摘要
以显性核不育油菜Shaan—GMS不育株和可育株的花序和叶片为材料，采用TCA（三氯醋酸）-丙酮法提取油菜花蕾、花药及叶片总蛋白，对总蛋白提取方法、IPG（固定pH梯度）胶条种类、聚焦程序、凝胶浓度、上样量等环节进行了优化。结果表明，采用理想的蛋白质裂解液（7mol／L尿素，2mol／L硫脲，4％CHAPS（3-[3-（胆酰氨丙基）二甲氨基]丙磺酸内盐），65mmol二硫苏糖醇，0．5％IPG缓冲液pH3～10或pH4～7，全蛋白酶抑制片剂（片／10mL））裂解蛋白，以150μg上样，按IEF程序Ⅱ（30V，12h；200V，1h；500V，1h；1000V，0．5h；10000V，2h；10000V，8h）进行等电聚焦，10％SDS—PAGE胶浓度进行第二向电泳，银染方法检测，可得到背景清晰、分辨率较高的油菜花蕾、花药及叶片蛋白质电泳图谱。高质量油菜蛋白的提取方法和蛋白质分离双向电泳体系的优化可为油菜蛋白质组学研究奠定技术基础。
Proteins from buds,anthers and leaves were extracted using TCA （triehloroacetic acid） -acetone method from sterile and fertile plants of Brassica napus L. dominant GMS （genic male sterile） line Shaan - GMS. Optimized factors included extraction parameters, types of IPG strip, focusing procedure, gel concentration and loading quantity of samples. High quality 2 - DE map with low background was obtained using the following optimized procedure ： dissolving proteins with lysis solution （ 7mol/L Urea, 2mol/L Thiourea, 4% CHAPS, 65mmol DTT, 0.5% IPG buffer pH 3 - 10 or pH 4 - 7,10mL Complete Protease Inhibitor Coetail Tablets for each sample）, loading 150μg protein sample, isoelectric focusing with IEF Ⅱ procedure （ 30V, 12h ; 200V, 1 h ; 500V, 1 h ; 1000V, 0.5h ; 10 000V,2h ; 10 000V,8h）, SDS - PAGE with 10% gel concentration, and finally detecting proteins using silver-taining method. The optimized system will be able to facilitate the proteomics research on B. napus.
出处
《中国油料作物学报》
CAS
CSCD
北大核心
2009年第4期426-433,共8页
Chinese Journal of Oil Crop Sciences
基金
农业部油料作物生物学重点开放实验室开放基金(2008-1)
国家自然科学基金(30671119)和863计划(2006AA10A113)
关键词
甘蓝型油菜
花药
花蕾
叶片
总蛋白提取
双向电泳
Brassica napus
Anther
Floral buds
Leaves
Total proteins extraction
Two-imensional electropboresis
