脱细胞真皮基质制备及其生物相容性研究 被引量：9

1

作者 綦惠 杰永生 +3 位作者 陈磊 江建 高新生 孙磊 《中国修复重建外科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2014年第6期768-772,共5页

目的制备脱细胞真皮基质,检测其细胞及组织相容性,探讨其作为软骨组织工程支架材料的可行性。方法取新生小牛背部真皮组织,以0.5%SDS溶液水平振荡脱细胞,0.5%胰蛋白酶行胶原纤维结构重塑,甲醛浸泡进行交联,0.5%硫酸软骨素溶液中超声振... 目的制备脱细胞真皮基质,检测其细胞及组织相容性,探讨其作为软骨组织工程支架材料的可行性。方法取新生小牛背部真皮组织,以0.5%SDS溶液水平振荡脱细胞,0.5%胰蛋白酶行胶原纤维结构重塑,甲醛浸泡进行交联,0.5%硫酸软骨素溶液中超声振荡进行表面修饰,制备脱细胞真皮基质支架材料。乙醇排除法检测结构重塑前后材料孔隙率变化;MTT法检测材料细胞毒性;将材料植入成年SD大鼠背部皮下,评价组织相容性。采用以3∶7比例共培养的第2代新西兰大白兔软骨细胞与骨髓基质细胞作为种子细胞,种植于脱细胞真皮基质支架材料(实验组),48 h后扫描电镜观察细胞黏附情况;RT-PCR和Western blot检测接种于支架的种子细胞Ⅱ型胶原mRNA和蛋白的表达,并与单纯培养的种子细胞(对照组)进行比较。结果经0.5%胰蛋白酶溶液结构重塑后的脱细胞真皮基质支架材料表面光滑、孔隙均匀;孔隙率达85.4%±2.8%,显著高于重塑前的支架(72.8%±5.8%)(t=—4.384,P=0.005);细胞毒性检测为1级,合格;埋植于大鼠背部皮下后,随时间延长,组织炎性细胞数呈减少趋势(P<0.05)。种子细胞接种后,扫描电镜示大量细胞贴附于支架上,细胞形态饱满,可见表面微绒毛和分泌现象。RT-PCR与Western blot检测结果示,实验组和对照组Ⅱ型胶原mRNA和蛋白表达量比较,差异均无统计学意义(t=1.265,P=0.235;t=0.935,P=0.372)。结论经脱细胞-结构重塑-交联-表面修饰制备的脱细胞真皮基质结构良好,种子细胞能大量黏附于支架材料上,细胞Ⅱ型胶原表达水平无明显改变,有望作为软骨组织工程支架材料。 展开更多

关键词 软骨组织工程 脱细胞真皮基质 支架材料 Ⅱ型胶原

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脂肪干细胞复合真皮脱细胞基质修复兔关节软骨缺损的实验研究 被引量：7

2

作者 舒雄 郑蕊 +4 位作者 杰永生 陈磊 靳少锋 綦惠 孙磊 《中国医药生物技术》 2017年第2期143-148,共6页

目的探讨脂肪间充质干细胞(ADSCs)复合小牛真皮脱细胞基质(ADM)参与修复兔膝关节软骨缺损的可行性。方法取自体新西兰兔的脂肪组织,采用酶消化分离培养ADSCs并传代,倒置相差显微镜观察细胞形态,FACS检测细胞表面特异性表达以鉴定细胞,... 目的探讨脂肪间充质干细胞(ADSCs)复合小牛真皮脱细胞基质(ADM)参与修复兔膝关节软骨缺损的可行性。方法取自体新西兰兔的脂肪组织,采用酶消化分离培养ADSCs并传代,倒置相差显微镜观察细胞形态,FACS检测细胞表面特异性表达以鉴定细胞,行成脂和成骨诱导鉴定。小牛真皮通过脱细胞、交联和冻干制备小牛ADM,ADSCs达到一定数量后接种于ADM得到细胞支架复合物。24只新西兰大白兔随机分A、B、C共三组,A组关节软骨缺损处外科缝合细胞支架复合物,B组软骨缺损处外科缝合ADM,C组软骨缺损不做任何处理。分别于术后第12周处死动物,修复处行大体、组织学检测。结果成功分离鉴定新西兰兔的脂肪干细胞。经重塑后真皮脱细胞基质支架材料表面光滑、孔隙均匀。ADSCs与ADM复合后,缺损处类软骨组织填充,修复区表面光滑;Ⅱ型胶原免疫组化显示,复合支架已被吸收,再生的软骨是阳性。结论新型小牛ADM支架材料与ADSCs生物相容性好,ADSCs与ADM复合向软骨诱导后可良好地修复关节软骨缺损,具有替代正常软骨的潜力。 展开更多

关键词 脂肪干细胞 真皮脱细胞基质 支架 关节软骨 组织工程

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复合胶原海绵材料的体内外止血效果 被引量：7

3

作者 靳少锋 綦惠 +4 位作者 舒雄 杰永生 郑蕊 陈磊 孙磊 《中国组织工程研究》 CAS 北大核心 2018年第2期216-221,共6页

背景:胶原材料具有良好的止血效果,但是单一胶原止血材料的吸水能力有限,血液浓缩效果不佳,所以止血效率并不理想。目的:观察复合胶原海绵止血材料的体内外止血效果。方法:以胶原、透明质酸和氯化钙为原料、碳化二酰亚胺为交联剂,制备... 背景:胶原材料具有良好的止血效果,但是单一胶原止血材料的吸水能力有限,血液浓缩效果不佳,所以止血效率并不理想。目的:观察复合胶原海绵止血材料的体内外止血效果。方法:以胶原、透明质酸和氯化钙为原料、碳化二酰亚胺为交联剂,制备复合胶原海绵止血材料。(1)细胞毒性实验:分别以复合胶原海绵止血材料浸提液、苯酚溶液及细胞培养液培养L929小鼠成纤维细胞,培养第2,4,7天,MTT法检测细胞增殖,判定材料毒性;(2)材料与全血的关系:将兔抗凝血分别滴于复合胶原海绵止血材料、进口止血材料及国产止血材料表面,扫描电镜观察材料与全血的关系;(3)体外凝血活性:将兔抗凝血分别滴于复合胶原海绵止血材料、进口止血材料及国产止血材料表面,采用凝血指数检测凝血效果;(4)体内止血效果:钻透18只兔肝叶,随机分3组,分别以复合胶原海绵止血材料、进口止血材料及国产止血材料止血,检测出血时间及出血量。结果与结论:(1)复合胶原海绵材料的细胞毒性为1级,合格;(2)与进口和国产止血材料相比较,复合胶原海绵止血材料既有利于血液中水分继续向纵深吸收又能同时网络血红蛋白、血小板等形成凝血块,还可看到孔隙交替向内部延伸,形成交替复杂的海绵状;(3)复合胶原海绵止血材料的凝血指数显著低于进口、国产止血材料(P<0.05);(4)复合胶原海绵止血材料组的出血时间及出血量明显低于进口止血材料组、国产止血材料组(P<0.05);(5)结果表明,复合胶原海绵止血材料具有的良好止血效果及生物相容性。 展开更多

关键词 透明质酸 胶原 止血 组织工程

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HSP90α和HSP90β蛋白在人骨肉瘤组织中的表达及临床意义 被引量：6

4

作者 舒雄 孙晓淇 +3 位作者 杰永生 郑蕊 刘辉琦 冉宇靓 《现代肿瘤医学》 CAS 2019年第16期2823-2826,共4页

目的:探讨热休克蛋白HSP90α和HSP90β在骨肉瘤中的表达及意义。方法:采用免疫组化法检测90例骨肉瘤组织和21例癌旁组织中HSP90α和HSP90β的表达,并分析其与骨肉瘤临床病理特征的关系。结果:在骨肉瘤组织中,HSP90α和HSP90β的阳性表... 目的:探讨热休克蛋白HSP90α和HSP90β在骨肉瘤中的表达及意义。方法:采用免疫组化法检测90例骨肉瘤组织和21例癌旁组织中HSP90α和HSP90β的表达,并分析其与骨肉瘤临床病理特征的关系。结果:在骨肉瘤组织中,HSP90α和HSP90β的阳性表达率分别为57.78%和77.78%,均显著高于癌旁组织(P<0.05)。HSP90α高表达与骨肉瘤Enneking外科分期相关(P<0.05),而与患者性别、年龄、肿瘤位置无关(P>0.05)。HSP90β高表达与骨肉瘤Enneking外科分期相关(P<0.05),而与患者年龄、性别、肿瘤位置无关(P>0.05)。Spearman相关性分析显示,HSP90α和HSP90β在骨肉瘤中协同表达(r=0.247,P<0.05)。结论:HSP90α和HSP90β在骨肉瘤组织中共同表达上调,可能作为骨肿瘤潜在的诊断和治疗靶点。 展开更多

关键词 骨肉瘤 HSP90Α HSP90β

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放散式体外冲击波对软骨细胞生物学行为的影响 被引量：6

5

作者 綦惠 杰永生 +4 位作者 郑蕊 舒雄 郭安忆 王山 刘亚军 《北京生物医学工程》 2020年第3期278-284,共7页

目的放散式体外冲击波(radial extracorporeal shock wave,rESW)能够促进软骨缺损和骨关节炎(osteoarthritis,OA)软骨损伤的修复,但具体机制仍需进一步探讨。本研究以软骨细胞为研究对象,分析rESW对软骨细胞生物学行为的影响及相关机制,... 目的放散式体外冲击波(radial extracorporeal shock wave,rESW)能够促进软骨缺损和骨关节炎(osteoarthritis,OA)软骨损伤的修复,但具体机制仍需进一步探讨。本研究以软骨细胞为研究对象,分析rESW对软骨细胞生物学行为的影响及相关机制,为rESW的临床应用奠定研究基础。方法采用胶原酶联合胰蛋白酶消化的方法获取大鼠软骨细胞,通过甲苯胺蓝染色对软骨细胞进行鉴定。分别在正常培养条件以及IL-1β介导的炎性条件下,给予不同能量的rESW刺激,采用CCK8法和划痕法分别检测软骨细胞的增殖和迁移。通过对软骨细胞培养上清中一氧化氮(nitric oxide,NO)的Griess法测定,检测rESW对软骨细胞NO分泌的影响。Western blot分析软骨细胞诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)的蛋白表达。结果正常环境下,rESW对软骨细胞的增殖、迁移和NO分泌均未有显著影响。IL-1β存在的炎性环境下,软骨细胞增殖和迁移受到显著抑制,rESW应用后,软骨细胞增殖能力有明显恢复,但迁移未受影响。炎性环境下,软骨细胞NO生成显著升高,且iNOS蛋白表达上调,rESW抑制NO的分泌和iNOS蛋白的表达。结论炎性环境下,rESW能够保护软骨细胞的增殖功能,且抑制软骨细胞分泌前炎症因子NO,改善关节腔微环境,因此rESW能够作为一种辅助手段应用于关节软骨损伤的治疗。 展开更多

关键词 放散式体外冲击波 骨关节炎 软骨细胞 一氧化氮 生物学行为

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用复合表面活性剂制备更安全的异种骨移植材料(英文) 被引量：4

6

作者 陈磊 孙磊 +4 位作者 陶剑峰 江健 高新生 杰永生 田伟 《中国组织工程研究与临床康复》 CAS CSCD 北大核心 2010年第8期1499-1503,共5页

背景:表面活性剂脱细胞的效果和骨移植材料的生物安全性与表面活性剂的选择有较大关系。因此,实验采用新型的复合表面活性剂制备脱细胞骨移植材料。目的:应用新型表面活性剂处理生物源性骨组织,并进行脱细胞效果及生物安全性评价,以期... 背景:表面活性剂脱细胞的效果和骨移植材料的生物安全性与表面活性剂的选择有较大关系。因此,实验采用新型的复合表面活性剂制备脱细胞骨移植材料。目的:应用新型表面活性剂处理生物源性骨组织,并进行脱细胞效果及生物安全性评价,以期得到一种更安全、可靠的骨植入材料。方法:2种阴离子表面活性剂十二烷基苯磺酸钠和脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠以及蒸馏水以质量比13∶7∶80的比例配制复合表面活性剂。以新鲜的牛松质骨为原料,复合表面活性剂脱脂脱细胞两步法工艺,制备新型生物源性骨植入材料。结果与结论:复合表面活性剂生物源性骨颜色呈乳白色,未见杂质,组织学及超微结构观察可见骨陷窝内细胞结构消失,骨小管空虚,胶原纤维排列整齐。生物安全性实验表明:按GB/T16886.11-1997标准急性全身毒性试验合格,溶血试验<5%,细胞毒性试验0级。复合表面活性剂生物源性骨组织中表面活性剂的残留量低于0.1g/L。骨长期植入实验表明:植入材料与宿主骨融合良好,24周后被机体完全吸收。说明复合表面活性剂处理的生物源性骨移植材料具有良好的生物相容性和生物降解性,是一种安全、可靠的骨植入材料。 展开更多

关键词 脱细胞 表面活性剂 骨移植 骨移植材料

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无细胞支架修复家兔关节软骨缺损的实验研究 被引量：5

7

作者 綦惠 杰永生 +3 位作者 陈磊 李清海 高新生 孙磊 《中国矫形外科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2015年第14期1303-1309,共7页

[目的]探讨无细胞的软骨修复支架对动物模型关节软骨损伤的修复效果,及其临床应用的可能性和优势。[方法]成年新西兰大白兔构建软骨缺损动物模型。A组为空白对照组,仅做缺损手术;B组为无细胞支架组,植入不含细胞的支架;C组为负载细胞的... [目的]探讨无细胞的软骨修复支架对动物模型关节软骨损伤的修复效果,及其临床应用的可能性和优势。[方法]成年新西兰大白兔构建软骨缺损动物模型。A组为空白对照组,仅做缺损手术;B组为无细胞支架组,植入不含细胞的支架;C组为负载细胞的支架组,植入负载种子细胞的支架。术后6、12周取材,体视显微镜观察、HE染色和甲苯胺蓝染色观察。术后12周的标本参考国际软骨修复协会组织学评分(International Cartilage Repair Society Histological Scoring,ICRS)标准评分,并对修复后新生组织力学性能进行检测。[结果]体视显微镜观察显示:A组,缺损周边仅有少量修复。B、C组,修复平面略低于周边正常组织,关节面较光滑,修复组织与周围软骨整合较好。HE染色与甲苯胺蓝染色显示:A组,缺损区域主要为纤维组织。B、C组,缺损区域中有大量软骨样组织生成。B、C两组评分的差别无统计学意义(P>0.05),但两组的评分均显著高于A组(P<0.05)。生物力学检测结果显示,正常软骨组织压缩模量为(0.61±0.06)MPa,A、B、C三组压缩模量分别为(0.08±0.05)MPa、(0.16±0.06)MPa、(0.22±0.06)MPa。与A组相比,B组与C组的压缩模量均有显著改善,但与正常软骨组织相比仍有明显降低(P<0.05)。[结论]单纯支架植入与支架负载细胞共同植入,对关节软骨的修复效果无显著性差异,提示负载细胞并未对软骨修复效果有明显的改善。因此,本研究基于无需细胞种植的软骨再生技术理念,使用无细胞支架修复关节软骨损伤/缺损,有可能作为一种更为简便的再生医学方法在软骨损伤、缺损的治疗中发挥重要作用。 展开更多

关键词 软骨损伤、缺损 支架 再生医学

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兔软骨细胞与骨髓基质细胞的平面共培养：两者培养比例筛选 被引量：4

8

作者 孙磊 綦惠 +6 位作者 陈磊 陈海燕 江健 陶剑锋 杰永生 高新生 Peter I.Lelkes 《中国组织工程研究与临床康复》 CAS CSCD 北大核心 2010年第27期4955-4959,共5页

背景：骨髓基质细胞一定条件下可以分化为软骨细胞,但目前还缺少将软骨与骨髓基质细胞平面共培养的深入探讨。目的：拟明确骨髓基质细胞与软骨细胞共培养时比例的选择、细胞增殖活性、软骨特异性蛋白表达的规律,用于细胞移植的最佳时间... 背景：骨髓基质细胞一定条件下可以分化为软骨细胞,但目前还缺少将软骨与骨髓基质细胞平面共培养的深入探讨。目的：拟明确骨髓基质细胞与软骨细胞共培养时比例的选择、细胞增殖活性、软骨特异性蛋白表达的规律,用于细胞移植的最佳时间和传代次数。方法：软骨细胞与骨髓基质细胞的分离培养,传代后分为5组：单纯软骨细胞组;共培养组,软骨细胞与骨髓基质细胞7：3,5：5,3：7组;以及单纯骨髓基质细胞组。传代至第4代（G4）,倒置相差显微镜观察各组细胞在不同传代时期的细胞形态,MTT实验检测细胞增殖活性,甲苯胺蓝与阿利新蓝染色,细胞免疫化学法检测Ⅱ型胶原的表达。结果与结论：共培养各组在各个时期细胞表型正常。G1-G3代细胞增殖活跃,G4代细胞增殖能力下降。共培养各组甲苯胺蓝与阿利新蓝染色以及Ⅱ型胶原表达在G2和G3代均较高。综合各指标认为,以软骨细胞与骨髓基质细胞的比例为5：5,3：7组为最佳。软骨细胞与骨髓基质细胞平面共培养,保持了软骨细胞的形态和蛋白表达特性,如进行细胞移植,选取软骨细胞与骨髓基质细胞5：5或3：7的比例为最佳。 展开更多

关键词 软骨细胞 骨髓基质细胞 共培养 蛋白聚糖 Ⅱ型胶原

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干细胞外泌体对骨质疏松大鼠骨生成的影响 被引量：4

9

作者 綦惠 黄霸 +4 位作者 杰永生 郑蕊 舒雄 陈磊 刘丹平 《中国矫形外科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2021年第8期726-730,共5页

[目的]探讨间充质干细胞源性外泌体对骨质疏松大鼠骨生成的调节作用。[方法]体外获取和鉴定大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)以及BMSCs源性外泌体(exosomes derived from BMSCs,BMSC-Exos)。采用CCK8法... [目的]探讨间充质干细胞源性外泌体对骨质疏松大鼠骨生成的调节作用。[方法]体外获取和鉴定大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)以及BMSCs源性外泌体(exosomes derived from BMSCs,BMSC-Exos)。采用CCK8法检测BMSC-Exos对BMSCs增殖的影响,碱性磷酸酶活性分析BMSC-Exos对BMSCs成骨转化的作用。成年雌性SD大鼠随机分成三组,OVX组与OVX+Exos组行双侧卵巢切除术,前者尾静脉注射PBS,后者尾静脉注射BMSC-Exos;而Control组为假手术组,仅切开背部皮肤后缝合,术后不给予任何药物。术后取股骨进行HE染色和Micro-CT观察。[结果]BMSCs具有成骨、成脂和成软骨分化能力。BMSC-Exos呈近似圆形,表达CD63、CD81和CD9。体外实验部分,BMSC-Exos与BMSCs共培养24 h和48 h,BMSCs增殖显著增强(P<0.05)。成骨诱导7 d后,BMSC-Exos组碱性磷酸酶活性明显上调。体内实验部分,OVX组骨密度(bone mineral density,BMD)下降(P<0.05),骨小梁稀疏,变细,间隙增大,注射BMSC-Exos后,BMD显著升高(P<0.05),骨小梁增粗,数量增多。[结论]BMSC-Exos能够促进骨生成,对骨质疏松具有一定程度的治疗作用。 展开更多

关键词 间充质干细胞 外泌体 骨质疏松

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脱细胞真皮基质/生物矿化胶原一体化骨软骨支架的制备及其生物相容性的研究 被引量：4

10

作者 郑蕊 杰永生 +4 位作者 陈磊 靳少锋 綦惠 孙磊 舒雄 《中国医药生物技术》 2019年第2期121-126,共6页

目的成功制备脱细胞真皮基质/生物矿化胶原一体化骨软骨支架,并进行理化性质、生物力学与生物相容性评估,为骨软骨缺损修复提供理论依据。方法以物理和化学方法制备牛源脱细胞真皮基质,利用磷酸三钙和胶原,按照不同比例混合,利用自组装... 目的成功制备脱细胞真皮基质/生物矿化胶原一体化骨软骨支架,并进行理化性质、生物力学与生物相容性评估,为骨软骨缺损修复提供理论依据。方法以物理和化学方法制备牛源脱细胞真皮基质,利用磷酸三钙和胶原,按照不同比例混合,利用自组装和冻干技术,制备以脱细胞真皮基质支架为软骨层,生物矿化胶原为骨层的骨软骨一体化双相支架。通过大体观察、扫描电镜观察、生物力学等检测,对骨软骨一体化支架进行理化性质和力学性能评价。原代培养小鼠软骨细胞和成骨细胞,并分别种植在脱细胞真皮基质和生物矿化胶原双相支架上,利用细胞毒、死/活细胞染色和增殖实验等观察细胞生长情况,测定骨软骨一体化支架的生物相容性。结果大体观察表明支架各层间结合紧密,未出现明显不连续和相互分离。扫描电镜各层内的孔隙结构相互连通且均具有立体多维性,其中脱细胞真皮基质、生物矿化胶原和双相支架的孔径分别为(121.6±8.65)、(98.40±5.56)和(103.2±3.94)μm。同时三组支架的压缩模量分别为(41.05±11.69)、(108.0±12.71)和(84.98±8.51)k Pa,弹性模量分别为(17.24±3.93)、(28.98±3.31)和(21.74±2.92)k Pa。MTT法表明骨软骨一体化支架无细胞毒性。荧光显微镜观察显示,纵切的支架薄片上细胞生长分布均匀,表明支架生物相容性较好,CCK8实验表明支架可以维持良好的细胞活性。结论脱细胞真皮基质/生物矿化胶原骨双相支架中上下层间的理化性能展示了骨软骨组织结构和力学方面的双重仿生,为动物体内实验奠定了基础,有望成为治疗骨软骨缺损修复的一种新手段。 展开更多

关键词 脱细胞真皮基质 生物矿化胶原 双相支架 骨软骨

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两种交联剂制备软骨细胞移植支架的比较 被引量：4

11

作者 綦惠 杰永生 +3 位作者 陈磊 陶建峰 江建 孙磊 《中国医药生物技术》 2013年第6期408-413,共6页

目的试用两种交联剂对小牛真皮基质来源的支架材料进行交联,比较支架的细胞毒性、结构、生物相容性和细胞贴附的差异,为在体动物试验提供实验依据。方法将脱细胞真皮基质分为两组,分别浸入0.05%戊二醛溶液和0.2%水溶性交联剂进行交联,MT... 目的试用两种交联剂对小牛真皮基质来源的支架材料进行交联,比较支架的细胞毒性、结构、生物相容性和细胞贴附的差异,为在体动物试验提供实验依据。方法将脱细胞真皮基质分为两组,分别浸入0.05%戊二醛溶液和0.2%水溶性交联剂进行交联,MTT法检测细胞毒性和溶血率。将交联后的支架分别植入大鼠皮下,评价生物相容性。以排液法粗测孔隙率,并在电镜下观察支架的结构和孔隙大小。培养间充质干细胞并贴附于两种方法处理的材料表面,电镜下观察贴附情况。结果以戊二醛溶液和水溶性交联剂两种方法处理的支架细胞毒性检测均合格,溶血率分别为4.61%与2.97%,均符合国家标准。经戊二醛交联的支架生物相容性差,炎症反应始终存在,水溶性交联剂处理的真皮基质组织相容性较好,仅有轻微的炎症反应。水溶性交联剂制备的支架材料孔隙率为84.3%±5.0%,戊二醛制备的支架材料孔隙率为79.7%±10.8%,差异不具有统计学意义(P>0.05)。戊二醛交联的支架细胞贴附差,而水溶性交联剂制备的支架细胞贴附良好。结论应用水溶性交联剂处理的支架细胞毒性和溶血率检测均合格,具有良好的生物相容性、孔隙率和细胞贴附性,该法可以作为后期制备软骨细胞移植支架的交联方法。 展开更多

关键词 交联试剂 支架 材料实验 细胞毒性

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脱蛋白联合冷冻干燥法制备异种骨的实验研究 被引量：3

12

作者 杰永生 綦惠 +2 位作者 陈磊 高新生 孙磊 《中国医药生物技术》 2013年第5期331-335,共5页

目的通过脱蛋白联合冷冻干燥的方法制备异种骨，探讨其能否在保持其生物力学特性的同时良好地消除异种骨的抗原性，以满足骨移植的需求。方法取牛股骨上端去除表面筋膜、结缔组织和皮质骨部分，制备成骨粒和圆柱形骨棒。将十二烷基苯磺... 目的通过脱蛋白联合冷冻干燥的方法制备异种骨，探讨其能否在保持其生物力学特性的同时良好地消除异种骨的抗原性，以满足骨移植的需求。方法取牛股骨上端去除表面筋膜、结缔组织和皮质骨部分，制备成骨粒和圆柱形骨棒。将十二烷基苯磺酸钠（ABS）和脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠（AES）以及蒸馏水以重量比13：7：80的比例配制复合表面活性剂。将牛骨粒或者骨棒与复合表面活性剂以重量比1：10的比例置于烧瓶中，超声振荡清洗，去除其抗原性，电镜下观察其结构。骨粒和骨棒经乙醇和乙醚脱水、脱脂，冷冻干燥。骨粒用作溶血试验和细胞毒性检测，骨棒进行新西兰大白兔的长期骨植入实验（4、12、26、52周）检测其生物相容性。乙醇抽吸法检测脱蛋白．冻干骨与未脱蛋白的单纯冻干骨的孔隙率。并且比较牛松质骨骨粒与脱蛋白．冻干松质骨骨粒的生物力学特性差异。结果电镜下观察，制备的异种骨材料为天然多孔结构，保留了骨组织的三维结构，骨小梁间有200～650I．tm骨髓腔。溶血率检测未超过5％，判定溶血率合格。细胞毒性检测为1级，极低细胞毒性，材料合格。长期骨植入实验表明，植入4周即有植入的骨棒与兔自身骨出现融合，未见严重炎症反应；52周时，植入骨已完全吸收。孔隙率检测表明，脱蛋白．冻干骨与未脱蛋白的单纯冻干骨相比无显著性差异，均可达到60％以上，符合骨移植材料的要求。脱蛋白．冻干骨以及未脱蛋白的单纯冻干骨的力学特性与新鲜松质骨块相比均有显著降低，但两者之间无显著性差异。结论通过脱蛋白联合冷冻干燥的方法制备的异种骨，能够在保持其生物力学特性的同时良好地消除抗原性：满足骨移植的需求。 展开更多

关键词 移植 异种 冷冻干燥法 生物相容性材料

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应用小牛皮制备软骨修复载体的脱毛-脱细胞-结构改建工艺探讨 被引量：3

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作者 綦惠 孙磊 +3 位作者 陈磊 江建 杰永生 高新生 《中国矫形外科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2014年第2期151-157,共7页

[目的]软骨修复载体的制备是软骨组织工程的重要课题。本实验以小牛皮为原料,通过脱毛-脱细胞-结构改建的早期工艺探讨,掌握最佳制备流程,为后续工艺做准备。[方法]将小牛皮分别浸入0.5%dispase溶液和0.25%胰蛋白酶溶液,4℃脱毛72 h,比... [目的]软骨修复载体的制备是软骨组织工程的重要课题。本实验以小牛皮为原料,通过脱毛-脱细胞-结构改建的早期工艺探讨,掌握最佳制备流程,为后续工艺做准备。[方法]将小牛皮分别浸入0.5%dispase溶液和0.25%胰蛋白酶溶液,4℃脱毛72 h,比较脱毛效果。乙酸溶胀,刮除/切除表皮和皮下组织,获得真皮组织。真皮组织分别浸入0.5%SDS、1%SDS与0.5%TritonX-100进行脱细胞,充分冲洗之后冻干,HE染色比较脱细胞效果,MTT法进行细胞毒性检测。应用0.25%胰蛋白酶浸泡、0.25%胰蛋白酶浸泡联合220 V-250 W-40%功率超声振荡、0.5%胰蛋白酶浸泡、0.5%胰蛋白酶浸泡联合220 V-250 W-40%功率超声振荡四种方法进行结构改建,扫描电镜观察、MASSON染色、孔隙率检测比较结构改建效果。[结果]0.5%dispase溶液和0.25%胰蛋白酶溶液均能够良好的去除小牛皮的毛发。0.5%SDS、1%SDS脱细胞效果基本一致,TritonX-100似有将胶原纤维破坏的征兆,由于低浓度SDS更易于冲洗,后续实验采用0.5%SDS脱细胞。细胞毒性检测为0级。0.5%胰蛋白酶浸泡联合220 V-250 W-40%功率超声是最佳的结构改建方法,改建后的载体胶原纤维光滑、立体感明显增强,孔隙率显著高于未改建的载体(P<0.05)。[结论]0.25%胰蛋白酶溶液脱毛-0.5%SDS脱细胞-0.5%胰蛋白酶浸泡联合220 V-250 W-40%功率超声进行结构改建,是应用小牛皮制备软骨修复载体的最佳工艺。 展开更多

关键词 脱毛 脱细胞 结构改建 孔隙率

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丝素蛋白-胶原骨软骨多孔支架的制备及对其生物相容性的检测

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作者 陈磊 郑蕊 +2 位作者 杰永生 綦惠 舒雄 《骨科临床与研究杂志》 2023年第5期276-280,共5页

目的制备丝蛋白-胶原骨软骨细胞支架并评价其生物相容性。方法利用透析和差速离心等物理方法以及三元法等化学方法制备丝素蛋白水溶液;利用乙酸法和酶降解法制备胶原蛋白水溶液;利用灌注和冷冻干燥等方法分别制备丝素蛋白支架、胶原支... 目的制备丝蛋白-胶原骨软骨细胞支架并评价其生物相容性。方法利用透析和差速离心等物理方法以及三元法等化学方法制备丝素蛋白水溶液;利用乙酸法和酶降解法制备胶原蛋白水溶液;利用灌注和冷冻干燥等方法分别制备丝素蛋白支架、胶原支架和丝素蛋白-胶原支架等3种不同的细胞支架。通过大体观察、扫描电镜观察和生物力学检测等方法,对丝素蛋白-胶原细胞支架的物理化学性质和力学性能进行评价。原代培养小鼠软骨细胞,并将软骨细胞分别种植于上述3种支架,通过对支架材料的细胞毒和死(活)细胞进行检测,评价细胞生长情况,测定支架的生物相容性。采用噻唑蓝(MTT)法检测支架的细胞毒性;应用荧光显微镜观察支架中细胞的生长状况。结果大体观察见支架内孔隙结构相互连通且均具有立体多维性。胶原支架、丝素蛋白支架和丝素蛋白-胶原支架内的孔径分别为(121.6±8.7)、(98.4±5.6)和(103.2±3.9)μm,压缩模量分别为(67.6±2.9)、(140.7±2.5)和(94.3±5.2)kPa,弹性模量分别为(13.3±1.6)、(29.9±2.2)和(22.9±3.0)kPa。丝素蛋白-胶原支架无细胞毒性;支架纵切薄片上细胞生长分布均匀,表明支架具有好的生物相容性。结论丝素蛋白-胶原骨软骨多孔支架的制备可行;该支架具有较好的生物力学特性和良好的生物相容性,可促进软骨细胞的增殖。 展开更多

关键词 丝素蛋白 胶原 组织支架 生物相容性材料 材料试验 组织工程

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骨肉瘤干细胞功能性单抗9B8靶向骨肉瘤的实验研究

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作者 马晓雯 陈磊 +3 位作者 郑蕊 杰永生 綦惠 舒雄 《中国医药生物技术》 2023年第4期298-303,共6页

目的探讨靶向骨肉瘤干细胞单抗9B8的生物学特征及其联合顺铂治疗骨肉瘤的疗效。方法细胞免疫荧光法检测单抗9B8识别的抗原蛋白与骨肉瘤干细胞表明标志物(CD133)在骨肉瘤MG-63细胞中的表达情况。流式细胞术分选出的9B8^(+)细胞检测其自... 目的探讨靶向骨肉瘤干细胞单抗9B8的生物学特征及其联合顺铂治疗骨肉瘤的疗效。方法细胞免疫荧光法检测单抗9B8识别的抗原蛋白与骨肉瘤干细胞表明标志物(CD133)在骨肉瘤MG-63细胞中的表达情况。流式细胞术分选出的9B8^(+)细胞检测其自我更新、侵袭和耐药能力。CCK8法检测单抗9B8对MG-63细胞自我更新和顺铂耐药能力的影响。裸鼠体内治疗实验分析单抗9B8联合顺铂对MG-63细胞移植瘤生长的抑制作用。结果免疫荧光显示单抗9B8识别的抗原分子与CD133在MG-63上共定位。9B8^(+)细胞无血清成球、侵袭能力和耐药性高于9B8-细胞。9B8^(+)细胞和9B8-细胞的IC50分别为0.9133和0.4012μmol/L。单抗9B8对MG-63的成球抑制率为55.6%。经单抗9B8处理后的MG-63,耐药能力明显下降,其IC50为0.2191μmol/L。单抗9B8体内治疗结果表明40、10、2.5 mg/kg的9B8组的抑制率分别为80.1%、54.2%和43.9%,40 mg/kg 9B8联合顺铂组抑制率为90.1%,顺铂组抑制率为48.6%。结论单抗9B8是抗骨肉瘤干细胞的功能性单抗。 展开更多

关键词 骨肉瘤干细胞 单克隆抗体 顺铂 CD133

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流式细胞仪检测人类白细胞抗原-B27与微量细胞毒法的比较 被引量：2

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作者 褚为靖 张会英 +2 位作者 高新生 葛艳玲 杰永生 《中华检验医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第5期520-522,共3页

人类白细胞抗原-B27（human leucocyte antigen，HIL-B27）是HLA-I类分子基因中B位点上的1个等位基因，是经典的HIA位点编码的I类主要组织相容性复合物基因产物之一。表达在细胞表面的I类分子是由HIL编码的重链、B2微球蛋白和内源性多... 人类白细胞抗原-B27（human leucocyte antigen，HIL-B27）是HLA-I类分子基因中B位点上的1个等位基因，是经典的HIA位点编码的I类主要组织相容性复合物基因产物之一。表达在细胞表面的I类分子是由HIL编码的重链、B2微球蛋白和内源性多肽形成的稳定的三聚体复合物，其相对分子质量为44000。现已证实HIL-B27有11个亚类，其中HIL-B2705是大多数非亚洲人群的主要亚类，而HIL-B2704则是中国人和许多其他亚洲人群最多见的亚类。该基因与多种疾病有相关性，与强直性脊柱炎（ankylosing spoildylitis，AS）相关性最高。 展开更多

关键词 人类白细胞抗原 流式细胞仪检测 微量细胞毒法 组织相容性复合物 相对分子质量 强直性脊柱炎 等位基因 亚洲人群

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放散式冲击波治疗双侧卵巢切除大鼠晚期骨质疏松症的实验研究 被引量：1

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作者 杰永生 郭安忆 +4 位作者 綦惠 郑蕊 梁震 景金珠 刘亚军 《北京生物医学工程》 2022年第3期275-279,306,共6页

目的探讨放散式冲击波在治疗晚期骨质疏松症(osteoporosis,OP)中的角色,为临床应用奠定实验基础。方法将大鼠随机分成3组:Sham组,仅暴露卵巢,不进行切除;OP组,采用双侧卵巢切除术建立大鼠OP模型,不进行治疗;OP+冲击波治疗组,采用双侧卵... 目的探讨放散式冲击波在治疗晚期骨质疏松症(osteoporosis,OP)中的角色,为临床应用奠定实验基础。方法将大鼠随机分成3组:Sham组,仅暴露卵巢,不进行切除;OP组,采用双侧卵巢切除术建立大鼠OP模型,不进行治疗;OP+冲击波治疗组,采用双侧卵巢切除术建立大鼠OP模型,术后6个月左侧股骨颈给予放散式冲击波治疗。治疗结束,采用HE染色、抗酒石酸碱性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP)化学染色以及micro-CT观察各组股骨近端组织结构。进一步对micro-CT的结果进行定量分析,比较骨密度(bone mineral density,BMD)、骨体积分数(BV/TV)、骨小梁数量(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁分离度(Tb.Sp)等指标在各组之间的差异。对各组血清学骨钙素(osteocalcin,OCN)和Ⅰ型胶原C端肽(C-terminal telopeptide of typeⅠcollagen,CTX-Ⅰ)采用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)进行检测和比较。应用生物力学机对腰椎椎体的抗压性能进行检测。结果与Sham组相比,OP组骨小梁数量降低,结构变细,TRAP化学染色阳性的破骨细胞数显著增多(P<0.05),冲击波治疗未明显改变这种情况。OP组以及OP+冲击波治疗组BMD均显著低于Sham组(P<0.05),但各组之间BV/TV,Tb.N,Tb.Th,Tb.Sp,以及血清学数据并未有显著差异。力学检测结果显示,OP组以及OP+冲击波治疗组的抗压性能均显著低于Sham组(P<0.05)。结论晚期OP放散式冲击波治疗后,股骨颈的微结构、L3和L4椎体的抗压性能以及血清学指标未有明显改善,很可能需要与其他方式联合应用才能达到一定的治疗效果。 展开更多

关键词 晚期骨质疏松症 放散式冲击波 骨密度 骨小梁

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离心重力诱导脂肪间充质干细胞向软骨样细胞分化 被引量：2

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作者 舒雄 杰永生 +4 位作者 郑蕊 陈磊 靳少锋 綦惠 孙磊 《中国医药生物技术》 2018年第1期13-18,共6页

目的探讨离心重力对人脂肪来源间充质干细胞(hADSCs)向软骨样细胞分化以及对Wnt/β-catenin信号通路的影响。方法通过加载不同离心力(0、500、1000、2000、2500、3000×g)和持续时间(0、15、30、45、60 min)刺激脂肪干细胞分化为软... 目的探讨离心重力对人脂肪来源间充质干细胞(hADSCs)向软骨样细胞分化以及对Wnt/β-catenin信号通路的影响。方法通过加载不同离心力(0、500、1000、2000、2500、3000×g)和持续时间(0、15、30、45、60 min)刺激脂肪干细胞分化为软骨样细胞,并利用荧光定量PCR和Western blot检测Sox 9基因的上调表达来筛选条件,将培养的P3代h ADSCs分3组,对照组(不干预处理)、离心重力组和TGF-β3组(加入TGF-β3成软骨诱导剂),持续培养21 d后,通过阿利辛蓝和苏木精-伊红染色进行软骨分化鉴定,DMMB法测定胞外基质中GAG含量,荧光定量PCR测定Ⅱ型胶原基因表达,Western blot进一步检测对照组和离心重力组中Sox 9、β-catenin、GSK3β和p-GSK3β蛋白的表达。结果加载最适的离心重力(2500×g,30 min)刺激h ADSCs后,培养24 h,Sox 9的m RNA和蛋白表达显著上调。阿利辛蓝和苏木精-伊红染色显示,离心重力组和TGF-β3组中软骨表达呈阳性。GAG实验结果显示,TGF-β3组促GAG分泌的能力优于离心重力组(P<0.05),荧光定量PCR结果表明TGF-β3组其Ⅱ型胶原mRNA表达的能力高于离心重力组(P<0.05),Western blot结果显示,相比对照组,离心重力组中β-catenin和p-GSK3β的蛋白表达水平降低,而GSK3β和Sox 9蛋白表达升高。结论离心重力和TGF-β3诱导脂肪干细胞成软骨分化中的表达具有相似的能力,离心重力对h ADSCs诱导成软骨作用与抑制Wnt/β-catenin信号通路有关。 展开更多

关键词 人脂肪干细胞 超重力 SOX 9转录因子类 软骨分化

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激活的富血小板血浆促进Pellet培养的脂肪间充质干细胞成软骨样分化 被引量：1

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作者 舒雄 杰永生 +4 位作者 郑蕊 陈磊 靳少锋 綦惠 孙磊 《中国医药生物技术》 2018年第4期328-334,共7页

目的探讨激活的富血小板血浆(PRP)对Pellet培养的人脂肪来源间充质干细胞向软骨样细胞分化及相关信号通路的影响。方法添加不同比例(5%、10%和15%)的激活PRP,检测不同培养时间(1、3、5、7、9、11 d)脂肪干细胞的增殖能力。将采用Pellet... 目的探讨激活的富血小板血浆(PRP)对Pellet培养的人脂肪来源间充质干细胞向软骨样细胞分化及相关信号通路的影响。方法添加不同比例(5%、10%和15%)的激活PRP,检测不同培养时间(1、3、5、7、9、11 d)脂肪干细胞的增殖能力。将采用Pellet培养的P3代的h ADSCs分为3组,对照组、激活PRP组和含TGF-β3的软骨诱导组,持续培养21 d后,阿利新蓝和苏木精-伊红染色进行软骨分化鉴定,real-time PCR测定Sox-9、Aggrecan和II型胶原的基因表达,DMMB法测定胞外基质中GAG含量,Western blot进一步检测对照组和激活PRP组中Sox-9、Gli-1和BMP-2蛋白的表达。结果 MTT实验结果显示,在10%激活PRP培养条件下,11 d的生长时间内hADSCs的增殖率最适宜。阿利新蓝和苏木精-伊红染色显示,激活PRP组和软骨诱导组中软骨表达呈阳性。Real-time PCR结果表明软骨诱导组其Sox-9、Aggrecan和II型胶原mRNA表达的能力高于激活PRP组(P<0.05)。GAG实验结果显示,软骨诱导组促GAG分泌的能力优于激活PRP组(P<0.05)。Western blot结果显示,相比对照组,激活PRP组中伴随Gli-1和BMP-2的蛋白表达升高,而Sox-9蛋白表达随之升高。结论激活PRP刺激hADSCs的最适增殖能力的浓度比例为10%。激活PRP和软骨诱导剂对脂肪干细胞成软骨分化中的诱导表达具有相似的能力,激活PRP对h ADSCs诱导成软骨作用与Hedgehog和BMP信号通路有关。 展开更多

关键词 富血小板血浆 脂肪干细胞 Pellet培养 软骨分化

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HSP90β干扰和过表达慢病毒载体的构建及其在骨肉瘤细胞Saos-2中的表达 被引量：1

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作者 舒雄 刘辉琦 +5 位作者 杰永生 郑蕊 綦惠 陈磊 靳少锋 冉宇靓 《现代肿瘤医学》 CAS 2020年第7期1057-1062,共6页

目的:获得热休克蛋白90β(HSP90β)基因干扰和过表达慢病毒表达系统,并检测其在人骨肉瘤细胞株Saos-2中的表达水平。方法:设计合成shRNA,以慢病毒表达质粒构建HSP90β干扰和过表达载体,酶切电泳、测序技术鉴定载体构建是否成功。重组病... 目的:获得热休克蛋白90β(HSP90β)基因干扰和过表达慢病毒表达系统,并检测其在人骨肉瘤细胞株Saos-2中的表达水平。方法:设计合成shRNA,以慢病毒表达质粒构建HSP90β干扰和过表达载体,酶切电泳、测序技术鉴定载体构建是否成功。重组病毒转染H1299细胞,以嘌呤霉素筛选稳定转染的Saos-2细胞,通过荧光显微镜观察计数获得转染效率。将感染好的细胞分为干扰NC组(NEG-shRNA)、干扰组(shRNA-HSP90β)、过表达NC对照组(NEG-pEZ)及过表达组(pEZ-HSP90β)。通过qRT-PCR与Western blotting分别从mRNA和蛋白表达水平验证目的基因的干扰和过表达水平。结果:插入慢病毒表达载体的基因片段与目的基因的碱基序列完全一致。病毒包装成功后,嘌呤霉素最小致死浓度1μg/ml,感染复数200,感染人Saos-2的感染效率达80%,其中shRNA-HSP90β组干扰效率为86.35%,pEZ-HSP90β组的mRNA相对表达量增加2. 8倍。进一步研究发现,shRNA-HSP90β组较NEG-shRNA组中HSP90β蛋白表达明显降低,p EZ-HSP90β组较NEG-p EZ组HSP90β蛋白表达增加。结论:HSP90β基因干扰和过表达慢病毒载体构建成功,并能够在Saos-2中稳定表达。 展开更多

关键词 骨肉瘤细胞 HSP90β 慢病毒载体 RNA干扰 过表达

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