实时荧光定量PCR检测猴痘病毒的方法研究

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作者 冯俊霞 陈锦峰 +3 位作者 崔晓虎 夏语嫣 薛冠华 袁静 《遵义医科大学学报》 2024年第5期508-512,521,共6页

目的建立猴痘病毒(mpox virus)的实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测方法。方法以猴痘病毒F3L基因为靶序列,设计特异性引物和探针,建立猴痘病毒RT-PCR检测方法,并对方法的灵敏度、特异性和重复性进行检测;对疑似猴痘阳性的人脓拭子临床样本核... 目的建立猴痘病毒(mpox virus)的实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测方法。方法以猴痘病毒F3L基因为靶序列,设计特异性引物和探针,建立猴痘病毒RT-PCR检测方法,并对方法的灵敏度、特异性和重复性进行检测;对疑似猴痘阳性的人脓拭子临床样本核酸进行检测,对RT-PCR方法检测临床样本能力进行评价。结果本研究建立的RT-PCR检测方法可实现猴痘病毒的特异性检测,与天花、痘苗、牛痘等其他正痘病毒无交叉反应,检测重复性好,最低检测限为103copies/μL。可以对人皮肤拭子样本中的猴痘病毒进行准确检测。结论本研究建立了猴痘病毒的RT-PCR检测方法,可在临床样本中快速、特异、灵敏的检测猴痘病毒。 展开更多

关键词 猴痘病毒 实时荧光定量PCR 快速检测方法 F3L基因

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PMA-ddPCR法检测活的非可培养状态高产乙醇肺炎克雷伯菌

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作者 赵硕 窦晨镤 +1 位作者 张建 袁静 《中华预防医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2024年第7期998-1003,共6页

目的建立活的非可培养(VBNC)状态高产乙醇肺炎克雷伯菌的绝对定量方法。方法诱导高产乙醇肺炎克雷伯菌进入VBNC状态,评价乙醇产量。建立PMA-ddPCR方法通过单拷贝基因来计数高产乙醇肺炎克雷伯菌VBNC状态的活细胞基因拷贝数。进一步在VBN... 目的建立活的非可培养(VBNC)状态高产乙醇肺炎克雷伯菌的绝对定量方法。方法诱导高产乙醇肺炎克雷伯菌进入VBNC状态,评价乙醇产量。建立PMA-ddPCR方法通过单拷贝基因来计数高产乙醇肺炎克雷伯菌VBNC状态的活细胞基因拷贝数。进一步在VBNC状态粪便模拟中,评价ddPCR对低浓度样品检测的灵敏度和适应性。结果对高产乙醇肺炎克雷伯菌梯度稀释液进行定量时ddPCR的检测下限是qPCR的10倍。在低温、低营养状态,高产乙醇肺炎克雷伯菌第45天进入VBNC状态,通过PMA-ddPCR对VBNC状态细胞进行定量结果为(5.46±0.05)log10 DNA 拷贝数/ml。VBNC状态的乙醇产量为<2.2 mmol/L,复苏后恢复产乙醇能力。VBNC状态粪便模拟样品中ddPCR最低检测下限为3.2 log10 DNA拷贝数/ml。结论建立VBNC状态高产乙醇肺炎克雷伯菌的ddPCR检测方法灵敏度和适应性良好,可用于临床样品中VBNC状态细胞的检测。 展开更多

关键词 叠氮溴化丙锭-微液滴数字聚合酶链反应 活的非可培养状态 高产乙醇肺炎克雷伯菌

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新生儿重症监护病房患儿粪便肺炎克雷伯菌分离株毒力特征分析

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作者 张亚南 丁赞博 +4 位作者 孔一鸣 刘尊杰 李兆娜 仝净净 崔晶花 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第7期2663-2675,共13页

【背景】肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)常存在于人体上呼吸道和肠道,属于条件性致病菌。目前由于临床上多重耐药菌株的出现及细菌毒力的不断增强使其受到了广泛关注。新生儿重症监护病房(neonatal intensive care unit,NICU)患... 【背景】肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)常存在于人体上呼吸道和肠道,属于条件性致病菌。目前由于临床上多重耐药菌株的出现及细菌毒力的不断增强使其受到了广泛关注。新生儿重症监护病房(neonatal intensive care unit,NICU)患儿免疫系统不完善,高毒力肺炎克雷伯菌的存在具有院内传播的潜在风险。【目的】探究2021年北京妇产医院/北京妇幼保健院NICU患儿粪便肺炎克雷伯菌存在情况与分离株毒力特征。【方法】对采集自北京妇产医院/北京妇幼保健院NICU患儿421份粪便样本进行肺炎克雷伯菌分离培养、全基因组测序及毒力基因分析。利用毒力因子数据库(virulence factor database,VFDB)和Kleborate数据库进行肺炎克雷伯菌毒力基因注释与多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST),并通过拉丝试验、大蜡螟生存试验及细胞毒力试验验证各菌株毒力。【结果】在421份粪便样品中共检出13株肺炎克雷伯菌,检出率为3.1%,肺炎克雷伯菌携带者主要集中于ABO溶血、低出生体重、新生儿肺炎和新生儿高胆红素血症患者。肺炎克雷伯菌分离株基因组大小为5 Mb,基因组组装后序列长度中位数N50大于20 kb,G+C含量为57%。13株菌分别具有13种ST型别、13种K血清型与7种O血清型。利用VFDB注释肺炎克雷伯菌分离株的846个毒力基因,菌株Kp50具有最多的毒力蛋白和毒力结构基因,Kleborate毒力因子评分中菌株Kp50评分最高。表型试验发现在13株肺炎克雷伯菌中,仅有菌株Kp50具有高黏表型和更强的细胞毒力,具有铁载体表达能力的菌株Kp50、Kp260、Kp185和Kp273在大蜡螟幼虫试验中呈现较高的毒力。【结论】北京妇产医院/北京妇幼保健院NICU患儿粪便样本中肺炎克雷伯菌检出率较低,分离得到的肺炎克雷伯菌分型呈现高度多样性,存在携带多种毒力基因和表型的高毒力菌株,需引起临床重视,做好高毒力菌� 展开更多

关键词 肺炎克雷伯菌 新生儿重症监护病房 全基因组测序 毒力基因 毒力表型

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高产乙醇肺炎克雷伯菌的危害及感染应对策略

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作者 袁静 《遵义医科大学学报》 2024年第5期438-441,共4页

高产乙醇肺炎克雷伯菌(HiAlc Kpn)能够在患者肠道内产生大量内源性乙醇,是非酒精性脂肪肝(NAFLD)的新病因,严重危害着人类健康。抗生素治疗是应对细菌感染的主要方式,然而肺炎克雷伯菌的耐药问题日益严重,且抗生素往往破坏人体肠道菌群... 高产乙醇肺炎克雷伯菌(HiAlc Kpn)能够在患者肠道内产生大量内源性乙醇,是非酒精性脂肪肝(NAFLD)的新病因,严重危害着人类健康。抗生素治疗是应对细菌感染的主要方式,然而肺炎克雷伯菌的耐药问题日益严重,且抗生素往往破坏人体肠道菌群的平衡。噬菌体疗法有望在不破坏健康肠道菌群的基础上,通过靶向杀伤HiAlc Kpn治疗NAFLD。同时,应积极寻找影响HiAlc Kpn产乙醇能力的目标靶点,为开发“抗毒力药物”提供理论基础。本文主要阐述HiAlc Kpn的危害性并提出治疗HiAlc Kpn感染的一些应对策略。 展开更多

关键词 肺炎克雷伯菌 乙醇 抗生素 噬菌体

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结直肠癌引起成肌细胞恶病质的体外模型研究

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作者 徐子瑛 李上 +2 位作者 高亚钢 唐智杰 袁静 《遵义医科大学学报》 2024年第9期837-843,849,共8页

目的 恶病质作为一种全身消耗性疾病,其主要特点为难以逆转的全身骨骼肌质量减少,严重损害患者健康状态。进一步解析恶病质引起骨骼肌消耗的机制以探寻潜在治疗靶点是改善恶病质患者生存质量的重要策略。方法 利用Incucyte持续观察肿瘤... 目的 恶病质作为一种全身消耗性疾病,其主要特点为难以逆转的全身骨骼肌质量减少,严重损害患者健康状态。进一步解析恶病质引起骨骼肌消耗的机制以探寻潜在治疗靶点是改善恶病质患者生存质量的重要策略。方法 利用Incucyte持续观察肿瘤细胞上清对成肌细胞增殖、迁移能力的影响,并利用流式细胞术检测成肌细胞凋亡水平改变。通过RT-qPCR检测分析肿瘤细胞上清对体外诱导分化肌管的成肌分化、肌肉萎缩及脂质过氧化等相关基因的表达。利用细胞成像和流式细胞术共同检测肿瘤细胞上清诱导的成肌细胞线粒体损伤情况。结果 通过体外模拟恶病质对成肌细胞和肌管的影响,观察到在肿瘤上清刺激下,成肌细胞迁移能力减弱、细胞凋亡加剧。且诱导分化后的成肌相关基因表达下调、肌肉萎缩相关基因表达上调,同时伴随脂质过氧化,进一步研究发现成肌细胞线粒体膜电位出现了明显变化。结论 恶病质可通过诱导脂质过氧化和线粒体损伤造成骨骼肌萎缩,保护线粒体不受恶病质因子的损伤可能是治疗恶病质骨骼肌减少的潜在策略。 展开更多

关键词 结直肠癌 恶病质 肌肉萎缩 线粒体损伤

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酒精及高脂饮食双重诱导下脂肪肝的转录组学变化分析

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作者 徐子瑛 高亚钢 +1 位作者 唐智杰 袁静 《遵义医科大学学报》 2024年第7期643-652,共10页

目的通过酒精灌胃和高脂饮食诱导脂肪肝小鼠模型,观察小鼠肝脏表型和转录组学的改变,分析酒精、高脂饮食和联合饮食对肝脏的危害性。方法实验小鼠分为对照组(PBS)、高脂饲喂组(高脂饲料)、酒精灌胃组(40%酒精)、联合饲喂组(酒精+高脂饲... 目的通过酒精灌胃和高脂饮食诱导脂肪肝小鼠模型,观察小鼠肝脏表型和转录组学的改变,分析酒精、高脂饮食和联合饮食对肝脏的危害性。方法实验小鼠分为对照组(PBS)、高脂饲喂组(高脂饲料)、酒精灌胃组(40%酒精)、联合饲喂组(酒精+高脂饲料)。HE染色观察各组小鼠肝脏组织病理形态。提取肝脏RNA进行转录组测序,并针对各组转录组学的变化进行分析,观察在单一风险因素作用下和双重风险因素作用下对肝脏的影响。构建基因表达调控网络锁定网络核心基因,并对其进行验证。结果在病理层面,联合饲喂组肝脏相较于单一风险因素各组表现出更为严重的脂质累积和炎症。转录组学分析结果显示,联合饲喂组的基因表达相较于单纯的高脂饲喂组和酒精灌胃组表现出了更为明显的脂质累积通路的活跃和恶化倾向。对单风险因素和双重风险因素的差异表达基因取交集,筛选出了导致脂肪肝肝损伤的主要风险基因。功能分析结果显示高脂饮酒小鼠肝脏的基因表达变化不仅包括脂肪代谢异常,同时也和药物的不良代谢有关,最终导致肝脏炎症增加。通过网络分析可以确定Acacb,Cyp2b10和Cd36可能是高脂饮群体肝脏基因表达变化的主要靶点。结论饮酒和高脂饮食对肝脏的影响虽然都和脂肪累积引起脂肪肝相关,但并不完全一样,高脂饮食人群饮酒会对肝脏产生更严重的影响。然而关于高脂饮食和饮酒对肝脏的具体作用机制有待于进一步深入探索。 展开更多

关键词 酒精 高脂饮食 脂肪肝 脂肪代谢

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猴痘病毒微液滴数字PCR检测方法的建立

7

作者 冯俊霞 袁静 《中华实验和临床病毒学杂志》 CAS CSCD 2024年第3期337-342,共6页

目的建立一种用于猴痘病毒(mpox virus)核酸检测的微液滴数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)检测方法。方法设计靶向猴痘病毒F3L基因的特异性引物和探针,建立猴痘病毒核酸的ddPCR检测方法,对ddPCR的最适反应条件进行优化,并对ddPCR的... 目的建立一种用于猴痘病毒(mpox virus)核酸检测的微液滴数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)检测方法。方法设计靶向猴痘病毒F3L基因的特异性引物和探针,建立猴痘病毒核酸的ddPCR检测方法,对ddPCR的最适反应条件进行优化,并对ddPCR的特异性、灵敏度以及重复性进行检测。进一步对人脓拭子临床样本进行检测,对ddPCR方法检测临床样本的能力进行评价。结果对ddPCR反应温度和引物探针浓度进行优化,建立猴痘病毒ddPCR检测方法,该方法最低检测限可达2拷贝/μl,与其他8种病毒无交叉反应。对10份人皮肤脓液拭子临床样本中的猴痘病毒进行检测,ddPCR方法检测到5份阳性样本,实时荧光定量PCR(real time fluorescence quantitative PCR,qPCR)方法检测到4份阳性样本。结论建立的猴痘病毒的ddPCR检测方法快速、特异、灵敏度高,用于临床样本中猴痘病毒检测。 展开更多

关键词 猴痘病毒 微液滴数字PCR 实时荧光定量PCR

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高产乙醇肺炎克雷伯adhE缺失菌株构建及对其产乙醇能力的影响

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作者 范政 付彤彤 +3 位作者 陈雨晨 李周霏 刘洪伯 袁静 《遵义医科大学学报》 2024年第5期442-446,453,共6页

目的探究基因adhE缺失对高产乙醇肺炎克雷伯菌株生长能力,乙醇脱氢酶活性及产乙醇能力的影响。方法以高产乙醇肺炎克雷伯菌株TH1为背景,利用温敏型质粒介导的同源重组技术构建基因adhE的缺失菌株。通过PCR扩增获取基因adhE片段并构建于p... 目的探究基因adhE缺失对高产乙醇肺炎克雷伯菌株生长能力,乙醇脱氢酶活性及产乙醇能力的影响。方法以高产乙醇肺炎克雷伯菌株TH1为背景,利用温敏型质粒介导的同源重组技术构建基因adhE的缺失菌株。通过PCR扩增获取基因adhE片段并构建于pGEM-Teasy表达载体获得回补质粒,导入ΔadhE缺失菌株得到回补菌株,并将pGEM-Teasy空质粒导入高产乙醇肺炎克雷伯野生菌株及ΔadhE缺失菌株作为空载对照。在液体LB培养基中测定各菌株的生长曲线,使用试剂盒检测各菌株的乙醇脱氢酶活性并通过顶空法检测各菌株的乙醇产量。结果使用PCR技术明确ΔadhE缺失菌株与相关回补菌株构建成功。基因adhE缺失后,厌氧条件下高产乙醇肺炎克雷伯菌株的生长速度显著降低,而回补菌株的生长速度显著升高(P<0.05)。同时,相比于野生型菌株,ΔadhE缺失菌株的乙醇脱氢酶活性与乙醇产量显著降低,而回补菌株的乙醇脱氢酶活性与乙醇产量恢复到了野生型菌株的水平(P<0.05)。结论基因adhE的缺失减缓了高产乙醇肺炎克雷伯菌株厌氧条件下的生长速度,同时显著降低了高产乙醇肺炎克雷伯菌株的产乙醇能力。 展开更多

关键词 肺炎克雷伯菌 基因敲除 乙醇脱氢酶E 乙醇

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FNR影响高产乙醇肺炎克雷伯菌产乙醇能力及转录组分析

9

作者 范政 李周霏 +3 位作者 刘洪伯 陈雨晨 付彤彤 袁静 《遵义医科大学学报》 2024年第5期447-453,共7页

目的探究fnr基因缺失对高产乙醇肺炎克雷伯菌产乙醇能力的影响,并对野生型菌株与Δfnr缺失菌株进行转录组测序分析。方法以高产乙醇肺炎克雷伯菌株TH1为背景,利用温敏型质粒介导的同源重组技术构建fnr基因的缺失菌株。PCR扩增并克隆fnr... 目的探究fnr基因缺失对高产乙醇肺炎克雷伯菌产乙醇能力的影响,并对野生型菌株与Δfnr缺失菌株进行转录组测序分析。方法以高产乙醇肺炎克雷伯菌株TH1为背景,利用温敏型质粒介导的同源重组技术构建fnr基因的缺失菌株。PCR扩增并克隆fnr基因于pGEM-Teasy表达载体获得回补质粒,导入Δfnr缺失菌株得到回补株,并将pGEM-Teasy空质粒导入野生株及缺失株作为空载对照。通过顶空法检测基因fnr缺失对高产乙醇肺炎克雷伯菌株乙醇产量的影响。并对野生型菌株和Δfnr缺失菌株进行转录组测序,筛选差异表达基因并进行京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析。结果通过PCR技术明确fnr基因缺失与回补菌株构建成功。乙醇含量测定结果显示基因fnr缺失后,高产乙醇肺炎克雷伯菌株的乙醇产量显著降低,且回补菌株的乙醇产量显著升高。转录组测序结果表明基因fnr缺失后561个基因表达上调,610个基因表达下调。KEGG富集分析结果表明,上调基因主要富集在包括氨基酸代谢、嘧啶代谢、三羧酸循环等通路,下调基因中富集到了包括氧化磷酸化、丙酮酸代谢、双组份系统、磷酸转移酶系统(PTS)、生物被膜形成、糖酵解/糖异生等通路。结论fnr基因的缺失显著降低了高产乙醇肺炎克雷伯菌株的乙醇产量,且全局性调控因子FNR能够正向促进糖酵解通路,抑制三羧酸循环通路。 展开更多

关键词 肺炎克雷伯菌 FNR 基因敲除 乙醇

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一株多重耐药准肺炎克雷伯菌的基因组和耐药基因分析

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作者 崔晶花 于子惠 +2 位作者 孔一鸣 丁赞博 袁静 《遵义医科大学学报》 2024年第5期454-460,共7页

目的本研究旨在了解新生儿粪便分离的多重耐药准肺炎克雷伯菌的基因组和耐药相关基因特征。方法使用E-test抗生素敏感性检测和全基因组测序技术和生物信息分析方法。结果该菌株对阿莫西林/克拉维酸、头孢他啶、头孢唑啉、头孢呋辛、头... 目的本研究旨在了解新生儿粪便分离的多重耐药准肺炎克雷伯菌的基因组和耐药相关基因特征。方法使用E-test抗生素敏感性检测和全基因组测序技术和生物信息分析方法。结果该菌株对阿莫西林/克拉维酸、头孢他啶、头孢唑啉、头孢呋辛、头孢曲松、头孢哌酮、美罗培南等临床常用抗生素耐药。全基因组测序提示该菌株携带两个质粒,与以往报道的IncFⅡ型和IncX3型质粒高度相似。并且,两个质粒携带重要的耐药基因,分别为bla TEM-1D、bla CTX-M-15、bla NDM-1和bla SHV-12。同时染色体DNA上也携带一些重要耐药相关基因,如bla OKP-B-2等。这些耐药基因能够解释我们检测到的耐药表型的发生,并说明这些耐药性可能随着质粒具有一定的传播风险。结论准肺炎克雷伯菌不同于肺炎克雷伯菌,其耐药特性和基因组具有一定特征。并且,由于新生儿可携带,且具有多重耐药性,应该受到进一步的广泛关注。 展开更多

关键词 准肺炎克雷伯菌 耐药 基因组 质粒

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肺炎克雷伯菌 wza基因缺失对荚膜形成与噬菌体敏感性的研究

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作者 范政 刘洪伯 +4 位作者 陈雨晨 崔晓虎 李周霏 付彤彤 袁静 《中华预防医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2024年第7期992-997,共6页

目的探讨肺炎克雷伯菌wza基因缺失对细菌荚膜形成能力及对噬菌体敏感性的影响。方法以野生型肺炎克雷伯菌株W14为背景,利用温敏型质粒介导的同源重组技术构建Δwza基因缺失菌株。在溶菌肉汤(LB)培养基固体平板观察菌落形态并在液体LB培... 目的探讨肺炎克雷伯菌wza基因缺失对细菌荚膜形成能力及对噬菌体敏感性的影响。方法以野生型肺炎克雷伯菌株W14为背景,利用温敏型质粒介导的同源重组技术构建Δwza基因缺失菌株。在溶菌肉汤(LB)培养基固体平板观察菌落形态并在液体LB培养基中测定细菌的生长曲线。通过透射电镜,糖醛酸含量测定的方法检测wza基因缺失对肺炎克雷伯菌株荚膜形成的影响。并通过观察噬菌斑明确wza基因缺失是否影响菌株W14对噬菌体phiW14的敏感性。使用t检验比较菌株W14与Δwza 缺失菌株荚膜多糖的糖醛酸含量差异情况。结果通过PCR技术明确Δwza基因缺失菌株构建成功。LB固体平板上观察到Δwza基因缺失菌株的菌落较小,而生长曲线未观察到wza基因缺失对菌株生长速度的影响。透射电镜结果显示,wza基因缺失后菌株荚膜多糖缺失。糖醛酸含量检测表明Δwza基因缺失菌株的糖醛酸含量为(45.963±2.795)μg/ml,远低于野生型菌株W14的(138.800±5.201)μg/ml,t=27.233,P<0.001。通过观察噬菌斑发现wza基因缺失后,菌株失去了对噬菌体phiW14的敏感性。结论基因wza的缺失损害了细菌的荚膜形成能力并使得菌株失去了对噬菌体phiW14的敏感性。 展开更多

关键词 肺炎克雷伯菌 wza 基因敲除 荚膜 噬菌体

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