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黄瓜硝酸还原酶cDNA片段的克隆及其在缺氮胁迫下的表达 被引量:10
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作者 毛伟华 龚亚明 +2 位作者 夏晓剑 周艳虹 喻景权 《浙江农业学报》 CSCD 2007年第3期160-163,共4页
以黄瓜叶片总RNA为模板,应用逆转录—聚合酶链式反应(RT-PCR),首次扩增出黄瓜硝酸还原酶(NR)cDNA部分片段。经过测序和同源性分析表明:该基因片段长度为395 bp,与GenBank上所登录的笋瓜NR基因同源性达89%,根据所测序列推导该片段由131... 以黄瓜叶片总RNA为模板,应用逆转录—聚合酶链式反应(RT-PCR),首次扩增出黄瓜硝酸还原酶(NR)cDNA部分片段。经过测序和同源性分析表明:该基因片段长度为395 bp,与GenBank上所登录的笋瓜NR基因同源性达89%,根据所测序列推导该片段由131个氨基酸残基组成。进一步检测其在缺氮胁迫下的活性和表达变化,结果表明缺氮胁迫下硝酸还原酶的活性和表达都明显下降,推测黄瓜NR在转录水平上调节其活性。 展开更多
关键词 黄瓜 硝酸还原酶 RT-PCR 序列分析 基因表达 缺氮胁迫
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不同盐度和Fe^(3+)浓度对小球藻生长、硝酸还原酶活性及基因表达的影响 被引量:7
2
作者 杜宇 孙雪 徐年军 《生态科学》 CSCD 北大核心 2012年第4期441-445,共5页
论文以一株紫外诱变获得的蛋白核小球藻F-9-3为材料,研究了4个盐度和5个Fe3+浓度对其生长和硝酸还原酶(NR)活性及其基因表达的影响。盐度实验结果表明在0~0.30 mol L-1NaCl浓度范围内,小球藻生长较快;NR酶活性及其基因表达量都是在0.15... 论文以一株紫外诱变获得的蛋白核小球藻F-9-3为材料,研究了4个盐度和5个Fe3+浓度对其生长和硝酸还原酶(NR)活性及其基因表达的影响。盐度实验结果表明在0~0.30 mol L-1NaCl浓度范围内,小球藻生长较快;NR酶活性及其基因表达量都是在0.15和0.30 mol L-1NaCl较高。铁浓度实验结果表明在0.03和0.06 mmol L-1Fe3+浓度培养小球藻生长较快,NR酶活性和基因表达量较高;而高铁浓度组(0.12 mmol L-1)其生长受抑制,缺铁情况下nr基因表达量最高。因此适合该小球藻生长的最适盐度范围是0~0.30 mol L-1NaCl和0.03~0.06 mmol 展开更多
关键词 小球藻 盐度 Fe3+浓度 硝酸还原酶 基因表达
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丝状真菌米曲霉外源基因表达系统的构建 被引量:4
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作者 王斌 潘力 郭勇 《华南理工大学学报(自然科学版)》 EI CAS CSCD 北大核心 2009年第6期84-90,共7页
以米曲霉(Aspergillus oryzae)R IB40的基因组DNA为模板,聚合酶链式反应(PCR)扩增得到启动子、终止子、筛选标记基因等表达元件,依次连接到载体pUC119上,构建了米曲霉的重组表达载体pNMA.将米赫根毛霉脂肪酶基因(RML)连接于pNMA的启动子... 以米曲霉(Aspergillus oryzae)R IB40的基因组DNA为模板,聚合酶链式反应(PCR)扩增得到启动子、终止子、筛选标记基因等表达元件,依次连接到载体pUC119上,构建了米曲霉的重组表达载体pNMA.将米赫根毛霉脂肪酶基因(RML)连接于pNMA的启动子下,得到表达载体pNMA-RML,通过ApaⅠ酶切线性化转化米曲霉宿主菌A.oryzaeniaD300,得到整合型的阳性转化子A.oryzaeONL1.其培养7天的培养液的上清液在以三丁酸甘油酯为底物的平板上形成清晰的水解透明圈,碱滴定法酶活测定表明培养液酶活可达2.5U/mL,培养液上清液的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)图谱在相对分子质量32 500处有RML的特征条带.这说明RML已经在米曲霉中成功表达,同时证明所构建的米曲霉外源基因表达系统是有效的. 展开更多
关键词 米曲霉 外源基因表达 米赫根毛霉脂肪酶 硝酸盐还原酶 标记基因
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RT-PCR克隆甜菜硝酸还原酶cDNA全长序列及分析 被引量:3
4
作者 张杰 彭胜民 +3 位作者 周波 战晴晴 张荣沭 马凤鸣 《植物研究》 CAS CSCD 北大核心 2008年第4期412-416,共5页
根据GenBank中已公布的甜菜(Beta vulgaris)硝酸还原酶(nitrate reductase)基因序列(gb|ABW 05098.1|),设计引物,以50 mmol.L-1KNO3溶液处理的甜菜幼苗为材料,从总RNA中通过RT-PCR分离得到一个硝酸还原酶基因,其cDNA长2 760 bp,包含了... 根据GenBank中已公布的甜菜(Beta vulgaris)硝酸还原酶(nitrate reductase)基因序列(gb|ABW 05098.1|),设计引物,以50 mmol.L-1KNO3溶液处理的甜菜幼苗为材料,从总RNA中通过RT-PCR分离得到一个硝酸还原酶基因,其cDNA长2 760 bp,包含了完整的基因编码序列,与已公布的硝酸还原酶基因序列相似性达99%。Southern杂交分析表明,硝酸还原酶基因在甜菜基因组中可能以两个拷贝或低拷贝形式存在。根据其编码的氨基酸序列,利用生物信息学预测了其亚细胞定位和蛋白质的三级结构。 展开更多
关键词 甜菜 硝酸还原酶 基因克隆 RT-PCR
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桑树硝酸还原酶基因MaNR的克隆及其表达分析 被引量:3
5
作者 王茜龄 余亚圣 +4 位作者 杨艳 李军 刘长英 吕蕊花 余茂德 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2014年第12期2465-2475,共11页
【目的】以桑树栽培品种桂优62号为材料,克隆桑树硝酸还原酶(nitrate reductase,NR)基因全长cDNA和DNA序列并分析其序列特征,在此基础上研究桑树硝酸还原酶基因在桑树细胞脱分化和分化过程中的表达特征以及影响因素,为进一步阐述硝酸还... 【目的】以桑树栽培品种桂优62号为材料,克隆桑树硝酸还原酶(nitrate reductase,NR)基因全长cDNA和DNA序列并分析其序列特征,在此基础上研究桑树硝酸还原酶基因在桑树细胞脱分化和分化过程中的表达特征以及影响因素,为进一步阐述硝酸还原酶在桑树生长发育中的作用机制奠定基础。【方法】基于单倍体川桑(Morus notabilis Schneid)基因组数据(http://morus.swu.edu.cn/morusdb)注释的scaffold570序列设计特异引物,硝酸钾处理桑树叶片48 h后使用RNAiso Plus(TaKaRa)和改良CTAB法提取总RNA及基因组DNA,分别以cDNA和DNA为模板,用RT-PCR法克隆获得桑树NR全长cDNA和DNA序列,运用生物信息学手段对推定的氨基酸序列进行分析。以桑胚轴为外植体,在无菌条件下,接种在不同氮源、生长调节物质的培养基中,通过桑树胚轴离体再生过程和real-time PCR方法研究硝酸还原酶基因在离体再生过程中的表达差异以及不同氮源、生长调节物质对NR表达的影响。【结果】克隆获得的桑树NR全长CDS序列,长2 730 bp,编码909个氨基酸,推导的蛋白质分子量为102.84 kD,等电点为6.76。基因组序列长5 142 bp,包含5个外显子和4个内含子,具有完整的5个结构域。通过氨基酸序列比对发现,其序列高度保守,与川桑NR序列同源性达95%,与蔷薇科果树NR序列同源性达78%。聚类分析表明,单子叶植物聚为一组,桑树与蔷薇科果树聚为一组。GenBank登录号分别为KF992020.1和KF992021.1。NR在桑根中表达量最高,叶中表达次之,茎中表达最少;谷氨酸显著提高NR在桑叶中的表达量,GA3显著提高NR在桑茎中的表达量。桑胚轴在单一的NH4+-N培养基中,不能被诱导出愈伤组织及丛生芽,在单一的NO3--N培养基中可以诱导出愈伤组织和丛生芽;但丛生芽继代培养在单一NH4+-N的培养基中和单一的NO3--N培养基中都可以生长。real-time PCR结果显示,NR在子叶和胚轴中的表达量� 展开更多
关键词 桑树 硝酸还原酶 MaNR 细胞分化 实时荧光定量PCR
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甜菜硝酸还原酶全长基因的克隆及其在缺氮胁迫下表达与活性分析 被引量:1
6
作者 张杰 屈红军 +4 位作者 任静 李雪婧 张永强 梁明 马凤鸣 《黑龙江大学自然科学学报》 CAS 北大核心 2008年第5期614-620,共7页
用50 mmol.L-1KNO3溶液处理的甜菜幼苗提取总RNA,通过RT-PCR法从甜菜总RNA中分离得到一个硝酸还原酶基因,其cDNA长2 760 bp,包含了完整的基因编码序列,与已公布的硝酸还原酶基因序列相似性达99%。同时利用活体测定法检测了经缺氮胁迫不... 用50 mmol.L-1KNO3溶液处理的甜菜幼苗提取总RNA,通过RT-PCR法从甜菜总RNA中分离得到一个硝酸还原酶基因,其cDNA长2 760 bp,包含了完整的基因编码序列,与已公布的硝酸还原酶基因序列相似性达99%。同时利用活体测定法检测了经缺氮胁迫不同时间后甜菜叶中NR活性,并利用NR片段引物进行半定量RT-PCR,检测了基因的表达量。结果表明,随着缺氮处理时间的延长,甜菜叶中的NR活性随诱导时间增加活性逐渐降低,在缺氮处理1 h,其活性便有明显的降低;而NR的mRNA受缺氮胁迫下调表达,暗示着NR基因的表达与氮诱导相关。 展开更多
关键词 甜菜 硝酸还原酶活性 基因克隆 RT-PCR
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红麻亚硝酸还原酶基因HcNiR的克隆与表达分析 被引量:2
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作者 张超 邓勇 +4 位作者 黄思齐 伍应保 张高阳 满百膺 李德芳 《福建农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第5期600-608,共9页
【目的】了解红麻亚硝酸还原酶基因HcNiR生物信息学特性及组织表达特异性,为培育红麻氮高效利用品种提供理论依据。【方法】以红麻材料349叶片的cDNA为模板,利用PCR扩增HcNiR基因的CDS序列,采用生物信息学方法分析HcNiR的氨基酸组成、... 【目的】了解红麻亚硝酸还原酶基因HcNiR生物信息学特性及组织表达特异性,为培育红麻氮高效利用品种提供理论依据。【方法】以红麻材料349叶片的cDNA为模板,利用PCR扩增HcNiR基因的CDS序列,采用生物信息学方法分析HcNiR的氨基酸组成、蛋白质跨膜结构、信号肽、高级结构以及蛋白的同源进化树;采用实时荧光定量PCR检测HcNiR基因在红麻不同组织的表达情况。【结果】HcNiR基因cDNA全长1395 bp,编码蛋白含有464个氨基酸,包含2个保守的亚硝酸和亚硫酸还原酶4Fe-4S结构域及铁氧蛋白部分结构域。HcNiR蛋白是一个不含跨膜转运结构与信号肽的亲水稳定性蛋白质,该蛋白质等电点是5.49,分子量51.68 kDa;具有26处潜在磷酸化位点。在其蛋白二级结构中,α-螺旋和无规则卷曲所占比例超过70%。通过氨基酸序列同源性分析发现,红麻HcNiR氨基酸序列与木槿HsNiR氨基酸序列相似性较高,达到97.37%,都含有铁-硫/铁血红素结合位点。进化树分析结果表明,红麻HcNiR基因与木槿HsNiR基因亲缘关系较近。组织特异性表达结果显示,红麻HcNiR基因在叶中的表达量高于根。【结论】HcNiR基因编码蛋白含亚硝酸和亚硫酸还原酶4Fe-4S结构域及铁氧蛋白部分结构域;HcNiR基因具有组织表达特异性,在红麻叶片中表达较高,推测其主要在初级氮的同化过程中发挥重要调控作用。 展开更多
关键词 红麻 亚硝酸还原酶 HcNiR基因 基因克隆 表达分析
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彩色豆马勃硝酸还原酶基因克隆与序列分析 被引量:2
8
作者 周爱东 吴小芹 +2 位作者 王明生 王小龙 叶建仁 《南京林业大学学报(自然科学版)》 CAS CSCD 北大核心 2013年第6期22-26,共5页
彩色豆马勃是重要的林木外生菌根真菌,采用RT-PCR和cDNA末端快速扩增法(RACE)从彩色豆马勃中克隆得到硝酸还原酶基因,将其命名为ptnr(GenBank登录号为KC698974)。ptnr cDNA全长2 951 bp,ORF长2 754 bp,编码917个氨基酸,推测所得蛋白质... 彩色豆马勃是重要的林木外生菌根真菌,采用RT-PCR和cDNA末端快速扩增法(RACE)从彩色豆马勃中克隆得到硝酸还原酶基因,将其命名为ptnr(GenBank登录号为KC698974)。ptnr cDNA全长2 951 bp,ORF长2 754 bp,编码917个氨基酸,推测所得蛋白质的分子质量为102.06 ku,等电点为6.34。序列相似性检索和系统进化树分析结果显示:彩色豆马勃ptnr编码的氨基酸序列与担子菌皱木耳硝酸还原酶基因的氨基酸序列同源性最高为60%,与担子菌灰盖鬼伞的同源性为57%,与外生菌根真菌粘滑菇和双色蜡蘑的同源性分别为53%和56%。 展开更多
关键词 外生菌根真菌 彩色豆马勃 硝酸还原酶基因 CDNA末端快速扩增 序列分析
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氮素对水稻幼苗氮代谢相关酶活性及相关基因表达的影响 被引量:2
9
作者 杨忠良 刘海英 +3 位作者 刘会 徐振华 陶永庆 黄翠 《黑龙江农业科学》 2017年第10期26-31,共6页
为明确氮素对不同蛋白质含量水稻幼苗的影响,用营养液培养的方法,对4个稻米蛋白质含量有差异的粳稻品种幼苗进行诱导处理,研究了水稻幼苗在0.05mol·L^(-1) KNO3处理下,各品种水稻干物质积累的差异,以及硝酸还原酶(NR)、谷氨酰胺合... 为明确氮素对不同蛋白质含量水稻幼苗的影响,用营养液培养的方法,对4个稻米蛋白质含量有差异的粳稻品种幼苗进行诱导处理,研究了水稻幼苗在0.05mol·L^(-1) KNO3处理下,各品种水稻干物质积累的差异,以及硝酸还原酶(NR)、谷氨酰胺合成酶(GS)活性和NR基因(OsNR1)、GS基因(OsGs1^(-1))表达差异。结果表明:经0.05mol·L^(-1) KNO3处理后各品种地上部和根干重均显著高于对照,叶片和根中硝态氮(NO_3^--N)和铵态氮(NH_4^+-N)含量显著高于对照,叶片中NR和GS活性显著高于对照;随着氮素处理时间的增加,OsNR1基因相对表达量增加,在处理2h时达到最大值,而后呈随处理时间的增加呈下降的趋势;在氮素处理前期,OsGs1^(-1)的表达量变化不大,而在处理8h时,OsGs1^(-1)基因的表达量显著增加,此时的基因相对表达量是处理前的1.2倍。 展开更多
关键词 水稻 氮素水平 硝酸还原酶 谷氨酰胺合成酶 基因表达
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地中海拟无枝菌酸菌U-32硝酸还原酶的基因克隆
10
作者 李果龙 杨蕴刘 焦瑞身 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 1994年第3期200-205,共6页
Southern杂交分析表明在地中海拟无枝菌酸菌U-32染色体DNA和黑曲霉niaD(硝酸还原酶基因)之间存在着明显的同源性。利用异源niaD探针从地中海拟无枝菌酸菌U-32基因文库中筛选得到一个能与niaD杂交的5.0kb的PstⅠ片段。该片段经同位素标... Southern杂交分析表明在地中海拟无枝菌酸菌U-32染色体DNA和黑曲霉niaD(硝酸还原酶基因)之间存在着明显的同源性。利用异源niaD探针从地中海拟无枝菌酸菌U-32基因文库中筛选得到一个能与niaD杂交的5.0kb的PstⅠ片段。该片段经同位素标记后能与地中海拟无枝菌酸菌U-32染色体上一个相同的PstⅠ片段杂交,位于这一片段上的2.1kb SmaⅠ-EcoR Ⅴ片段只能与以硝酸盐为唯一氮源的总RNA杂交,而不能与相同条件下以铵盐为唯一氮源的总RNA杂交,这些结果表明,所克隆到的5.0kb PstⅠDNA片段含有地中海拟无枝菌酸菌U-32的硝酸还原酶基因。这是好氧细菌硝酸还原酶基因克隆的首次报道。由该酶蛋白分子量推测,其结构基因大小在1.5kb左右,进一步的杂交分析发现在5.0kb的PstⅠ片段中含有完整的NR基因。用20种限制酶对重组质粒pJL1进行了限制酶酶谱的构建,发现有10种酶在pJL1外源片段上无切点,6种酶为单切点,EcoRⅠ与SmaⅠ各有两个切点。 展开更多
关键词 地中海 拟无枝菌酸菌 硝酸还原酶
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水稻硝酸还原酶基因5′上游序列的克隆与序列分析 被引量:1
11
作者 胡静 吴文华 《华中师范大学学报(自然科学版)》 CAS CSCD 北大核心 2009年第2期284-288,共5页
以日本晴水稻幼苗叶的基因组总DNA为模板,采用PCR方法扩增获得约1 300 bp大小的DNA片段,回收该片段并与pMD18-T载体连接,转化大肠杆菌感受态,并提取质粒DNA。用凝胶电泳检测和酶切鉴定,选取阳性克隆进行测序分析。测序结果显示,该片段含... 以日本晴水稻幼苗叶的基因组总DNA为模板,采用PCR方法扩增获得约1 300 bp大小的DNA片段,回收该片段并与pMD18-T载体连接,转化大肠杆菌感受态,并提取质粒DNA。用凝胶电泳检测和酶切鉴定,选取阳性克隆进行测序分析。测序结果显示,该片段含1 376个核苷酸对;应用NCB1网站的BLAST软件对本试验中克隆的序列与GenBank(NC_008401)公布的水稻硝酸还原酶基因启动子序列进行比对,有3个核苷酸差异,同源性为99%,证实本试验中克隆的DNA序列为水稻硝酸诱导基因启动子。该序列含有多个与转录调控有关的保守序列(如TATA-box、CAAT-box和GAGA-box)。此序列的成功克隆,为今后开展水稻等重要农作物转基因研究奠定基础。 展开更多
关键词 日本晴水稻 硝酸还原酶基因 5’上游序列 基因克隆
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嗜碱盐单胞菌X3中异化型硝酸盐还原酶编码基因簇的功能验证及蛋白结构预测 被引量:1
12
作者 王越 李秋芬 张艳 《中国海洋大学学报(自然科学版)》 CAS CSCD 北大核心 2019年第4期33-40,共8页
细菌的氮代谢推动环境的氮循环,硝酸盐还原反应是氮代谢途径中重要步骤之一。本文运用酶活测定、qRTPCR和生物信息学软件分析的方法,对嗜碱盐单胞菌(Halomonas alkaliphila)X3中编码细菌异化型硝酸盐还原酶(Dissimilatory nitrate reduc... 细菌的氮代谢推动环境的氮循环,硝酸盐还原反应是氮代谢途径中重要步骤之一。本文运用酶活测定、qRTPCR和生物信息学软件分析的方法,对嗜碱盐单胞菌(Halomonas alkaliphila)X3中编码细菌异化型硝酸盐还原酶(Dissimilatory nitrate reductase,Nar)不同亚基的基因簇narGYJV进行了功能验证、蛋白结构预测和系统发育分析。研究表明,X3菌株中存在narGYJV基因簇并具有表达活性,测得Nar的酶活为每克蛋白21.415U;预测到的narGYJV编码蛋白功能区域中1~1246氨基酸属于NarG超家族,编码Nar的α亚基;1261~1752氨基酸属于DMSOR-beta-like超家族,编码Nar的β亚基;2061~2279氨基酸编码γ亚基,1802~2018氨基酸编码δ亚基;Nar的二级结构中无规卷曲占37.59%,α螺旋占34.43%,延伸链占18.33%;NarG、NarY和NarV的3D结构与PDB中大肠杆菌(Escherichia coli)的1Q16 3D结构最接近,覆盖率96%~100%。系统发育树显示,菌株X3中NarG与同属菌的遗传距离较近,在不同菌属间虽然功能相似,其同源性较低;NarY与大肠杆菌中的氨基酸序列的同源关系较近,说明异化型硝酸盐还原酶Nar中不同亚基的系统发育地位不同。研究结果表明,Halomonas alkaliphila X3菌株中存在编码Nar的基因簇narGYJV,编码蛋白具有独特的3D结构,不同亚基的系统发育地位不同。研究结果为进一步研究该菌的氮代谢通路选择和调控机制提供了依据。 展开更多
关键词 嗜碱盐单胞菌 异化型硝酸盐还原酶 基因簇narGYJV 3D结构 qRT-PCR 系统发育树
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硝酸还原酶合成的NO通过诱导酸敏感水稻根尖ROS积累引起酸毒
13
作者 孙黎明 马建锋 沈仁芳 《土壤学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第1期201-211,共11页
酸毒是酸性土壤中限制作物生长的重要因子之一,但酸毒通常与金属离子毒性共存,难以在土壤中直接研究,目前关于水稻酸毒机制的报道较少。选用前期筛选的酸耐性不同的两个水稻品种Kasalath(酸耐性)和Jinguoyin(酸敏感),研究水稻的酸敏感... 酸毒是酸性土壤中限制作物生长的重要因子之一,但酸毒通常与金属离子毒性共存,难以在土壤中直接研究,目前关于水稻酸毒机制的报道较少。选用前期筛选的酸耐性不同的两个水稻品种Kasalath(酸耐性)和Jinguoyin(酸敏感),研究水稻的酸敏感性与活性氧(ROS)积累及氧化还原代谢相关酶的关系,并试图探讨酸毒害中一氧化氮(NO)信号与活性氧信号的调控关系。结果显示,低pH引起酸敏感水稻品种Jinguoyin中根尖NO和ROS的富集,但酸耐性水稻品种Kasalath中无显著变化。NO清除剂2-(4-羧基苯基)-4,4,5,5-四甲基咪唑啉-1-氧基-3-氧化物钾盐(cPTIO)可清除Jinguoyin根尖富集的NO和ROS。硝酸还原酶反馈抑制剂谷氨酰胺(Gln)可明显降低Jinguoyin在低pH下的根尖NO信号,而一氧化氮合酶抑制剂N’-硝基-L-精氨酸甲酯盐酸盐(L-NAME)对根尖NO信号无影响。低pH显著提高了Jinguoyin中硝酸还原酶基因NIA1、NIA2和NIA3的表达,同时也提高了硝酸还原酶活性。可见,低pH下Jinguoyin受到的酸毒与NO介导的ROS富集有关,酸毒下产生的NO信号主要由硝酸还原酶合成,其硝酸还原酶基因NIA1和NIA2的表达调控硝酸还原酶活性的提高。 展开更多
关键词 酸耐性 水稻 硝酸还原酶基因 一氧化氮(NO) 活性氧(ROS)
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杜氏盐藻硝酸盐还原酶基因5′上游序列的克隆与序列分析 被引量:1
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作者 李杰 刘红涛 +3 位作者 鲁照明 李慎柯 宋贤瑞 薛乐勋 《郑州大学学报(医学版)》 CAS 北大核心 2007年第2期219-222,共4页
目的:克隆杜氏盐藻硝酸盐还原酶(NR)基因5′上游序列,并对其进行测序和序列分析。方法:提取杜氏盐藻基因组DNA,经过BamHI、EcoRI、HindⅢ、PstI、SalⅠ及XbalⅠ限制性内切酶分别酶切后,再与相应接头连接,分别构建盐藻步行基因组文库BL... 目的:克隆杜氏盐藻硝酸盐还原酶(NR)基因5′上游序列,并对其进行测序和序列分析。方法:提取杜氏盐藻基因组DNA,经过BamHI、EcoRI、HindⅢ、PstI、SalⅠ及XbalⅠ限制性内切酶分别酶切后,再与相应接头连接,分别构建盐藻步行基因组文库BL、EL、HL、PL、SL和XL。采用巢式(LA)-PCR方法,从上述步行基因组文库中扩增杜氏盐藻NR基因5′上游序列,克隆至pMD18-T,对酶切鉴定正确的克隆进行测序。结果:从HL里扩出约1200bp特异性片断,回收此片段并进行T载体克隆,对阳性克隆测序。该序列的3′端与已知NR基因cDNA5′端序列完全一致。该序列含有多个与转录调控有关的保守序列(如CAAT-box和GAGA-box),含有与EBP、EFII、NF-E1、LV等转录因子以及广谱激活剂Oct-1结合位点相似的核苷酸序列。结论:采用LA-PCR基因组步行方法,从已知cDNA周围未知启动子或其他调控区域中克隆得到的NR基因的5′上游区序列,可能是一种新的杜氏盐藻启动子区序列。 展开更多
关键词 杜氏盐藻 硝酸盐还原酶 基因克隆
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甜菜硝酸还原酶活性分析及基因片段的克隆
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作者 张杰 吴迪 +3 位作者 彭胜民 姜月 刘岩 马凤鸣 《哈尔滨商业大学学报(自然科学版)》 CAS 2008年第5期610-613,共4页
为了明确缺氮条件下甜菜NR的活性,用活体测定法检测了经缺氮胁迫不同时间后甜菜叶中NR活性.结果表明,随着缺氮处理时间的延长,甜菜叶中的NR活性逐渐降低,在缺氮处理1 h后,其活性下降较快.用50 mmol/L KNO3溶液处理的甜菜幼苗总RNA,通过R... 为了明确缺氮条件下甜菜NR的活性,用活体测定法检测了经缺氮胁迫不同时间后甜菜叶中NR活性.结果表明,随着缺氮处理时间的延长,甜菜叶中的NR活性逐渐降低,在缺氮处理1 h后,其活性下降较快.用50 mmol/L KNO3溶液处理的甜菜幼苗总RNA,通过RT-PCR分离得到了硝酸还原酶基因片段,长度为471 bp,Blast分析表明,其与Genbank中硝酸还原酶基因部分序列具有高度同源性. 展开更多
关键词 甜菜 硝酸还原酶活性 基因克隆 RT—PCR
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甘蓝过量表达硝酸还原酶基因对硝酸盐积累的影响
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作者 张正英 陈玉梁 《西北农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第7期1024-1028,共5页
为探索过量表达硝酸还原酶基因对甘蓝(Brassicaoleracea L.var.capitata L.)硝酸盐积累的影响,以‘中甘11号’下胚轴为外植体,采用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法将烟草硝酸还原酶基因(NR)导入甘蓝,获得13株卡那霉... 为探索过量表达硝酸还原酶基因对甘蓝(Brassicaoleracea L.var.capitata L.)硝酸盐积累的影响,以‘中甘11号’下胚轴为外植体,采用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法将烟草硝酸还原酶基因(NR)导入甘蓝,获得13株卡那霉素抗性植株.PCR和Southern blot检测证实,NR基因已经成功导入并整合到甘蓝的基因组.4个转基因株系硝酸盐质量分数明显低于非转基因供体株系,降幅为13.9%~23.0%.说明:将重组硝酸还原酶基因导入甘蓝且得到超量表达,创制低硝酸盐育种材料的方法可行. 展开更多
关键词 甘蓝 农杆菌介导法 硝酸还原酶基因 硝酸盐质量分数
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甜菜硝酸还原酶基因编码氨基酸偏好及功能预测分析
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作者 丁广洲 侯静 马凤鸣 《中国糖料》 2011年第4期3-6,共4页
利用同源序列克隆方法从标准偏高糖型甜菜二倍体纯系Ty7中获得氮素诱导甜菜硝酸还原酶基因片段,通过RACE技术克隆基因全长序列;该基因ORF长度2718 bp,编码905个氨基酸,分子量大小为102kD(ExPaSy的分子量分析),等电点为6.12,含有147bp的5... 利用同源序列克隆方法从标准偏高糖型甜菜二倍体纯系Ty7中获得氮素诱导甜菜硝酸还原酶基因片段,通过RACE技术克隆基因全长序列;该基因ORF长度2718 bp,编码905个氨基酸,分子量大小为102kD(ExPaSy的分子量分析),等电点为6.12,含有147bp的5'UTR和382 bp的3'UTR,Genbank上的注册号为EU163265,甜菜硝酸还原酶基因编码多肽含有3个氧化还原功能区:钼辅因子功能区(eukary NR Moco;93-478),Fe-血红素结合区(Cyt-b5;535-608),FAD结合区(FAD binding 6;653-760)。利用网上的公共数据库和相关软件对该基因氨基酸偏好和编码蛋白的理化性质进行了分析,并对其功能进行了预测。上述研究结果为下一步基因的表达与调控研究奠定了基础。 展开更多
关键词 甜菜 硝酸还原酶基因 氨基酸偏好 功能预测
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杜氏盐藻硝酸盐还原酶基因5′上游序列驱动bar基因的表达
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作者 闫红霞 李杰 +3 位作者 王莉莉 冯英才 曲东京 薛乐勋 《郑州大学学报(医学版)》 CAS 北大核心 2008年第6期1129-1133,共5页
目的:探讨杜氏盐藻硝酸盐还原酶(NR)基因5′上游序列(Pnr)是否可以驱动外源基因在杜氏盐藻中的表达。方法:利用改进的重叠区扩增基因拼接法(SOEing),将杜氏盐藻NR基因5′上游序列(Pnr)与除草剂抗性基因bar融合。同时将NR基因3′端序列(T... 目的:探讨杜氏盐藻硝酸盐还原酶(NR)基因5′上游序列(Pnr)是否可以驱动外源基因在杜氏盐藻中的表达。方法:利用改进的重叠区扩增基因拼接法(SOEing),将杜氏盐藻NR基因5′上游序列(Pnr)与除草剂抗性基因bar融合。同时将NR基因3′端序列(Tnr)与克隆载体pEGM-7zf连接,构成中间载体pEGM-7zf-Tnr。最后将融合片段Pnr-Tnr与中间载体连接,构建含Pnr-bar-Tnr表达盒的盐藻真核表达载体p7NBT。电击法转化杜氏盐藻,通过草丁膦培养筛选转化藻株后对其进行分析。结果:转化藻株总RNA的RT-PCR结果扩增出与bar基因序列完全一致的目的片段。结论:杜氏盐藻NR基因Pnr能够驱动外源基因bar的转录。 展开更多
关键词 杜氏盐藻 硝酸还原酶 5′上游序列 BAR基因
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Response of Nitrate Metabolism in Seedlings of Oilseed Rape(Brassica napus L.) to Low Oxygen Stress 被引量:4
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作者 YU Chang-bing XIE Yu-yun +3 位作者 HOU Jia-jia FU You-qiang SHEN Hong LIAO Xing 《Journal of Integrative Agriculture》 SCIE CAS CSCD 2014年第11期2416-2423,共8页
In order to understand the response of nitrate metabolism in seedlings of oilseed rape (Brassica napus L.) to low oxygen stress (LOS), two cultivars were studied at different light, LOS time and exogenous nitrate ... In order to understand the response of nitrate metabolism in seedlings of oilseed rape (Brassica napus L.) to low oxygen stress (LOS), two cultivars were studied at different light, LOS time and exogenous nitrate concentrations under hydroponic stress. Results show that N-uptake and dry matter of rape seedlings were decreased after LOS stress while nitrate accumulation (NA) under LOS was induced by darkness. Nitrate accumulation peaked at 3 d while root activity (RA, deifned as dehydrogenase activity) decreased with prolonged waterlogging exposure. Exogenous nitrate signiifcantly elevated NA and RA. Tungstate (TS) and LOS inhibited nitrate reductase (NR) activity while NR transcription and activity were enhanced by exogenous nitrate. Low oxygen stress stimulated the activity of superoxide dismutase (SOD) and peroxidase (POD) slightly, but inhibited that of catalase (CAT). B. napus L. Zhongshuang 10 (ZS10), a LOS tolerant cultivar, displayed smaller decrease upon dry matter under LOS, higher NA in darkness and lower NA in light than B. napus L. Ganlan CC (GAC), a LOS sensitive variety. ZS10 had lower NA and higher RA after waterlogging and exogenous nitrate treatment, and higher NR activity under TS inhibition than GAC, but the activity of antioxidant enzymes did not change under LOS. The results indicate that nitrate metabolism involved tolerance of rape seedlings to LOS, with lower accumulation and higher reduction of nitrate being related to higher LOS tolerance of rape seedlings exposed to waterlogging. 展开更多
关键词 Brassica napus low oxygen stress nitrate accumulation nitrate reductase gene expression
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腊样芽胞杆菌DNF409中硝酸盐还原酶基因敲除的研究 被引量:3
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作者 刘卿 梁运祥 葛向阳 《华中农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第1期43-47,共5页
在腊样芽胞杆菌DNF409中,narGHJI基因负责编码呼吸过程中硝酸盐还原酶基因nar的α、β、γ、δ四个亚基。通过基因同源重组的方法,利用一段带有终止序列和Ω环的链霉素抗性片段,取代nar中的部分基因片段,实现硝酸盐还原酶的基因敲除,从... 在腊样芽胞杆菌DNF409中,narGHJI基因负责编码呼吸过程中硝酸盐还原酶基因nar的α、β、γ、δ四个亚基。通过基因同源重组的方法,利用一段带有终止序列和Ω环的链霉素抗性片段,取代nar中的部分基因片段,实现硝酸盐还原酶的基因敲除,从而得到专一降解亚硝酸盐的突变体菌株,其硝酸盐还原酶的活性降低了80%。该菌与DNF409共同使用,可解除DNF409单独使用时亚硝酸盐严重积累的现象。 展开更多
关键词 DNF409 硝酸盐还原酶 基因敲除 同源重组
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