医学检验技术专业教学改革的实践与启发 被引量：8

1

作者 闫晶敏 毛旭虎 李倩 《检验医学与临床》 CAS 2022年第22期3162-3166,共5页

为了应对新时期的机遇与挑战,推动我国高等教育的发展,教育部与相关部门联合下发“卓越计划”2.0,其中新医科为主要建设内容之一,其在传统医学的基础上,以解决实际问题为出发点,更加注重学科交叉融合,并以培养适应新形势的复合型人才为... 为了应对新时期的机遇与挑战,推动我国高等教育的发展,教育部与相关部门联合下发“卓越计划”2.0,其中新医科为主要建设内容之一,其在传统医学的基础上,以解决实际问题为出发点,更加注重学科交叉融合,并以培养适应新形势的复合型人才为重任。作为高校临床微生物与免疫学交叉学科的教学工作者,笔者结合当前大背景对目前医学检验技术专业相关课程的教学模式进行了反思,发现了当中存在的一些问题,并从人才培养、教学模式和生物安全等方面提出改革建议,旨在完善教学体系,为培养适应新时代背景下的优秀检验人才打下坚实基础。 展开更多

关键词 医学检验 教学改革 实验室生物安全 新医科

下载PDF 职称材料

具核梭杆菌研究进展 被引量：6

2

作者 毛旭虎 童亚楠 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第19期1867-1872,共6页

具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum,F.nucleatum)是口腔微生物群中常驻成员,并且可以与其宿主产生共生关系。具核梭杆菌能够引起多种机会性感染。最近的研究发现其感染与结直肠癌的发生、发展密切相关。现就具核梭杆菌与宿主的共生关... 具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum,F.nucleatum)是口腔微生物群中常驻成员,并且可以与其宿主产生共生关系。具核梭杆菌能够引起多种机会性感染。最近的研究发现其感染与结直肠癌的发生、发展密切相关。现就具核梭杆菌与宿主的共生关系、作为感染因子在疾病中的角色,以及促进肿瘤进程的作用等方面进行评述,并深入探讨目前对该菌的一些新见解和未来的研究方向。这些新观点希望可以帮助我们不断认识具核梭杆菌及其促进结直肠癌作用的新机制,为寻找具核梭杆菌诊断与治疗的新方法提供依据。 展开更多

关键词 具核梭杆菌 宿主 感染与免疫 结直肠癌

下载PDF 职称材料

牛磺熊去氧胆酸通过抑制内质网应激诱导的凋亡促进类鼻疽菌的清除 被引量：1

3

作者 赵光强 南栋琪 +6 位作者 袁思琪 饶承龙 邢贞泉 王彬 方瑶 毛旭虎 李倩 《陆军军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第3期225-231,共7页

目的 拟通过类鼻疽菌感染RAW264.7巨噬细胞模型,探讨牛磺熊去氧胆酸(tauroursodeoxycholic acid,TUDCA)促进类鼻疽菌胞内清除的作用机制。方法 类鼻疽菌感染RAW264.7细胞后8 h,设置未感染组和类鼻疽菌感染组,在不同浓度TUDCA处理条件下... 目的 拟通过类鼻疽菌感染RAW264.7巨噬细胞模型,探讨牛磺熊去氧胆酸(tauroursodeoxycholic acid,TUDCA)促进类鼻疽菌胞内清除的作用机制。方法 类鼻疽菌感染RAW264.7细胞后8 h,设置未感染组和类鼻疽菌感染组,在不同浓度TUDCA处理条件下,采用流式细胞仪检测类鼻疽菌诱导细胞凋亡的情况;同时使用另外一种内质网应激抑制剂4-PBA,通过Annexin-V/PI双染法和MTT细胞增殖实验分别检测类鼻疽菌感染对宿主细胞凋亡和增殖的影响;进一步使用siRNA干扰内质网应激关键基因CHOP,设置siC对照组和siCHOP干扰组,通过Western blot和流式细胞仪检测类鼻疽菌感染后Caspase-3、Caspase-12等细胞凋亡相关蛋白的表达水平及细胞凋亡情况;通过细菌胞内生存实验分析TUDCA通过抑制内质网应激减少其诱导的细胞凋亡、增强巨噬细胞对类鼻疽菌胞内清除作用的机制。结果 在不同浓度TUDCA处理下,100μmol/L或200μmol/L TUDCA可明显减少类鼻疽菌感染诱导的RAW264.7细胞凋亡数量(P<0.05)。分别使用两种内质网应激抑制剂TUDCA和4-PBA均可降低类鼻疽菌感染诱导的细胞凋亡(P<0.05)。在siC对照组,相较于未感染时类鼻疽菌感染后Caspase-3和Caspase-12表达明显增加。在siCHOP干扰组,细胞凋亡相关蛋白的表达显著低于siC对照组,TUDCA处理后细胞凋亡相关蛋白表达水平与未加TUDCA药物相比无明显差异。流式细胞仪检测结果也显示,TUDCA能够减少类鼻疽菌感染后诱导的细胞凋亡(P<0.05),但在siCHOP干扰组中,TUDCA对类鼻疽菌感染诱导的凋亡无明显改变。细菌胞内生存计数结果显示,在siC对照组加入TUDCA能够增加宿主细胞对类鼻疽菌的清除(P<0.05),而在siCHOP干扰组中TUDCA的处理对类鼻疽菌胞内增殖无明显影响。结论 在类鼻疽菌感染RAW264.7细胞模型中,TUDCA能够通过抑制巨噬细胞内质网应激诱导的凋亡,促进巨噬细胞对类鼻疽菌的胞内清除。 展开更多

关键词 类鼻疽菌 牛磺熊去氧胆酸 内质网应激 细胞凋亡

下载PDF 职称材料

类鼻疽菌Ⅲ型分泌系统BipD蛋白的重组表达及其免疫学特性研究 被引量：1

4

作者 南栋琪 文远 +7 位作者 陈建高 饶承龙 吴潘 张子元 王施韦 闫晶敏 李倩 毛旭虎 《陆军军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第15期1713-1720,共8页

目的重组表达类鼻疽菌Ⅲ型分泌系统BipD蛋白,制备多克隆抗体并鉴定其免疫学性质。方法利用pET-28a表达系统在Eschericahia coli(E.coli)BL21(DE3)中重组表达BipD蛋白,通过His Trap亲和层析纯化获得rBipD蛋白,免疫BALB/c小鼠获得rBipD多... 目的重组表达类鼻疽菌Ⅲ型分泌系统BipD蛋白,制备多克隆抗体并鉴定其免疫学性质。方法利用pET-28a表达系统在Eschericahia coli(E.coli)BL21(DE3)中重组表达BipD蛋白,通过His Trap亲和层析纯化获得rBipD蛋白,免疫BALB/c小鼠获得rBipD多克隆抗体;分别用兔抗类鼻疽菌血清和类鼻疽菌感染阳性患者血清进行Western blot实验检测rBipD的免疫反应性;通过Western blot及免疫荧光染色检测鉴定rBipD的免疫原性;以rBipD建立间接ELISA检测临床类鼻疽患者血清抗体。结果成功构建pET-28a-BipD重组质粒并转化至E.coli BL21(DE3)中诱导表达、纯化获得了相对分子质量约为36×10^(3)的rBipD蛋白,纯度约为95.4%。rBipD蛋白具有良好的免疫原性和免疫反应性。免疫小鼠可产生特异性抗体,制备鼠抗rBipD多克隆抗体,效价达1∶512000。5.0μg/mL rBipD蛋白可与类鼻疽患者血清发生免疫反应,而不与结核患者血清发生免疫反应,差异有统计学意义(P<0.01)。结论成功制备了具有免疫学活性的rBipD蛋白及其多克隆抗体,为其用于临床免疫学诊断和类鼻疽菌感染免疫机制研究提供了良好的工具。 展开更多

关键词 类鼻疽伯克霍尔德菌 BipD蛋白 重组表达 抗体制备

下载PDF 职称材料

细菌Ⅵ型分泌系统的调控与功能研究进展 被引量：5

5

作者 袁思琪 李倩 毛旭虎 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第2期620-626,共7页

Ⅵ型分泌系统(TypeⅥSecretion System,T6SS)是近年来研究较多的一种细菌分泌系统,广泛存在于革兰氏阴性菌中,在细菌的毒力、定殖、扩散及竞争遗传中发挥着重要的作用。本文综述了细菌T6SS的结构、调控以及生物学功能的最新研究进展,以... Ⅵ型分泌系统(TypeⅥSecretion System,T6SS)是近年来研究较多的一种细菌分泌系统,广泛存在于革兰氏阴性菌中,在细菌的毒力、定殖、扩散及竞争遗传中发挥着重要的作用。本文综述了细菌T6SS的结构、调控以及生物学功能的最新研究进展,以期为基于T6SS的抗菌药物研制及细菌感染的诊断与防控提供新思路。 展开更多

关键词 Ⅵ型分泌系统 调控 生物学功能

原文传递

类鼻疽伯克霍尔德菌Ⅵ型分泌系统的Hcp1蛋白转位介导多核巨细胞形成

6

作者 吴潘 饶承龙 +7 位作者 南栋琪 陈建高 张子元 刘文正 王民洋 闫晶敏 李倩 毛旭虎 《陆军军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第15期1721-1728,共8页

目的探讨类鼻疽伯克霍尔德菌Ⅵ型分泌系统溶血素共调节蛋白1(hemolysin coregulatory protein 1,Hcp1)在感染宿主细胞引起多核巨细胞(multinucleated giant cells,MNGC)形成的作用及机制。方法分别采用同源重组和质粒回补技术构建类鼻疽... 目的探讨类鼻疽伯克霍尔德菌Ⅵ型分泌系统溶血素共调节蛋白1(hemolysin coregulatory protein 1,Hcp1)在感染宿主细胞引起多核巨细胞(multinucleated giant cells,MNGC)形成的作用及机制。方法分别采用同源重组和质粒回补技术构建类鼻疽菌hcp1基因缺失株(BPC006Δhcp1)和缺失回补株(BPC006Δhcp1::hcp1);分别用类鼻疽菌BPC006野生株、BPC006Δhcp1和BPC006Δhcp1::hcp1感染RAW264.7细胞,通过激光共聚焦分析Hcp1蛋白的定位情况;在293T细胞中转染Hcp1真核表达载体后进行细胞质膜分离进一步验证定位情况;在细胞感染模型上,通过吉姆萨染色检测抗Hcp1多克隆抗体封闭对MNGC形成的影响,探究Hcp1在类鼻疽菌感染导致的MNGC形成中的作用和生物学意义。结果Western blot检测结果显示BPC006Δhcp1不表达Hcp1蛋白,而BPC006Δhcp1::hcp1能恢复Hcp1蛋白的表达,成功构建类鼻疽菌BPC006Δhcp1和BPC006Δhcp1::hcp1。细胞免疫荧光共定位实验和质膜分离实验都表明Hcp1可以定位在宿主细胞膜上,且相较于对照组抗Hcp1多克隆抗体能抑制类鼻疽菌感染所诱导的MNGC形成(P<0.01)。结论类鼻疽菌感染RAW264.7细胞时Hcp1可转位至细胞膜,并在MNGC形成中发挥重要作用。 展开更多

关键词 类鼻疽伯克霍尔德菌 Hcp1 多核巨细胞 基因缺失与回补

下载PDF 职称材料

类鼻疽菌通过诱导线粒体自噬促进其胞内存活的研究 被引量：3

7

作者 夏瑀培 胡治强 +6 位作者 饶承龙 章美娟 杨文波 闫晶敏 岳娟娟 毛旭虎 李倩 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第9期806-812,共7页

目的探讨类鼻疽菌感染人单核细胞THP-1后诱导线粒体自噬对其胞内存活的影响。方法类鼻疽菌BPC006感染THP-1细胞后2 h,以未感染组作为对照,通过透射电镜和激光共聚焦显微镜观察线粒体结构变化,流式细胞仪检测类鼻疽菌感染后不同时间点线... 目的探讨类鼻疽菌感染人单核细胞THP-1后诱导线粒体自噬对其胞内存活的影响。方法类鼻疽菌BPC006感染THP-1细胞后2 h,以未感染组作为对照,通过透射电镜和激光共聚焦显微镜观察线粒体结构变化,流式细胞仪检测类鼻疽菌感染后不同时间点线粒体膜电位的变化,全波长酶标仪检测感染后各时间点ATP含量变化;同时,通过Western blot和实时定量聚合酶链反应(quantitative real time polymerase chain reaction,Q-PCR)分别检测感染后各时间点线粒体蛋白HSP60、TIM23和线粒体DNA mtCO1的变化,激光共聚焦显微镜观察线粒体与自噬小体共定位的情况;最后,分别通过线粒体自噬诱导剂CCCP和抑制剂Mdivi-1预处理后,检测各感染时间点胞内细菌载量的变化。结果类鼻疽菌感染THP-1细胞后2 h观察到宿主细胞线粒体超微结构受损,线粒体膜电位和ATP含量在各感染时间点均降低(P<0.01),且呈时间递减趋势,提示类鼻疽菌感染后线粒体结构和功能受损;Western blot检测显示HSP60和TIM23蛋白水平随感染时间延长而减少,同时Q-PCR检测也显示mtCO1基因水平随感染时间延长而减少,免疫荧光分析显示线粒体蛋白TIM23与自噬小体GFP-LC3共定位明显增多(P<0.01),提示类鼻疽菌感染后诱导了线粒体自噬的发生;使用线粒体自噬诱导剂CCCP以及抑制剂Mdivi-1处理细胞后,与对照组比较,激活线粒体自噬类鼻疽菌胞内细菌载量增多(P<0.05),而抑制线粒体自噬其胞内细菌载量降低(P<0.05)。结论类鼻疽菌感染THP-1细胞后引起宿主细胞线粒体结构和功能受损进而诱导线粒体自噬的发生,从而有利于类鼻疽菌的胞内存活。 展开更多

关键词 类鼻疽菌 THP-1细胞 线粒体 线粒体自噬

下载PDF 职称材料

类鼻疽伯克霍尔德菌bopA基因敲除株的构建及生物学特征 被引量：1

8

作者 卢晓雪 胡治强 +5 位作者 梅国徽 张雨 胡语涵 岳娟娟 向阳 毛旭虎 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期233-242,共10页

【【背景】类鼻疽杆菌是一种能够引起人类疾病甚至死亡的胞内寄生菌,Ⅲ型分泌系统在该菌入侵上皮细胞、逃避宿主免疫以及毒力因子的分泌过程中发挥重要作用,其中bopA基因为TTSS-3基因编码的重要效应蛋白,在类鼻疽杆菌的免疫逃逸中发挥... 【【背景】类鼻疽杆菌是一种能够引起人类疾病甚至死亡的胞内寄生菌,Ⅲ型分泌系统在该菌入侵上皮细胞、逃避宿主免疫以及毒力因子的分泌过程中发挥重要作用,其中bopA基因为TTSS-3基因编码的重要效应蛋白,在类鼻疽杆菌的免疫逃逸中发挥重要作用。【目的】构建类鼻疽杆菌bopA基因敲除菌株,并对其生物学特征进行初步研究。【方法】构建pK18mobSacB-ΔbopA自杀质粒,通过大肠杆菌S17-1λpair以接合的方式转入类鼻疽杆菌,利用同源重组敲除了bopA基因,并用蔗糖平板筛选出菌株,最后在细胞和动物水平检测敲除菌株的表型变化。【结果】构建了bopA敲除的类鼻疽菌株,并通过细胞和动物实验证实敲除bopA基因后,细菌的细胞侵袭和胞内存活以及体内定殖能力都显著降低。【结论】利用同源重组成功构建类鼻疽bopA基因敲除株,为深入研究该基因的作用靶点奠定了实验基础。 展开更多

关键词 类鼻疽伯克霍尔德菌 bopA基因 基因敲除 生物学特征

原文传递

具核梭杆菌介导MUC1在结直肠癌中差异表达的验证 被引量：1

9

作者 叶新力 李静 +6 位作者 唐彬 兰远志 罗华星 卢晓雪 向媛媛 张艳 曾冬竹 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第15期1501-1506,F0003,共7页

目的通过生物信息学分析具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum,F. nucleatum,Fn.)对结直肠癌(colorectal cancer,CRC)差异表达基因(differential expression genes,DEGs)的调控作用,鉴定关键基因在F. nucleatum感染结直肠癌细胞中的表达... 目的通过生物信息学分析具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum,F. nucleatum,Fn.)对结直肠癌(colorectal cancer,CRC)差异表达基因(differential expression genes,DEGs)的调控作用,鉴定关键基因在F. nucleatum感染结直肠癌细胞中的表达。方法利用GEO数据库高通量筛选F. nucleatum诱导的结直肠癌差异表达基因;基因本体论(GO),京都基因和基因组百科全书(KEGG)富集分析差异表达基因数据集;Cytoscape软件构建差异表达基因的蛋白质-蛋白质相互作用网络(PPI);RT-qPCR和Western blot验证关键(Hub)基因MUC1在细胞模型中的转录水平和蛋白水平表达。结果共筛选出118个DEGs,其中20个表达上调,98个下调;GO分析显示DEGs在质膜和质膜的组成部分等细胞成分中富集最显著,KEGG分析发现其在PI3K-Akt、MAPK、Rap1和JAK-STAT等信号通路中有明显富集(P<0.05)。在PPI网络中,Hub基因MUC1具有较高的中心性得分,F. nucleatum感染与MUC1的差异表达显著相关。结论通过对关键基因的筛选和验证,F. nucleatum感染致CRC的机制可能与MUC1的过表达有关。 展开更多

关键词 结直肠癌 具核梭杆菌 MUC1 差异表达基因

下载PDF 职称材料

1例复发类鼻疽的病原学鉴定及生物学特性研究 被引量：1

10

作者 杨文波 张纳安 +7 位作者 饶承龙 夏瑀培 章美娟 李骁 闫晶敏 陈海 李倩 毛旭虎 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第22期2441-2448,共8页

目的通过对1例复发类鼻疽进行系统病原学鉴定及生物学特性研究,分析和探讨类鼻疽菌长期滞留机体可能的适应宿主机制。方法对临床收集的来源于同一个患者时隔5年分离到的两株类鼻疽菌,进行微生物学鉴定、全基因组测序,并使用相关软件对... 目的通过对1例复发类鼻疽进行系统病原学鉴定及生物学特性研究,分析和探讨类鼻疽菌长期滞留机体可能的适应宿主机制。方法对临床收集的来源于同一个患者时隔5年分离到的两株类鼻疽菌,进行微生物学鉴定、全基因组测序,并使用相关软件对测序数据进行多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)、同源比对进化树、单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)以及插入缺失(insertion-deletion,Indel)分析;进一步在感染肺上皮A549细胞模型中比较感染不同时间细胞内细菌载量变化;双向电泳-质谱技术分析两株细菌在蛋白水平的表达变化。结果分离到的两株类鼻疽菌,全基因组均约7.12 Mb,COG功能注释编码蛋白大致约5 000个;MLST分型均为ST58型;同源比对进化树分析显示它们位于同一分支且与其他分离自中国的类鼻疽菌亲缘关系较近;SNP/Indel分析显示复发株有114个SNP位点、55个Indel位点;与原发株相比,双向电泳-质谱结果表明复发株共有68个蛋白的表达水平发生了显著的变化;同时复发株感染A549后细胞内细菌载量明显增加(P<0.05)。结论以上复发菌株的基因组学、蛋白组学以及胞内感染增殖能力的系统研究提示类鼻疽菌可能在机体长期的选择压力下微进化,通过对细菌基因转录表达、分泌系统、耐药以及能量代谢等方面的调控更加适应其在宿主体内的生存而实现长期滞留。 展开更多

关键词 类鼻疽菌 复发 全基因组 差异蛋白

下载PDF 职称材料

荧光标记类鼻疽菌的构建及其与宿主细胞相互作用的应用研究

11

作者 陈建高 饶承龙 +5 位作者 刘文正 吴潘 王旭冉 南栋琪 杨文波 毛旭虎 《陆军军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第20期2105-2112,共8页

目的构建类鼻疽菌(Burkholderia pseudomallei,B.pseudomallei)的荧光示踪载体,获得自发荧光的类鼻疽菌株,并对其与宿主相互作用的感染过程进行初步应用研究。方法采用基因重组技术,将绿色、红色和蓝色荧光蛋白(green/red/blue fluoresc... 目的构建类鼻疽菌(Burkholderia pseudomallei,B.pseudomallei)的荧光示踪载体,获得自发荧光的类鼻疽菌株,并对其与宿主相互作用的感染过程进行初步应用研究。方法采用基因重组技术,将绿色、红色和蓝色荧光蛋白(green/red/blue fluorescent protein,GFP/RFP/BFP)基因分别重组到原核表达载体pUCP28T上,构建类鼻疽菌组成型荧光表达载体,并通过体外细菌培养观察外源性荧光蛋白的表达对细菌生长能力的影响,以及荧光标记细菌遗传稳定性的检测。通过炎症因子IL-8的检测评价荧光标记细菌对宿主细胞感染能力的变化。利用活细胞工作站观察类鼻疽菌被宿主细胞自噬体包裹的动态过程。结果构建了三种荧光标记的类鼻疽菌示踪载体,并且能在体外传代20代内稳定表达,且外源性荧光蛋白的表达不影响类鼻疽菌的生长和对宿主细胞的感染。同时,利用高分辨率活细胞成像系统观察到红色荧光标记的类鼻疽菌与宿主细胞GFP-LC3共定位的动态变化过程。结论本文成功构建了三种荧光标记的类鼻疽菌,以期为类鼻疽菌致病机制的研究、抗菌药物的筛选提供重要实用工具。 展开更多

关键词 类鼻疽菌 基因重组 荧光标记 自噬

下载PDF 职称材料

类鼻疽杆菌Ⅵ型分泌系统蛋白Hcp1的重组表达及免疫学性质鉴定 被引量：4

12

作者 章美娟 胡治强 +6 位作者 夏瑀培 袁思琪 闫晶敏 饶承龙 李倩 杨文波 毛旭虎 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第23期2296-2301,共6页

目的重组表达类鼻疽杆菌Ⅵ型分泌系统溶血素共调节蛋白1(hemolysin coregulated protein 1,Hcp1),并对其免疫学性质进行鉴定。方法利用DNA重组技术以pET-28a表达系统在E.coli BL21(DE3)中重组表达Hcp1;通过亲和层析制备高纯度Hcp1蛋白;... 目的重组表达类鼻疽杆菌Ⅵ型分泌系统溶血素共调节蛋白1(hemolysin coregulated protein 1,Hcp1),并对其免疫学性质进行鉴定。方法利用DNA重组技术以pET-28a表达系统在E.coli BL21(DE3)中重组表达Hcp1;通过亲和层析制备高纯度Hcp1蛋白;采用腹腔注射免疫小鼠制备抗Hcp1血清,ELISA检测抗体滴度,免疫印迹及免疫荧光分析抗体的免疫反应性。结果成功获得纯度达95%的重组Hcp1蛋白,该蛋白免疫小鼠后获得的抗血清具有较好的特异性和较高的抗体滴度(1∶512000),表现出良好的免疫原性和免疫反应性。结论成功制备了具有生物学活性的Hcp1重组蛋白及其抗血清。 展开更多

关键词 类鼻疽杆菌 Ⅵ型分泌系统蛋白 溶血素共调节蛋白1 重组表达

下载PDF 职称材料

类鼻疽杆菌Ⅲ型分泌系统BPSS1617蛋白的重组表达及其抗体制备

13

作者 吴利 黎礼达 +10 位作者 胡艺 黎元莉 陈海 朱雄 胡治强 马腾飞 韩丹 李倩 曹刘素 尹小毛 毛旭虎 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第18期1663-1667,共5页

目的构建重组表达类鼻疽杆菌Ⅲ型分泌系统蛋白BPSS1617,并制备其抗体。方法采用PCR扩增BPSS1617全长序列,克隆至原核表达载体p ET-22b,将重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,免疫新西兰兔,制备其多克隆抗体,并通过Weste... 目的构建重组表达类鼻疽杆菌Ⅲ型分泌系统蛋白BPSS1617,并制备其抗体。方法采用PCR扩增BPSS1617全长序列,克隆至原核表达载体p ET-22b,将重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,免疫新西兰兔,制备其多克隆抗体,并通过Western blot、免疫荧光和ELISA检测抗体的特异性,并分析该蛋白在类鼻疽杆菌中的亚细胞定位。结果成功扩增类鼻疽杆菌BPC006株基因组中的BPSS1617基因;酶切和测序验证重组表达质粒p ET-22b-BPSS1617构建成功;经IPTG诱导表达、包涵体洗涤、纯化以及变性复性,成功获得纯度>95%,分子量为25×103的目的蛋白;将纯化的BPSS1617重组蛋白免疫新西兰兔,获得抗BPSS1617蛋白多克隆抗体,经实验验证其特异性良好;同时BPSS1617蛋白主要定位于类鼻疽杆菌的细胞质中。结论成功构建、表达、纯化获得BPSS1617蛋白,并成功制备了其特异性多克隆抗体,并且该蛋白定位于类鼻疽杆菌的细胞质中。 展开更多

关键词 类鼻疽杆菌 蛋白表达 抗体制备与鉴定

下载PDF 职称材料

类鼻疽杆菌通过抑制自噬调控HepG2细胞胞内脂质代谢 被引量：2

14

作者 唐梦灵 胡治强 +5 位作者 袁思琪 饶承龙 张雨 谢建平 李倩 毛旭虎 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第18期1722-1729,共8页

目的探讨类鼻疽杆菌感染HepG2细胞后诱导的自噬抑制对胞内脂质代谢的调控作用。方法类鼻疽杆菌感染HepG2细胞6、12、24 h为感染组,以未感染组作为对照。激光共聚焦显微镜观测各组细胞内脂滴和GFP-自噬点的数量;定量试剂盒检测各组细胞... 目的探讨类鼻疽杆菌感染HepG2细胞后诱导的自噬抑制对胞内脂质代谢的调控作用。方法类鼻疽杆菌感染HepG2细胞6、12、24 h为感染组,以未感染组作为对照。激光共聚焦显微镜观测各组细胞内脂滴和GFP-自噬点的数量;定量试剂盒检测各组细胞内甘油三酯及胆固醇水平;Western blot检测各组细胞中自噬相关蛋白LC3Ⅱ、p62表达水平。利用自噬抑制剂3-MA、Baf-A1以及自噬激活剂Rapa处理细胞,检测改变宿主细胞自噬水平后,对类鼻疽杆菌感染HepG2细胞后胞内脂质代谢的影响;外源加入游离脂肪酸三醋酸甘油酯,通过细菌胞内计数实验检测类鼻疽杆菌胞内存活情况。结果类鼻疽杆菌感染HepG2细胞6、12、24 h后,与未感染组比较,胞内脂滴数量增多,脂质成分甘油三酯和胆固醇水平也随感染时间延长逐渐升高,且在感染24 h后达到最高水平(P<0.01);自噬检测发现,与未感染组比较,LC3Ⅱ蛋白表达随感染时间逐渐下降,p62蛋白表达水平随感染时间逐渐蓄积,胞内自噬小体的数量也随感染时间逐渐减少,且感染24 h后数量最低(P<0.01),提示类鼻疽杆菌感染HepG2细胞后自噬受抑;使用自噬抑制剂3-MA、Baf-A1以及自噬激活剂Rapa处理细胞后,与对照组比较,抑制自噬导致胞内脂质蓄积加重(P<0.01),而激活自噬可以减轻胞内脂质的蓄积(P<0.01);此外,外源补充三醋酸甘油酯促进宿主细胞脂质代谢速率能明显降低类鼻疽杆菌胞内存活量(P<0.01)。结论类鼻疽杆菌感染HepG2细胞后,通过诱导自噬抑制调控HepG2细胞胞内脂质代谢。 展开更多

关键词 类鼻疽杆菌 HEPG2细胞 自噬 脂代谢

下载PDF 职称材料