CKI、cdc2可能作用的位点分别为15个、7个、10个、6个,其他激酶作用位点可能为8个。结果表明,P蛋白的克隆表达及磷酸化位点的成功预测为小反刍兽疫病毒的深入研究奠定了基础。 展开更多
关键词 p蛋白 小反刍兽疫病毒 原核表达 磷酸化位点
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GⅡ.2型诺如病毒P蛋白的表达及组织血型抗原结合模式分析 被引量:3
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作者 宋皎 李涵博 +4 位作者 丛鑫 靳淼 李丹地 郑贵森 段招军 《中华实验和临床病毒学杂志》 CAS CSCD 2019年第1期54-57,共4页
目的2016年冬季,GⅡ.2型诺如病毒(norovirus,NoV)在我国暴发流行,为了阐明其流行机制,本文对其衣壳蛋白P区与组织血型抗原(histo-blood group antigens,HBGAs)结合特征进行研究。方法选取2016年底北京市暴发的GⅡ.2型ZTX株为研究对象,... 目的2016年冬季,GⅡ.2型诺如病毒(norovirus,NoV)在我国暴发流行,为了阐明其流行机制,本文对其衣壳蛋白P区与组织血型抗原(histo-blood group antigens,HBGAs)结合特征进行研究。方法选取2016年底北京市暴发的GⅡ.2型ZTX株为研究对象,构建重组的原核表达质粒,表达纯化得到病毒P蛋白,通过唾液和寡糖结合实验对其与HBGAs的结合特征进行研究。结果成功获得可溶性P蛋白,P蛋白与A型,B型,AB型唾液均结合。结论明确了北京暴发的GⅡ.2型NoV的唾液的结合特征,为其致病机制及防控措施提供了一定的基础和依据。 展开更多
关键词 诺如病毒 暴发 p蛋白 组织血型抗原
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GⅡ.23基因型诺如病毒P蛋白的寡糖结合特征 被引量:2
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作者 丛鑫 李涵博 段招军 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期45-50,共6页
诺如病毒(Noroviruses,NoVs)是导致人急性胃肠炎的最重要病原体之一,也是引起食源性疾病暴发的首要病原体。组织血型抗原(Histo-blood groups antigens,HBGAs)是NoVs的受体或宿主易感因子。已有研究表明HBGAs与NoVs的感染和流行高度相关... 诺如病毒(Noroviruses,NoVs)是导致人急性胃肠炎的最重要病原体之一,也是引起食源性疾病暴发的首要病原体。组织血型抗原(Histo-blood groups antigens,HBGAs)是NoVs的受体或宿主易感因子。已有研究表明HBGAs与NoVs的感染和流行高度相关。GⅡ.23是最近报道的NoVs新基因型。为了研究GⅡ.23与HBGAs的结合特征,表达纯化GⅡ.23基因型的P蛋白之后,通过唾液和寡糖结合实验研究其与HBGAs的结合特性,并通过同源结构模拟探索GⅡ.23 P蛋白与糖抗原潜在的对接分子机制,与已经解析的GⅡ.10的P蛋白与岩藻糖的复合物结构进行重叠。结果发现,GⅡ.23 P蛋白可以与B型唾液结合,但不结合A、O^+和O^-非分泌型唾液;P蛋白与H双糖抗原发生结合;分子模拟显示GⅡ.23 P蛋白具有与岩藻糖环结合的类似特征。本研究首次揭示了GⅡ.23 P蛋白与HBGAs受体的结合特征,为深入探索GⅡ.23基因型NoVs的进化、感染以及流行的具体机制提供了基础资料。 展开更多
关键词 急性胃肠炎 诺如病毒(NoVs) 人诺如病毒(HuNoVs) GⅡ.23 p蛋白 组织血型抗原(HBGAs) 受体
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小反刍兽疫病毒分离株China/Tib/07辅助质粒及微型基因组的构建和鉴定 被引量:2
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作者 刘文华 王志亮 +4 位作者 包静月 吴晓东 刘华雷 赵永刚 刘秀梵 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第10期1497-1502,共6页
本研究旨在构建小反刍兽疫病毒(PPRV)的辅助质粒和微型基因组并验证其功能,为建立PPRV反向遗传操作平台奠定基础。首先构建表达PPRV分离株China/Tib/07的N、P和L蛋白的辅助质粒pCI-N、pCI-P和pCI-L。通过间接免疫荧光试验验证3个辅助质... 本研究旨在构建小反刍兽疫病毒(PPRV)的辅助质粒和微型基因组并验证其功能,为建立PPRV反向遗传操作平台奠定基础。首先构建表达PPRV分离株China/Tib/07的N、P和L蛋白的辅助质粒pCI-N、pCI-P和pCI-L。通过间接免疫荧光试验验证3个辅助质粒转染细胞后的蛋白表达情况,并从mRNA水平上验证蛋白表达的正确性;扩增PPRV基因组两末端序列和eGFP报告基因,三者通过overlap-PCR连接并克隆至转录载体pOL-TV5中构建微型基因组。将构建的微型基因组分别与辅助病毒和3个辅助质粒进行共转染。经鉴定各辅助质粒完全正确,构建的微型基因组不论与辅助病毒还是与3个辅助质粒共转染,报告基因均表达。本试验成功构建了PPRV分离株的表达N、P和L蛋白的3个辅助质粒以及微型基因组,并用微型基因组验证了3个辅助质粒可以作为PPRV反向遗传操作的辅助质粒,为该病毒感染性克隆的构建奠定了基础。 展开更多
关键词 小反刍兽疫病毒 微型基因组 EGFp N蛋白 p蛋白 L蛋白
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新城疫病毒ClassⅠ强毒株磷蛋白在细胞中的表达与定位 被引量:2
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作者 程靖华 孙英杰 +5 位作者 陈鸿军 仇旭升 宋翠萍 于圣青 吴艳涛 丁铲 《中国动物传染病学报》 CAS 2013年第1期17-22,共6页
根据ClassI新城疫病毒分离株9a5b编码序列设计特异性引物扩增P蛋白基因,原核表达后利用纯化的蛋白免疫BALB/C小鼠制备单克隆抗体,经二次亚克隆后筛选到4株针对P蛋白的单克隆抗体,利用所得单抗进行P蛋白在细胞内定位分析,NDV9a5b株... 根据ClassI新城疫病毒分离株9a5b编码序列设计特异性引物扩增P蛋白基因,原核表达后利用纯化的蛋白免疫BALB/C小鼠制备单克隆抗体,经二次亚克隆后筛选到4株针对P蛋白的单克隆抗体,利用所得单抗进行P蛋白在细胞内定位分析,NDV9a5b株按5M.O.I感染量接种DFl单层细胞,当PI=4h时,P蛋白呈点状弥散分布于细胞浆内;PI=6~8h时,P蛋白聚集于细胞核周围;PI=12h时,P蛋白呈单极化聚集于细胞核一侧;而PI=16h后开始形成合胞体,P蛋白在单个细胞中仍呈现单极分布;当PI=48h时,细胞核已发生碎裂,荧光强度有所减弱。本研究为深入开展P蛋白在病毒增殖以及细胞周期中的作用机制研究奠定了基础。 展开更多
关键词 新城疫病毒 ClassⅠ p蛋白 细胞内定位
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GII.26型诺如病毒的组织血型抗原结合特征 被引量:2
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作者 李涵博 丛鑫 段招军 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第6期1310-1316,共7页
诺如病毒(Noroviruses,NoVs)是引起全球急性胃肠炎的常见病原。组织血型抗原(Histo-blood groups antigens,HBGAs)是NoVs黏附因子(受体),能促进病毒感染宿主细胞。NoVs主要衣壳蛋白突出(Protruding,P)区是与HBGAs结合的关键结构域。本... 诺如病毒(Noroviruses,NoVs)是引起全球急性胃肠炎的常见病原。组织血型抗原(Histo-blood groups antigens,HBGAs)是NoVs黏附因子(受体),能促进病毒感染宿主细胞。NoVs主要衣壳蛋白突出(Protruding,P)区是与HBGAs结合的关键结构域。本研究构建了非流行毒株GII.26型NoVs P区的原核表达重组质粒,以谷胱甘肽巯基转移酶(Glutathione s-transferase,GST)亲和层析纯化P蛋白,人鼻病毒的3C蛋白酶去掉GST标签,通过酶联免疫吸附实验探索P蛋白与HBGAs相互作用的特点,借助同源结构模拟以及结构重叠分析其与相应糖分子之间可能存在的对接位点。结果表明,P蛋白可与包括A型、B型、AB型、O型和非分泌型的215种唾液中的大部分发生结合,但只与19种寡糖中的H双糖结合;模拟的GII.26 P单体的空间构象与GII.17类似,可通过糖结合位点的5个氨基酸与H双糖特异性结合。本研究阐明了GII.26 P蛋白与HBGAs的结合特征及潜在分子机制,为进一步揭示GII.26 NoVs可能的流行趋势及研发潜在抗病毒药物奠定一定的基础。 展开更多
关键词 诺如病毒(NoVs) p蛋白 组织血型抗原(HBGAs) 受体
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乙型肝炎病毒P蛋白在大肠杆菌中的分段表达及纯化 被引量:1
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作者 任鹏程 张旭东 +4 位作者 吕海港 祁富军 昝玉玲 刘怡 安丽君 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2009年第11期1080-1083,共4页
目的构建乙型肝炎病毒(HBV)P基因分段重组原核表达质粒,并进行目的蛋白的表达和纯化。方法PCR扩增HBVP基因的不同片段(1~534、1008~2040和2043~2526bp),分别经双酶切后克隆至原核表达载体pET-28a中,构建重组原核表达质粒,转化E.coliB... 目的构建乙型肝炎病毒(HBV)P基因分段重组原核表达质粒,并进行目的蛋白的表达和纯化。方法PCR扩增HBVP基因的不同片段(1~534、1008~2040和2043~2526bp),分别经双酶切后克隆至原核表达载体pET-28a中,构建重组原核表达质粒,转化E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达,并对表达产物进行可溶性分析。用Ni2+-NTA凝胶亲和层析柱纯化融合蛋白,并进行Westernblot分析。结果重组原核表达质粒经酶切及测序证明构建正确。表达的融合蛋白主要以包涵体形式存在,表达量分别约占菌体总蛋白的34%、40%和36%。经Ni2+-NTA纯化的目的蛋白纯度达90%以上,且具有良好的反应原性。结论已成功构建了HBVP基因分段重组原核表达质粒,并在大肠杆菌中高效表达了重组蛋白,为研究HBVP蛋白的功能及病毒复制机制奠定了基础。 展开更多
关键词 乙型肝炎病毒 p蛋白 原核表达 病毒复制
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诺瓦克病毒P蛋白细菌细胞表面展示体系的构建及其功能评价 被引量:1
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作者 徐梦 吴文瑾 +1 位作者 徐婷 王大鹏 《国际病毒学杂志》 2020年第2期92-96,共5页
目的建立诺如病毒原型株诺瓦克病毒(Norwalk virus,NV)P蛋白细菌细胞表面展示体系,并对其进行功能评价。方法构建pET28a-inaQn-TB-P(GI.1)重组质粒,并在大肠杆菌中进行诱导表达,建立升级版假NV。以猪胃粘膜提取物中已知NV受体组织血型抗... 目的建立诺如病毒原型株诺瓦克病毒(Norwalk virus,NV)P蛋白细菌细胞表面展示体系,并对其进行功能评价。方法构建pET28a-inaQn-TB-P(GI.1)重组质粒,并在大肠杆菌中进行诱导表达,建立升级版假NV。以猪胃粘膜提取物中已知NV受体组织血型抗原(human histo-blood group antigens,HBGAs)为对象,验证假病毒特异性识别、捕获HBGAs的能力;以生菜叶中类HBGAs为对象,验证升级版假NV捕获生菜叶中NV配体的特性,并对所捕获的配体进行初步分析。结果获得可高效捕获NV受体/配体的假病毒体系,该体系可特异性识别并捕获猪胃粘膜提取物中A型HBGA和生菜中类HBGAs。另外,所捕获生菜中类HBGAs可以分别被A、H和Lewis a型HBGA单克隆抗体识别,且以H型HBGA抗原位点暴露最多。结论本研究成功建立了NV的P蛋白细菌细胞表面展示体系,可以识别并捕获HBGAs及其类似物,为解析NV与配体互作机制提供技术平台。 展开更多
关键词 诺瓦克病毒 细胞表面展示体系 p蛋白 生菜 配体
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GII.6型诺如病毒P蛋白原核表达及多克隆抗体制备 被引量:1
14
作者 亢涛 陈伟 +4 位作者 辛斯琪 张宇洋 苑荣亮 邵聪文 井申荣 《中华实验和临床病毒学杂志》 CAS CSCD 2020年第2期191-196,共6页
目的原核表达GII.6型诺如病毒(norovirus,NoV)P蛋白和制备多克隆抗体。方法扩增NoV GII.6型P区基因并克隆至pET28a载体,转化感受态E.coli BL21(DE3),IPTG诱导进行原核表达。使用Ni-NTA亲和柱层析进行纯化,重组蛋白进行寡糖结合分析,免疫... 目的原核表达GII.6型诺如病毒(norovirus,NoV)P蛋白和制备多克隆抗体。方法扩增NoV GII.6型P区基因并克隆至pET28a载体,转化感受态E.coli BL21(DE3),IPTG诱导进行原核表达。使用Ni-NTA亲和柱层析进行纯化,重组蛋白进行寡糖结合分析,免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体血清,ELISA测定该抗体的效价,western blot(WB)检测抗体的特异性,并进行有效性评估。结果成功构建了原核表达载体GII.6P-pET28a并表达相对分子质量约40×10^3的GII.6型P蛋白;Ni柱亲和层析纯化后纯度达90%以上;寡糖结合显示GII.6型P蛋白与B、leb、H2型结合,与A、H1、lea型不结合;ELISA测得抗体的效价为1∶160000;WB显示抗体具有较高特异性;交叉实验未显示出对GII.4的亲和力。结论成功表达了GII.6型P蛋白并获得高效价的抗体,为GII.6的检测和疫苗研发提供有效工具。 展开更多
关键词 GII.6 p蛋白 寡糖结合分析 原核表达 多克隆抗体
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细菌细胞表面展示体系提呈人源诺如病毒(GⅡ.4)抗原效果的评价 被引量:1
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作者 竺晖 王楠 +4 位作者 鲁飞凤 张子蕾 唐峰 徐婷 王大鹏 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第3期439-445,共7页
人源诺如病毒(Human noroviruses,HuNoVs)是重要的肠胃炎病毒之一,造成了全球巨额经济负担,故其防控成为研究热点。探究不同形式的免疫原对机体体液和粘膜免疫的激发效果,成为HuNoVs疫苗研发的一个突破口。本研究利用前期以细菌细胞表... 人源诺如病毒(Human noroviruses,HuNoVs)是重要的肠胃炎病毒之一,造成了全球巨额经济负担,故其防控成为研究热点。探究不同形式的免疫原对机体体液和粘膜免疫的激发效果,成为HuNoVs疫苗研发的一个突破口。本研究利用前期以细菌细胞表面展示体系构建的假HuNoVs(GⅡ.4)和纯化的P(GⅡ.4)蛋白为对象,乳化后每隔两周分别进行Balb/C小鼠皮下多点和口服免疫,并以间接酶联免疫吸附试验测定血清中抗体的消长规律。同时,以磷酸盐缓冲液作为对照。抗体效价测定结果显示:皮下免疫组的假HuNoVs(GⅡ.4)可以有效激发小鼠体液免疫,其效价稍低于以P(GⅡ.4)蛋白作为抗原免疫获得的抗体。经过5次免疫后,血清中IgG抗体效价基本趋于稳定。但是,假HuNoVs(GⅡ.4)和P(GⅡ.4)蛋白的口服免疫组血清中均未测到IgA和IgG抗体。因此,细菌细胞表面展示体系假HuNoVs(GⅡ.4)可以作为HuNoVs疫苗候选抗原的提呈体系,为该病毒的疫苗研发提供借鉴。 展开更多
关键词 人源诺如病毒(HuNoVs) 细菌细胞表面展示体系 p蛋白 免疫 抗原提呈
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抗小反刍兽疫病毒P蛋白单链抗体的制备及鉴定 被引量:1
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作者 金红岩 隋修锟 +6 位作者 刘欢 李文超 梁琳 赵玲娜 温施慧 Zheney Makay 李刚 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2016年第10期1226-1232,共7页
为制备抗小反刍兽疫病毒(PPRV)Nigeria75/1株P蛋白的单克隆抗体并获得其单链抗体(ScFv)基因,利用纯化的PPRV和带有GST标签的重组P蛋白免疫BALB/c小鼠,制备抗PPRV P蛋白的单克隆抗体(m Ab),从分泌抗PPRV P单克隆抗体的杂交瘤细胞中提取总... 为制备抗小反刍兽疫病毒(PPRV)Nigeria75/1株P蛋白的单克隆抗体并获得其单链抗体(ScFv)基因,利用纯化的PPRV和带有GST标签的重组P蛋白免疫BALB/c小鼠,制备抗PPRV P蛋白的单克隆抗体(m Ab),从分泌抗PPRV P单克隆抗体的杂交瘤细胞中提取总RNA,扩增VH基因和VL基因,采用重叠延伸PCR(SOE-PCR)法获得单链抗体全长基因,并克隆至原核表达载体p ET32a(+)中,再将构建的重组质粒p ET32a-ScFv-3A6转化大肠杆菌BL21(DE3),诱导单链抗体重组蛋白表达。结果,获得了4株能稳定分泌抗PPRV P蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株3A6、1P4、3F8和1P1,对m Ab 3A6进行了Western-blot鉴定和间接免疫荧光试验(IFA)。成功扩增了杂交瘤细胞株3A6的ScFv基因,获得了ScFv-3A6重组蛋白,大小为47 ku,证实该重组蛋白具有较强的抗原结合活性。上述研究结果表明,本研究获得了4株能稳定分泌抗PPRV P蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株,并成功扩增到杂交瘤细胞株3A6的ScFv基因,实现了原核表达,为PPR防控新措施的研究奠定了基础。 展开更多
关键词 小反刍兽疫病毒 p蛋白 单链抗体 原核表达
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小鼠抗人呼吸道合胞病毒磷蛋白(P蛋白)单克隆抗体的制备和鉴定
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作者 司竣宇 詹炉停 +5 位作者 依含 赵敏 张伟 孙永鹏 郑子峥 夏宁邵 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第11期1035-1041,共7页
目的制备抗人类呼吸道合胞病毒(HRSV)磷蛋白(P蛋白)单克隆抗体,并对其进行鉴定。方法以原核表达系统表达的HRSV P蛋白重叠肽段作为免疫原,采用杂交瘤技术筛选P蛋白单克隆抗体,Western blot法验证筛选获得的单克隆抗体与P蛋白的结合活性... 目的制备抗人类呼吸道合胞病毒(HRSV)磷蛋白(P蛋白)单克隆抗体,并对其进行鉴定。方法以原核表达系统表达的HRSV P蛋白重叠肽段作为免疫原,采用杂交瘤技术筛选P蛋白单克隆抗体,Western blot法验证筛选获得的单克隆抗体与P蛋白的结合活性,免疫荧光细胞化学染色确定获得的单克隆抗体能否用于RSV感染后HEp-2细胞中P蛋白的检测。结果筛选出反应性好、特异性识别HRSV P蛋白的单克隆抗体P181-15A3、P211-16D8。获得的单克隆抗体通过Western blot法验证可与P蛋白结合,并可用于RSV感染后HEp-2细胞中P蛋白的免疫细胞化学检测。结论成功制备了小鼠抗HRSV P蛋白的单克隆抗体。 展开更多
关键词 人类呼吸道合胞病毒(HRSV) 磷蛋白(p蛋白) 单克隆抗体
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小反刍兽疫病毒Tibet 07株P蛋白的真核表达及鉴定
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作者 王清华 赵文年 +3 位作者 刘春菊 王淑娟 包静月 王志亮 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2014年第8期1-4,共4页
为应用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达小反刍兽疫病毒西藏分离株Tibet 07的磷蛋白并对其进行鉴定,应用PCR技术扩增小反刍兽疫病毒Tibet 07株P基因片段,克隆至pFastBac/CT-TOPO载体中,构建重组穿梭质粒pFastBac-PPRV-P,进一步构建重组... 为应用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达小反刍兽疫病毒西藏分离株Tibet 07的磷蛋白并对其进行鉴定,应用PCR技术扩增小反刍兽疫病毒Tibet 07株P基因片段,克隆至pFastBac/CT-TOPO载体中,构建重组穿梭质粒pFastBac-PPRV-P,进一步构建重组杆状病毒Bacmid-PPRV-P,转染sf 9细胞,获得重组杆状病毒。通过SDS-PAGE鉴定P蛋白的表达,利用Western blot和间接免疫荧光鉴定P蛋白的抗原性。结果表明,表达的P蛋白分子质量约54ku;感染的sf 9细胞可与小反刍兽疫阳性血清发生特异性反应。表明应用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统成功表达了小反刍兽疫病毒西藏分离株Tibet 07的P蛋白,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。 展开更多
关键词 小反刍兽疫 p蛋白 杆状病毒表达系统
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大鼠脑缺血预处理对额叶神经细胞凋亡和P^(53)蛋白表达的影响
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作者 刘永海 魏秀娥 耿德勤 《实用神经疾病杂志》 2004年第6期8-9,共2页
目的 探讨大鼠短暂性全脑缺血预处理对再次脑缺血额叶神经细胞凋亡和P53蛋白表达的影响。方法 采用改良的 Pulsinelli 4血管阻断(4VO)方法,建立SD大鼠急性全脑缺血及预处理模型。雄性SD大鼠随机分为三组:预处理对照组,给予 3min全脑缺血... 目的 探讨大鼠短暂性全脑缺血预处理对再次脑缺血额叶神经细胞凋亡和P53蛋白表达的影响。方法 采用改良的 Pulsinelli 4血管阻断(4VO)方法,建立SD大鼠急性全脑缺血及预处理模型。雄性SD大鼠随机分为三组:预处理对照组,给予 3min全脑缺血;预处理缺血组,先给予3min全脑缺血,48h后在给予全脑缺血15min;缺血组,仅给予全脑缺血15min。采用 TUNEL方法观察额叶神经细胞凋亡,SP免疫组化方法检测P53蛋白的表达。结果 预处理对照组未见TUNEL阳性细胞,仅见个别 P53蛋白阳性细胞。预处理缺血组与缺血组相比,再灌注后48h、72h及7d额叶TUNEL阳性细胞数显著减少(P<0.01)。预处理缺 血组与缺血组相比,再灌注后48h、72h及7d额叶P53阳性细胞数显著减少(P<0.01)。结论 全脑缺血15min后额叶神经细胞 凋亡和P53蛋白表达增多。全脑缺血预处理能减少额叶缺血再灌注后神经细胞凋亡和P53蛋白的表达。 展开更多
关键词 p^53蛋白 全脑缺血 额叶 神经细胞凋亡 表达 阳性细胞 TUNEL 大鼠 对照组 脑缺血预处理
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狂犬病病毒P和M基因重组突变体的生物学特性分析
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作者 张银 金硕 +7 位作者 栗朵朵 Abraha Bahlbi Kiflu 韩菲 武梦思 凌小清 梁晶晶 李晓宁 罗廷荣 《南方农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第9期2634-2642,共9页
【目的】探索狂犬病病毒(RABV)强毒株P基因替换及P-M基因联合替换至弱毒株获得的重组突变体在宿主细胞内的传播能力、复制与转录能力及致病性,为掌握RABV强毒株P蛋白和M蛋白的生物学特性打下基础。【方法】以RABV广西街毒株GX01为研究对... 【目的】探索狂犬病病毒(RABV)强毒株P基因替换及P-M基因联合替换至弱毒株获得的重组突变体在宿主细胞内的传播能力、复制与转录能力及致病性,为掌握RABV强毒株P蛋白和M蛋白的生物学特性打下基础。【方法】以RABV广西街毒株GX01为研究对象,利用反向遗传技术将其P基因分别替换到弱毒株rRC-HL和r RC-HL(GX01M)株的对应位置,通过间接免疫荧光试验(IFA)及基因测序鉴定拯救的病毒,并测定重组突变体的多步生长曲线、荧光灶面积及N基因表达水平等,同时通过4周龄昆明小鼠攻毒试验验证P基因及P-M基因联合替换后对RABV致病性的影响。【结果】利用反向遗传技术能成功拯救重组突变体rRC-HL(GX01P)和rRC-HL(GX01P-M),通过IFA测定病毒荧光灶面积及多步生长曲线发现,r RC-HL(GX01P-M)株在BSR/T7-9细胞上的生长能力及传播能力均较rRC-HL(GX01P)株和rRC-HL(GX01M)株强。在复制与转录水平上,rRC-HL(GX01P)株的N基因相对表达量高于r RC-HL(GX01M)株,但低于rRC-HL(GX01P-M)株。在昆明小鼠攻毒试验中,重组突变体rRC-HL(GX01P)和rRC-HL(GX01P-M)攻毒后第4 d昆明小鼠开始出现精神不振、行动迟缓等症状,其致病性无明显差异;昆明小鼠体质量均呈一过性减轻,之后恢复正常并呈上升趋势;攻毒15 d内均未见昆明小鼠死亡,即重组突变体rRC-HL(GX01P)和rRCHL(GX01P-M)的致病性较弱。【结论】强毒株GX01的P基因与M基因联合替换可提高病毒传播能力,且二者具有协同性,但对弱毒株rRC-HL的毒力无影响。 展开更多
关键词 狂犬病病毒(RABV) p蛋白 M蛋白 联合替换 生物学特性
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