摘要
目的通过对结核分枝杆菌复苏促进因子基因的克隆、融合蛋白的表达、纯化，以获得高活性的结核分枝杆菌复苏促进因子蛋白质。为临床标本结核分枝杆菌复苏培养及功能研究提供物质基础。方法通过PCR扩增结核分枝杆菌H37Rv的5个复苏因子基因，经内切酶酶切、胶回收，将片段亚克隆到T载体中，转化至DH5α。以PCR鉴定的阳性菌落转至LB中培养，菌液进行质粒提取、酶切、胶回收，回收片段再克隆至表达载体pET30a中，转化至DH5α中。PCR阳性菌落转至LB中培养，测序确定插入片段的正确性，菌液提取质粒，并再转化至BL21（DE3）中。经PCR鉴定阳性的菌液通过适当的IPTG浓度诱导，适宜温度和时间下，诱导蛋白表达，经SDS—PAGE电泳分析，Western blot检测目的蛋白，在最佳条件下大量表达目的蛋白，并纯化。结果获得有活性的高纯度复苏促进因子蛋白，纯度〉90％。结论复苏促进因子蛋白的成功表达为下一步摸索临床标本结核分枝杆菌复苏培养最佳方案及复苏基因的功能研究打下良好基础。
Objective To investigate the cloning and expression of Mycobacterium tuberculosis resuscitation-promoting factor（Rpf）. Method 5 Mycobacterium tuberculosis resuscitation-promoting factor （Rpf） gene were amplified by PCR.Clone the gene into expression vector pET30a.The protein was expressed by IPTG induction. Expressed products were confirmed by SDS-PAGE and Western blot.Result Mycobacterium tuberculosis Rpf proteins with 〉90% purity was obtained. Conclusion Proteins of Rpf lay the basis of further functional study and the resuscitable culture for Mycobacterium tuberculosis.
出处
《结核病与胸部肿瘤》
2007年第1期12-18,共7页
Tuberculosis and Thoracic Tumor
基金
本课题受北京市自然科学基金资助7052014,北京市科技新星基金资助H013610240113
