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CD59基因的突变并真核表达载体的构建 被引量：2
1
作者 朱新红 高美华 +3 位作者 任书荣 王秋波 王静 林存智 《青岛大学医学院学报》 CAS 2008年第2期95-98,共4页
目的构建两种活性位点相关性CD59突变基因,并重组入真核表达载体。方法选取物种间高度保守W40位点及相邻位置为突变位点,重叠延伸PCR(Overlap extension PCR)法构建两种CD59基因点突变,一种是编码W40的密码子TGG缺失突变,另一种是C39W40... 目的构建两种活性位点相关性CD59突变基因,并重组入真核表达载体。方法选取物种间高度保守W40位点及相邻位置为突变位点,重叠延伸PCR(Overlap extension PCR)法构建两种CD59基因点突变,一种是编码W40的密码子TGG缺失突变,另一种是C39W40K41→W39W40W41的相应基因突变,各设计两条常规引物和两条反向互补突变引物,以已构建CD59 cDNA为模板,三重PCR定点诱变扩增突变基因,重组入克隆载体PMD18-T-Vector,EcoRⅠ单酶切获得目的基因,重组入真核表达载体pIRES。结果通过PCR定点诱变成功获得两种目的CD59突变基因,序列测定及酶切鉴定结果均证实成功构建了pIRES-m1CD59、pIRES-m2CD59重组真核表达载体系统,突变CD59基因长度约500 bp。结论重叠延伸PCR法诱变经济可靠,重组质粒的构建为进一步研究CD59的抗补体活性奠定了基础。 展开更多
关键词 抗原 CD59 点突变 真核表达
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CD59转染细胞Caspase-3和Bcl-2基因的表达 被引量：1
2
作者 朱新红 高美华 +1 位作者 于新娟 林存智 《青岛大学医学院学报》 CAS 2009年第1期9-10,24,共3页
目的探讨野生型和突变型CD59分子的表达与细胞凋亡因子之间的关系。方法应用免疫组化方法,分别测定空pIRES、野生型pIRES-WTCD59和突变型pIRES-MCD59转染CHO细胞中凋亡相关基因Caspase-3、Bcl-2的表达。结果转染野生型pIRES-WTCD59组与... 目的探讨野生型和突变型CD59分子的表达与细胞凋亡因子之间的关系。方法应用免疫组化方法,分别测定空pIRES、野生型pIRES-WTCD59和突变型pIRES-MCD59转染CHO细胞中凋亡相关基因Caspase-3、Bcl-2的表达。结果转染野生型pIRES-WTCD59组与转染空pIRES质粒组比较,Caspase-3表达降低,Bcl-2表达增高,差异有显著性(Z=3.462、3.958,P<0.05);转染突变型pIRES-MCD59组与转染空pIRES质粒组比较,Caspase-3表达降低,Bcl-2表达增高,差异有显著性(Z=3.212、3.956,P<0.05);转染野生型pIRES-WTCD59组与突变型pIRES-MCD59组比较,Caspase-3、Bcl-2表达差异无显著性(Z=1.948、0.544;P>0.05)。结论CD59分子具有抑制凋亡的作用,而其保守位点W40与凋亡信号的传导无关。 展开更多
关键词 抗原 CD59 点突变 CASPASE-3 基因 BCL-2 细胞凋亡
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CD59活性位点相关性基因突变的构建与表达 被引量：1
3
作者 朱新红 高美华 +2 位作者 任书荣 王秋波 林存智 《高技术通讯》 EI CAS CSCD 北大核心 2008年第6期645-649,共5页
构建了野生型和突变型 CD59重组质粒,建立了高效真核表达系统,探讨了 W40位点的生物学活性。采用基因点突变技术使 CD59 W40基因位置缺失(突变1,M1)及C39W40K41→W39W40W41(突变2,M2),重叠延伸 PCR(overlap extension PCR)定点诱变扩增... 构建了野生型和突变型 CD59重组质粒,建立了高效真核表达系统,探讨了 W40位点的生物学活性。采用基因点突变技术使 CD59 W40基因位置缺失(突变1,M1)及C39W40K41→W39W40W41(突变2,M2),重叠延伸 PCR(overlap extension PCR)定点诱变扩增突变基因,重组入真核表达质粒 pIRES,利用阳离子脂质体(Lipfectamine2000)将重组质粒转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO)进行表达。酶切鉴定及序列测定证实成功构建了 pIRES-M1CD59、pIRES-M2CD59和 pIRES-WTCD59,突变基因约500bp。G418筛选出了 CHO 转染细胞的稳定细胞克隆,免疫荧光、ELISA 检测筛选 M1CD59、M2CD59和 WTCD59蛋白高表达株,连续传代30代有高表达;补体溶细胞反应显示与野生型 CD59相比,突变型 M1CD59失去对补体的抑制功能,而 M2CD59抗补体活性略增高。证实 CD59的 W40位点对其功能具有重要作用,封闭此位点可提高补体活性,有望用于肿瘤治疗。 展开更多
关键词 CD59 基因突变 真核表达 重叠延伸PCR 补体
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