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基于DPO引物检测猪流行性腹泻病毒荧光定量RT-PCR方法的建立及初步应用 被引量：6
1
作者 王以欣 王紫薇 +8 位作者 汉武娇 王丽 姜艳平 崔文 周晗 乔薪瑗 唐丽杰 李一经 徐义刚 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第7期710-715,共6页
为建立快速、准确检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)的方法,本研究以PEDV的N基因为靶基因,基于双启动寡核苷酸引物(DPO),经过条件优化,建立了检测PEDV的荧光定量RT-PCR方法。结果显示,DPO引物的有效退火温度范围较宽(45℃~65℃);在测试的10种... 为建立快速、准确检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)的方法,本研究以PEDV的N基因为靶基因,基于双启动寡核苷酸引物(DPO),经过条件优化,建立了检测PEDV的荧光定量RT-PCR方法。结果显示,DPO引物的有效退火温度范围较宽(45℃~65℃);在测试的10种病毒中仅PEDV为阳性扩增结果,其余病毒为阴性结果,特异性较强;对PEDV质粒标准品的检测限可达1.64×10^1拷贝/μL,敏感性较高;组内、组间重复性结果的变异系数均小于1%,重复性较好。利用该方法对采集的272份临床仔猪腹泻样品(粪便、小肠组织)进行检测,结果显示,共检出PEDV阳性样品39份,阳性率为14.34%,与常规RT-PCR方法检测结果的阳性符合率为92.31%;本研究建立方法检测的阳性样品经PEDV N基因测序鉴定,确实均为PEDV阳性样品。本研究建立的基于DPO引物检测PEDV的荧光定量RT-PCR方法为PEDV的准确检测和流行病学调查提供技术支持。 展开更多
关键词 猪流行性腹泻病毒 DPO引物 荧光定量rt-pcr
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Real-time TaqMan RT-PCR快速检测犬瘟热病毒方法的研究 被引量：2
2
作者 王君玮 孙承英 +6 位作者 姜平 王志亮 张维 李林 赵永刚 王珊 任炜杰 《现代生物医学进展》 CAS 2007年第2期265-268,共4页
按照犬瘟热(CDV)N基因序列,设计合成了特异性引物和探针,经各反应条件的优化,建立了Real-time荧光定量RT-PCR技术,对细胞培养物、肝脏、肺脏、脑、脾脏、淋巴结以及鼻腔拭子等组织病料中的CDV进行了特异性检测和敏感性试验。同时,利用... 按照犬瘟热(CDV)N基因序列,设计合成了特异性引物和探针,经各反应条件的优化,建立了Real-time荧光定量RT-PCR技术,对细胞培养物、肝脏、肺脏、脑、脾脏、淋巴结以及鼻腔拭子等组织病料中的CDV进行了特异性检测和敏感性试验。同时,利用建立的Real-time荧光定量RT-PCR方法与常规RT-PCR以及韩国BIOINDIST生产的BIT RAPID CDV检测试剂盒对57份临床样品进行了检测。结果:用20pmol/mL的引物浓度各1uL和20pmol/mL的探针浓度0．3uL,获得的荧光信号最强,曲线平滑。敏感性高,可检测到1．24×10—3ng/uL的病毒RNA;特异性强,与NDV、AIV、NiPV等RNA病毒不发生交叉反应。试验重复性的变异系数(CV)分别为2．3%、2．5%和4．2%;与常规RT-PCR和BIOINDIST生产的BIT RAPID CDV检测试剂盒相比较,该方法具有快速、特异、敏感、可定量,并可同时检测大量样品等优点。 展开更多
关键词 犬瘟热病毒 荧光定量rt—pcr Real—time pcr 检测
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血管内皮生长因子C在宫颈癌中表达的临床研究 被引量：1
3
作者 杨彩虹 李小涛 +1 位作者 张雪玉 张咏梅 《宁夏医科大学学报》 2011年第11期1048-1050,1057,共4页
目的检测宫颈癌患者血管内皮生长因子C(Vascular endothelial growth factor-C,VEGF-C)表达水平,探讨宫颈癌患者VEGF-C表达水平的临床意义。方法采用荧光定量RT-PCR(Real Time FluorescenceQuantitative PCR,FQ RT-PCR)技术定量检测60... 目的检测宫颈癌患者血管内皮生长因子C(Vascular endothelial growth factor-C,VEGF-C)表达水平,探讨宫颈癌患者VEGF-C表达水平的临床意义。方法采用荧光定量RT-PCR(Real Time FluorescenceQuantitative PCR,FQ RT-PCR)技术定量检测60例宫颈浸润癌和20例正常宫颈组织标本中VEGF-C mRNA表达水平;采用酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)测定同一患者血清VEGF-C浓度。结果宫颈癌患者组织标本中VEGF-C mRNA水平及血清中VEGF-C浓度显著高于正常宫颈者(P<0.01),并且随着临床期别的升高依次升高(P=0.000),与肿瘤的浸润深度和有无淋巴结转移有关(P<0.05),而与肿瘤的组织类型、分化程度无关(P>0.05)。宫颈癌患者组织中VEGF-C mRNA表达量与血清中VEGF-C浓度呈正相关(P<0.01,r=0.517)。结论 VEGF-C可以成为宫颈癌术前预测盆腔淋巴结转移及预后评估的一个因子。 展开更多
关键词 宫颈癌 VEGF-C 荧光定量rt-pcr ELISA
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登革病毒感染早期2种检测方法的比较分析 被引量：2
4
作者 张彦丽 罗琳 +2 位作者 苏彦 李钰桦 张桂玲 《中国卫生检验杂志》 CAS 2018年第1期39-40,43,共3页
目的比较ELISA法和荧光定量RT-PCR 2种方法在登革热疫情中标本检测方面的差异,为登革热急性标本选用合适的检测方法提供科学依据。方法对佛山市南海区内发病7 d内的登革热疫情中疑似血清标本178份同时采用ELISA方法(检测登革病毒Ig M抗... 目的比较ELISA法和荧光定量RT-PCR 2种方法在登革热疫情中标本检测方面的差异,为登革热急性标本选用合适的检测方法提供科学依据。方法对佛山市南海区内发病7 d内的登革热疫情中疑似血清标本178份同时采用ELISA方法(检测登革病毒Ig M抗体)和荧光定量RT-PCR 2种方法检测。结果发病1 d^5 d病程的核酸检出率较高,占总检出量的81.5%,从第5 d开始后大幅降低。单一选用核酸检测第4 d标本单一Ig M抗体阳性的7.4%标本漏检,第5 d单一Ig M抗体阳性的23.5%标本漏检,发病6 d^7 d的标本单一选用抗体检测,单一核酸检测阳性的23.2%标本漏检。结论发病4 d^7 d标本单一选用一种方法检测容易漏检,若核酸检测为阴性时通过病毒特异抗体的快速初筛方法,以判断是否采用抗体的ELISA方法进行检测,可以减低漏检率,减少工作量。 展开更多
关键词 登革病毒 实验室检测 IGM抗体 荧光定量rt-pcr方法
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纳米银抑制铜绿微囊藻的机理研究 被引量：1
5
作者 郝从芳 金新 +3 位作者 沈志凯 李存治 毛灵琪 闫达中 《生物技术》 CAS CSCD 北大核心 2015年第1期61-65,共5页
[目的]纳米银可以抑制铜绿微囊藻的繁殖及减少其叶绿素a的合成,但具体机理还不清楚,该研究探讨纳米银抑制铜绿微囊藻的生化和分子机理。[方法]用琼脂糖凝胶电泳法检测了经纳米银作用后铜绿微囊藻基因组的降解情况,用硫代巴比妥酸(TBA)... [目的]纳米银可以抑制铜绿微囊藻的繁殖及减少其叶绿素a的合成,但具体机理还不清楚,该研究探讨纳米银抑制铜绿微囊藻的生化和分子机理。[方法]用琼脂糖凝胶电泳法检测了经纳米银作用后铜绿微囊藻基因组的降解情况,用硫代巴比妥酸(TBA)法检测了细胞膜氧化产物丙二醛(MDA)的含量及用实时荧光定量PCR检测了叶绿素a合成基因chl L的表达量的变化。[结果]经纳米银作用后的铜绿微囊藻的基因组电泳图显示相对严重的断裂现象,丙二醛含量明显增多,叶绿素合成基因chl L的表达量也显著下降。[结论]纳米银可以损坏铜绿微囊藻的细胞膜与基因组,进而影响基因表达,使叶绿素合成相关的chl L基因表达量显著下降,抑制铜绿微囊藻的繁殖,甚至致其死亡。 展开更多
关键词 铜绿微囊藻 纳米银 丙二醛 实时荧光定量pcr
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RT-PCR检测鹿源致病性大肠杆菌耐药基因blaAmpC的mRNA水平
6
作者 王丽艳 王全凯 +5 位作者 王玮 邓旭明 张晶 尹秀玲 郎需龙 柳巨雄 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第2期163-165,共3页
应用实时荧光定量RT-PCR对临床分离的10株鹿源大肠杆菌耐药株的blaAmpC基因进行了mRNA水平的定量测定,分析其mRNA转录水平与耐药强度的相关性。结果发现,对β-内酰胺类药物耐药水平高的菌株,其mRNA的表达水平亦高,表明大肠杆菌耐药株bla... 应用实时荧光定量RT-PCR对临床分离的10株鹿源大肠杆菌耐药株的blaAmpC基因进行了mRNA水平的定量测定,分析其mRNA转录水平与耐药强度的相关性。结果发现,对β-内酰胺类药物耐药水平高的菌株,其mRNA的表达水平亦高,表明大肠杆菌耐药株blaAmpC基因的mRNA表达水平与其耐药性有高度相关性。 展开更多
关键词 大肠杆菌 实时荧光定量rt-pcr 细菌耐药性 blaAmpC基因
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禽呼肠孤病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立 被引量：19
7
作者 童桂香 谢芝勋 +5 位作者 黄琦 文艳玲 谢丽基 庞耀珊 刘加波 邓显文 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2007年第9期767-771,共5页
为建立禽呼肠孤病毒（ARV）实时荧光定量RT-PCR检测方法，将PCR扩增的σC基因片段克隆到pGM-T载体，重组质粒经筛选、鉴定、SalⅠ单酶切，得到线性化转录模板DNA，将体外转录的RNA梯度稀释后作为阳性模板，用于标准曲线的制定。根据S1... 为建立禽呼肠孤病毒（ARV）实时荧光定量RT-PCR检测方法，将PCR扩增的σC基因片段克隆到pGM-T载体，重组质粒经筛选、鉴定、SalⅠ单酶切，得到线性化转录模板DNA，将体外转录的RNA梯度稀释后作为阳性模板，用于标准曲线的制定。根据S1基因σC结构蛋白基因保守区域序列设计了1对特异性引物，以体外转录的RNA作为标准品，应用SYBRGreenI染料法建立了检测ARV的一步法实时荧光定量RT-PCR方法。特异性、敏感性和重复性试验结果表明，制作的标准曲线定量浓度范围宽，比常规的RT-PCR敏感1×10^3倍，可检测到5．2×10^2个拷贝的标准品RNA，与NDV、IBDV、MG均不反应；从攻毒鸡的关节组织中可以检测到病毒，病毒含量为1×10^5～1×10^7个拷贝／μL.表明，建立的实时荧光定量RT-PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点，可用于ARV的检测。 展开更多
关键词 禽呼肠孤病毒 体外转录 SYBR Green I 荧光定量rt-pcr
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血浆miRNA-20a和miRNA-210对肺癌的诊断价值评价 被引量：17
8
作者 夏贤斌 李坚 汪毅 《江苏大学学报（医学版）》 CAS 2017年第1期47-52,共6页
目的:探讨血浆miRNA-20a和miRNA-210表达水平用于肺癌诊断的可行性及临床价值。方法:采用荧光定量PCR法检测58例肺癌患者和46例良性肺疾病患者血浆miRNA-20a和miRNA-210的表达。同时分析血浆miRNA-20a和miRNA-210表达水平与患者临床病... 目的:探讨血浆miRNA-20a和miRNA-210表达水平用于肺癌诊断的可行性及临床价值。方法:采用荧光定量PCR法检测58例肺癌患者和46例良性肺疾病患者血浆miRNA-20a和miRNA-210的表达。同时分析血浆miRNA-20a和miRNA-210表达水平与患者临床病理特征的相关性。构建受试者工作特征(ROC)曲线,评估这两类miRNA诊断肺癌的效能。根据ROC曲线确定这两类血浆miRNAs诊断肺癌的折点(临界值),计算敏感性、特异性等,并与经典的肿瘤标志物癌胚抗原、细胞角蛋白19(Cyfra21-1)的测定结果进行比较。结果:肺癌患者血浆中miRNA-20a和miRNA-210的表达水平均明显高于良性肺疾病对照组(P<0.01)。血浆miRNA-20a的表达与患者的临床病理特征无相关性,而血浆miRNA-210表达水平与肺癌的组织学类型、分化程度及临床分期显著相关(P=0.008、P=0.041和P=0.016)。血浆miRNA-20a和miRNA-210的ROC曲线下面积(AUC)分别为0.883(95%可信区间0.821~0.946)和0.824(95%可信区间0.745~0.904),高于癌胚抗原和Cyfra21-1的0.656(95%可信区间0.551~0.761)和0.754(95%可信区间0.658~0.847)。血浆miRNA-20a和miRNA-210诊断肺癌的敏感性(77.6%和75.9%)和准确性(81.7%和77.9%)高于癌胚抗原(44.8%和62.5%)和Cyfra21-1(56.9%和72.1%),这两种miRANs联合检测能进一步提高肺癌诊断的敏感性,但特异性略有下降。此外,两种miRANs联合癌胚抗原或Cyfra21-1能进一步提高对肺癌的诊断效能。结论:血浆miRNA-20a和miRNA-210有可能作为诊断肺癌的生物标志物。 展开更多
关键词 荧光定量pcr 肺癌 miRNA-20a miRNA-210 诊断
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葡萄SPL9和SPL10基因全长cDNA克隆、亚细胞定位和表达分析 被引量：12
9
作者 曹雪 王晨 +3 位作者 房经贵 杨光 于华平 宋长年 《园艺学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第2期240-250,共11页
从‘夏黑’葡萄(Vitisvinifera×V.labrusca ‘Summer Black’)中克隆了SBP(Squamosa promoter binding protein)类重要转录因子基因SPL9和SPL10全长cDNA序列,在GenBank的登录号分别是HM018600和HM018601,序列分析表明二者均具备完... 从‘夏黑’葡萄(Vitisvinifera×V.labrusca ‘Summer Black’)中克隆了SBP(Squamosa promoter binding protein)类重要转录因子基因SPL9和SPL10全长cDNA序列,在GenBank的登录号分别是HM018600和HM018601,序列分析表明二者均具备完全保守的核定位信号序列(KKSR)、SBP结构域以及葡萄microRNA156a(Vv-miR156a)的靶序列。进一步构建Vv-SPL9和Vv-SPL10亚细胞定位表达载体,对其是否具有核定位功能进行了研究,并利用半定量、荧光定量RT-PCR研究了这两个基因与Vv-miR156a在葡萄不同组织的表达情况。结果表明:转录因子SPL9和SPL10均定位于细胞核中,而且两个基因在葡萄各个组织中均有表达,但表达量存在差异,两者均在小果中的表达量最高。Vv-miR156a的积累水平与这两个基因在各个组织中的表达呈现一定的消长关系,并且在小果中最为明显。 展开更多
关键词 葡萄 SPL9 SPL10 亚细胞定位 荧光定量rt-pcr
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鸭坦布苏病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立 被引量：10
10
作者 李庆阳 陈芳艳 +6 位作者 刘平 谢永福 冯金牛 况少祥 陈瑞爱 唐秀英 王林川 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2012年第7期18-22,共5页
根据鸭坦布苏病毒(DTMUV)BYD-1株基因序列设计特异性引物和TaqMan探针,建立了快速检测DTMUV的实时荧光定量RT-PCR方法。特异性结果显示,DTMUV显示阳性,而3株非鸭坦布苏病毒均显示阴性,说明该方法具有高度特异性。其表达式为Ct=-3.32... 根据鸭坦布苏病毒(DTMUV)BYD-1株基因序列设计特异性引物和TaqMan探针,建立了快速检测DTMUV的实时荧光定量RT-PCR方法。特异性结果显示,DTMUV显示阳性,而3株非鸭坦布苏病毒均显示阴性,说明该方法具有高度特异性。其表达式为Ct=-3.32×lg Copy number+41.151,R2=0.998,R循环效率Eff%=100.072,DNA拷贝数在101～108范围内检测曲线有良好的线性关系,对质粒标准品最低检测限为1.0×101拷贝/μL,变异系数低于5%。利用该方法分别对攻毒感染具有典型鸭新型黄病毒病临床症状和病理变化的蛋鸭的脾脏和肝脏组织进行检测,阳性率均为100%,而用本实验室建立的普通RT-PCR方法检测的阳性检测率为85%(17/20)和75%(15/20)。建立的方法具有敏感性高、特异性好、稳定性强的特点,可用DTMUV早期感染的快速诊断和流行病学调查。 展开更多
关键词 鸭坦布苏病毒 TAQMAN探针 荧光定量rt—pcr
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荧光定量RT-PCR快速检测B型流感病毒的研究 被引量：8
11
作者 何建凡 张然 +2 位作者 吴春利 程小雯 吕星 《现代预防医学》 CAS 北大核心 2005年第8期981-983,共3页
目的:利用荧光定量RT-PCR技术建立一种快速检测B型流感病毒的方法。方法:根据B型流感病毒HA基因的相对保守序列分别设计一对引物及其相应的Taqman探针,建立、优化反应体系后,利用10倍稀释法检验方法的灵敏度并建立相对定量标准曲线;特... 目的:利用荧光定量RT-PCR技术建立一种快速检测B型流感病毒的方法。方法:根据B型流感病毒HA基因的相对保守序列分别设计一对引物及其相应的Taqman探针,建立、优化反应体系后,利用10倍稀释法检验方法的灵敏度并建立相对定量标准曲线;特异性检验后利用临床标本与普通RT-PCR法进行比较。结果:B型流感病毒检测反应的灵敏度为5.0×10-6TCID50,标准曲线相关系数为0.998,扩增效率为107.8%,5种非B型流感病毒病原体检测均为阴性,说明此方法具有很好的稳定性、重现性和特异性。结论:本研究建立荧光定量RT-PCR技术可以准确检测B型流感病毒,不仅灵敏度高、稳定性好,而且可以对病毒滴度进行定量检测。 展开更多
关键词 B型流感病毒 荧光定量rt-pcr 快速检测
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猪圆环病毒2型Taqman探针法实时荧光定量PCR检测方法的建立 被引量：9
12
作者 石林 吴瑗 +8 位作者 巴少波 刘正奎 陈琳 王磊 邵春艳 孙静 周莹姗 王晓杜 宋厚辉 《浙江农林大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第6期1133-1138,共6页
猪圆环病毒2型(PCV2)是一种引起仔猪Sus scrofa多系统衰竭综合征、免疫抑制、皮肤肾病综合征等疾病的病原体。根据GenBank中PCV2 ORF1基因序列设计合成特异性引物和探针,以PCV2基因组DNA为模板,通过聚合酶链式反应(PCR)扩增目的片段,并... 猪圆环病毒2型(PCV2)是一种引起仔猪Sus scrofa多系统衰竭综合征、免疫抑制、皮肤肾病综合征等疾病的病原体。根据GenBank中PCV2 ORF1基因序列设计合成特异性引物和探针,以PCV2基因组DNA为模板,通过聚合酶链式反应(PCR)扩增目的片段,并将目的片段克隆至pMD18-T载体,构建阳性标准品。以阳性标准品为模板,优化荧光定量PCR反应条件,建立标准曲线,进行灵敏性、重复性和特异性验证,并应用此方法对临床样品进行检测。结果表明:阳性质粒标准品构建成功,该检测方法的引物与探针的最佳浓度皆为0.2μmol·L^(-1),线性检测范围为2.1×10^(13)~2.1×10~6拷贝·L^(-1),最低检测限值为8.828×10~6拷贝·L^(-1),且与其他相关疾病无交叉反应;各批次检测变异系数低,检测方法稳定性好。本研究建立的敏感性高、特异性好的实时荧光定量PCR方法,为PCV2的快速检测提供了新工具。 展开更多
关键词 动物学 猪圆环病毒2型 实时荧光定量pcr 灵敏性 特异性 检测方法
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基于M基因的新城疫病毒实时荧光定量RT-PCR的建立及其对临床样品中新城疫病毒检测的研究 被引量：4
13
作者 曹军平 胡顺林 +5 位作者 吴双 刘慧谋 刘晓文 王晓泉 吴艳涛 刘秀梵 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第7期1120-1125,共6页
根据新城疫病毒M基因的保守序列，设计合成1对引物和TaqMan探针，以作者实验室构建并保存的鹅源新城疫病毒ZJ1株M基因阳性重组质粒为标准品模板建立荧光定量PCR标准曲线，结合ABI公司的7300型荧光定量PCR仪，建立了一种敏感、特异、重... 根据新城疫病毒M基因的保守序列，设计合成1对引物和TaqMan探针，以作者实验室构建并保存的鹅源新城疫病毒ZJ1株M基因阳性重组质粒为标准品模板建立荧光定量PCR标准曲线，结合ABI公司的7300型荧光定量PCR仪，建立了一种敏感、特异、重复性好的快速检测新城疫病毒核酸载量的TaqMan荧光定量RT-PCR方法。该方法在106~101拷贝范围内具有良好的线性关系，可检测到初始模板中3拷贝.μL-1的病毒核酸，与传统的病毒分离方法具有相近的敏感性，二者对500份临床禽泄殖腔棉拭样品检测结果阳性数？阴性数符合率分别为90.0%、99.8%。经临床应用表明：荧光定量PCR的建立为早期诊断禽新城疫病毒、定量分析禽新城疫病毒感染程度奠定了基础。 展开更多
关键词 新城疫病毒 荧光定量rt-pcr 探针
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牙鲆变态中两种HSP90基因的不同表达及其与甲状腺激素的关系 被引量：6
14
作者 张俊玲 施志仪 +1 位作者 程琦 贾亮 《水产学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第10期1478-1485,共8页
热休克蛋白90(heat shock protein90,HSP90)是细胞内主要的伴侣蛋白,在激素信号转导、细胞分化、细胞增殖与凋亡、形态发生与进化、变态发育及应激防御等多重调节路径中发挥关键作用。采用实时荧光定量RT-PCR技术检测了牙鲆两种HSP90基... 热休克蛋白90(heat shock protein90,HSP90)是细胞内主要的伴侣蛋白,在激素信号转导、细胞分化、细胞增殖与凋亡、形态发生与进化、变态发育及应激防御等多重调节路径中发挥关键作用。采用实时荧光定量RT-PCR技术检测了牙鲆两种HSP90基因在仔鱼发育和在成年组织中的表达变化。结果表明,HSP90α在成鱼骨骼肌、肠和胃中有较高的表达,而HSP90β在成鱼脑、脾脏和肾脏中有较高的表达。HSP90αmRNA水平在仔鱼变态期间迅速增加,至变态高峰G期达到最高水平;相反,HSP90β转录在仔鱼整个变态期间变化不是特别明显。鉴于甲状腺激素(thyroid hormone,TH)在牙鲆变态中的重要作用,还运用外源的TH及硫脲(thiourea,TU)处理牙鲆仔鱼来确定TH对HSP90基因转录的调节。与未处理组相比,HSP90α转录在TH处理8d和13d的仔鱼中显著增加,而在TU处理仔鱼中明显减少;但HSP90βmRNA水平不受药物处理影响。从上述结果分析,牙鲆中HSP90α的转录很可能被甲状腺激素上调,而且其在牙鲆的变态发育中发挥了重要作用。 展开更多
关键词 牙鲆 变态发育 热休克蛋白90 基因表达 甲状腺激素 硫脲 荧光定量rt-pcr
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甲型肝炎病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立及在贝类检测中的应用 被引量：6
15
作者 袁亚迪 孙世洋 +6 位作者 卞莲莲 崔博沛 高帆 刘佩 刘令九 毛群颖 梁争论 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2020年第1期55-60,65,共7页
目的建立甲型肝炎病毒(hepatitis A,HAV)荧光定量逆转录PCR(qRT-PCR)检测方法,用于贝类中HAV的检测。方法选择HAV高度保守的5’UTR区设计引物及探针,以HAV质粒为标准品,HAV活病毒为样本,建立HAV qRT-PCR检测方法;验证该方法的特异性、... 目的建立甲型肝炎病毒(hepatitis A,HAV)荧光定量逆转录PCR(qRT-PCR)检测方法,用于贝类中HAV的检测。方法选择HAV高度保守的5’UTR区设计引物及探针,以HAV质粒为标准品,HAV活病毒为样本,建立HAV qRT-PCR检测方法;验证该方法的特异性、灵敏度、重复性、准确性及中间精密度;采用建立的方法检测HAV活病毒和贝类样本,并与我国贝类HAV检测国标方法(GB/T22287-2008法)进行比较。结果通过14对引物探针分别对HAV质粒(101~108拷贝/μL)检测结果的比较,选择灵敏度最优的Pan1引物,建立了HAV qRT-PCR检测方法(PAN法)。PAN法对CVA16、CVB3、EVA71、PV等11种RNA病毒均无阳性扩增;灵敏度达10 TCID50/mL;检测2.699~5.699 LgTCID50/mL各浓度HAV活病毒的回收率为82.9%~127.0%,单人和双人检测的变异系数分别为3.0%~7.0%和2.6%~8.4%。PAN法检测HAV活病毒的灵敏度(10 TCID50/mL)优于GB/T22287-2008法;两种方法对20份贝类样本的检测结果均为阴性,符合率为100%。结论建立的PAN法具有良好的特异性、灵敏度、准确性、重复性和中间精密度,可用于贝类样本中HAV的核酸定量快速检测。 展开更多
关键词 甲型肝炎病毒 荧光定量rt-pcr 贝类
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多胎与单胎山羊发情期卵巢褪黑素受体基因的差异表达研究 被引量：6
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作者 汪运舟 曾启繁 +2 位作者 陈维云 王慧 王树迎 《中国农学通报》 CSCD 北大核心 2011年第3期262-267,共6页
为探明褪黑素受体(MTR1A)对山羊产羔数等繁殖性状的调控作用,并比较多胎高产的济宁青山羊与单胎的沂蒙黑山羊发情期卵巢组织中MTR1A的差异表达量。采用荧光定量差异显示PCR(DDRT-qPCR)技术,以持家基因GAPDH为分子内标,对比研究了褪黑素... 为探明褪黑素受体(MTR1A)对山羊产羔数等繁殖性状的调控作用,并比较多胎高产的济宁青山羊与单胎的沂蒙黑山羊发情期卵巢组织中MTR1A的差异表达量。采用荧光定量差异显示PCR(DDRT-qPCR)技术,以持家基因GAPDH为分子内标,对比研究了褪黑素受体1A(MTR1A)基因在多胎的济宁青山羊和单胎的沂蒙黑山羊发情期卵巢组织中的差异表达量。研究发现,MTR1A在两种山羊发情期的卵巢组织中均有表达,但是,在青山羊发情期卵巢组织中的表达量显著低于在沂蒙黑山羊卵巢组织中的表达量(P<0.05)。说明,发情期褪黑素受体基因在卵巢组织中的高表达是限制山羊卵巢排卵和产羔数的重要因素之一。研究结果提示:卵巢组织是褪黑素作用的重要靶器官,褪黑素对于山羊卵巢组织的发育、成熟和排卵具有重要影响。研究结果对于阐明褪黑素受体调控山羊生殖机能的作用机理提供了基础研究数据。 展开更多
关键词 济宁青山羊 沂蒙黑山羊 卵巢 褪黑素受体-1A 荧光定量差异显示pcr 发情期
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乳牛瘦蛋白基因荧光定量RT-PCR检测方法的建立 被引量：5
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作者 张才 牛淑玲 +2 位作者 夏成 刘国文 王哲 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2006年第5期393-395,共3页
根据GenBank中瘦蛋白(leptin)基因序列设计合成了引物和探针,对荧光定量PCR的方法进行了方法学的评估,建立了TaqmanMGB荧光定量RT-PCR检测方法。结果表明,由 pMD-18T瘦蛋白所构建的标准曲线线性关系良好,建立的瘦蛋白基因荧光定量PCR检... 根据GenBank中瘦蛋白(leptin)基因序列设计合成了引物和探针,对荧光定量PCR的方法进行了方法学的评估,建立了TaqmanMGB荧光定量RT-PCR检测方法。结果表明,由 pMD-18T瘦蛋白所构建的标准曲线线性关系良好,建立的瘦蛋白基因荧光定量PCR检测方法灵敏度高、特异性强(可检测出低于10个拷贝／μL的样品),准确可靠。 展开更多
关键词 乳牛 瘦蛋白基因 荧光定量rt-pcr
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新型鸭呼肠孤病毒一步法TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用 被引量：5
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作者 云涛 华炯钢 +3 位作者 叶伟成 倪征 陈柳 张存 《浙江农业学报》 CSCD 北大核心 2020年第4期571-576,共6页
为建立一种快速、敏感和特异性检测新型鸭呼肠孤病毒(novel duck reovirus,NDRV)的方法,本研究根据GenBank数据库中NDRV S3基因保守序列设计1对特异性引物和1条MGB荧光探针,建立了一种检测NDRV的一步法MGB荧光定量RT-PCR方法,对其特异... 为建立一种快速、敏感和特异性检测新型鸭呼肠孤病毒(novel duck reovirus,NDRV)的方法,本研究根据GenBank数据库中NDRV S3基因保守序列设计1对特异性引物和1条MGB荧光探针,建立了一种检测NDRV的一步法MGB荧光定量RT-PCR方法,对其特异性、敏感性和重复性进行检验,并与普通RT-PCR进行比较。结果显示,扩增标准曲线相关系数为0.999,扩增产物的熔解曲线仅出现单特异峰。该方法对经典鸭呼肠孤病毒、H9N2禽流感病毒、鸭坦布苏病毒、A型鸭肝炎病毒、鸭新城疫病毒、鸭瘟病毒及番鸭细小病毒均未检测到信号,对NDRV的最小检出量为10拷贝·μL^-1。组内和组间变异系数均小于2%,重复性好。此外,利用该方法对239份疑似新型呼肠孤病毒病样品进行检测,常规RT-PCR检测时有75份为阳性,一步法TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR方法检测时有100份为阳性,而且常规RT-PCR检测出的阳性样品用一步法TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR检测时均为阳性,符合率为100%。该检测方法的建立为NDRV早期快速检测及定量分析提供新的方法。 展开更多
关键词 新型鸭呼肠孤病毒 MGB探针 荧光定量rt-pcr 检测方法
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牛病毒性腹泻病毒实时定量RT-PCR检测技术的建立及初步应用 被引量：4
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作者 任艳 陈创夫 +5 位作者 乔军 王鹏雁 盛金良 王远志 张沾 李臻 《畜牧兽医杂志》 2010年第5期4-7,共4页
以牛病毒性腹泻病毒（BVDV）的保守基因5＇-非编码区为参考,设计、优化一对特异的荧光定量PCR引物,应用Smart CycleⅡ分析系统,结合Eva Green荧光染料结合原理,建立一种快速、定量检测牛病毒性腹泻病毒的荧光定量PCR技术。该方法线形范... 以牛病毒性腹泻病毒（BVDV）的保守基因5＇-非编码区为参考,设计、优化一对特异的荧光定量PCR引物,应用Smart CycleⅡ分析系统,结合Eva Green荧光染料结合原理,建立一种快速、定量检测牛病毒性腹泻病毒的荧光定量PCR技术。该方法线形范围为101~106copies/μL,相关系数为R2=0.997,扩增效率为E=0.78。灵敏性比常规PCR高102倍。该方法具有良好的特异性,检测变异系数低于1%。应用本实验建立的方法检测25份不同地区采集的临床症状疑似BVDV感染的牛粪样品,阳性检出率为72%（18/25）,与病毒分离培养和电检观察相比,该方法具有快速、灵敏、特异、重复性好和能定量检测等优点,为实验室快速、准确检测BVDV奠定了基础。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒 实时定量rt-pcr 检测
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应用实时荧光RT-PCR法检测水产品中诺如病毒 被引量：5
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作者 纪衍瑾 孙雯雯 +1 位作者 祝喆 杨松涛 《中国现代医生》 2015年第19期130-132,共3页
目的建立水产品样品中的诺如病毒检测方法。方法优化甘氨酸缓冲液处理水产品匀浆液,摸索PEG沉淀浓缩病毒的浓度,提取病毒RNA,采用荧光定量RT-PCR方法进行诺如病毒检测。结果应用优化后的方法检测72份样品,并用核苷酸序列测定法对阳性PC... 目的建立水产品样品中的诺如病毒检测方法。方法优化甘氨酸缓冲液处理水产品匀浆液,摸索PEG沉淀浓缩病毒的浓度,提取病毒RNA,采用荧光定量RT-PCR方法进行诺如病毒检测。结果应用优化后的方法检测72份样品,并用核苷酸序列测定法对阳性PCR产物进行验证,所得阳性PCR产物经核苷酸序列测序证实为诺如病毒。结论本研究方法可以应用于水产品中的诺如病毒检测,抚顺市海鲜市场上的水产品很少存在诺如病毒的污染。 展开更多
关键词 诺如病毒 水产品 富集 荧光定量rt-pcr
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