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乳鼠志贺杆菌分泌蛋白GroEL多克隆抗体的制备与鉴定
1
作者 刘梦琦 贾雪娇 +4 位作者 刘洋 刘长城 李小凤 胡屹硕 赵微 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2024年第2期137-143,共7页
目的制备志贺杆菌分泌蛋白GroEL多克隆抗体,为探究乳鼠志贺杆菌上清蛋白GroEL在乳鼠肠道内的功能奠定基础。方法利用分子克隆技术构建原核表达蛋白质粒Pet28a(+)-GroEL,转化Escherichia coil BL21(DE3)后采用不同浓度IPTG诱导表达,优化... 目的制备志贺杆菌分泌蛋白GroEL多克隆抗体,为探究乳鼠志贺杆菌上清蛋白GroEL在乳鼠肠道内的功能奠定基础。方法利用分子克隆技术构建原核表达蛋白质粒Pet28a(+)-GroEL,转化Escherichia coil BL21(DE3)后采用不同浓度IPTG诱导表达,优化诱导时间和温度,确定最佳蛋白表达条件;利用His标签亲和层析法纯化GroEL蛋白。将纯化蛋白与佐剂按照等比例充分混合后免疫C57BL/6小鼠,制备多克隆抗体血清,采用ELISA检测血清抗体的效价、灵敏度及特异性。构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-GroEL并转染293T细胞,48 h后采用制备的GroEL多克隆抗体进行Western blot验证。结果Pet28a(+)-GroEL转化E.coil BL21(DE3)菌在28℃、0.4 mmol/L IPTG诱导12h获得最佳蛋白表达,表达的重组蛋白分子质量约为63 ku,纯化后的蛋白浓度为0.735 mg/mL。Western blot检测显示该蛋白能被抗His标签鼠单克隆抗体识别。ELISA检测显示制备的抗GroEL多克隆抗体血清效价为1∶128000;Western blot检测显示该抗体可识别GroEL蛋白。结论重组表达的GroEL蛋白具有抗原性,制备的鼠抗GroEL多克隆抗体血清具有特异性且效价高,为研究乳鼠志贺杆菌GroEL蛋白与肠道病毒之间的作用机制奠定了基础。 展开更多
关键词 志贺菌 GroEL蛋白 蛋白纯化 多克隆抗体制备 轮状病毒
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志贺氏杆菌分泌蛋白Dnak的表达纯化与多克隆抗体的制备及应用
2
作者 贾雪娇 刘梦琦 +7 位作者 刘洋 刘长城 李小凤 胡屹硕 李香雨 李润林 李永刚 赵微 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第3期236-242,共7页
目的表达轮状病毒感染的乳鼠体内志贺氏杆菌分泌蛋白Dnak(Hsp70),并制备Dnak多克隆抗体。方法以提取的志贺氏杆菌基因组为模板PCR扩增Dnak片段,与pET-24a(+)和PCDNA3.1分别连接构建原核表达质粒pET24a(+)-Dnak和真核表达质粒PCDNA3.1-Dn... 目的表达轮状病毒感染的乳鼠体内志贺氏杆菌分泌蛋白Dnak(Hsp70),并制备Dnak多克隆抗体。方法以提取的志贺氏杆菌基因组为模板PCR扩增Dnak片段,与pET-24a(+)和PCDNA3.1分别连接构建原核表达质粒pET24a(+)-Dnak和真核表达质粒PCDNA3.1-Dnak;pET24a(+)-Dnak原核表达质粒转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,经镍柱纯化Dnak蛋白。以纯化后的重组蛋白为免疫原免疫C57BL/6小鼠制备多克隆抗体,采用间接ELISA检测效价,Western Blot法检测灵敏度和特异性。利用制备的多克隆抗体在GST Pull-down实验中检测Dnak与轮状病毒非结构蛋白Nsp2的相互作用。真核表达质粒PCDNA3.1-Dnak转染至HEK293T细胞,以制备的DnaK多克隆抗体为一抗,Western blot法检测Dnak在细胞中的表达。利用MEGA11及Genedoc软件分析此志贺氏杆菌与志贺菌属其他细菌Dnak氨基酸序列同源性。结果重组质粒pET24a(+)-Dnak与PCDNA3.1-Dnak经测序比对包含与此志贺氏杆菌(Shigella:PRJNA804371)序列一致的基因,证明质粒构建成功。诱导表达的重组Dnak蛋白主要以可溶性形式存在,相对分子质量约为75 kDa,浓度可达0.62 mg/mL;Dnak鼠多克隆抗体可与重组Dnak蛋白发生特异性反应,效价为1∶32000,至少可以在1∶6000稀释度下检测到Dnak蛋白。GST Pull-down实验可以检测到Dnak与轮状病毒非结构蛋白Nsp2发生相互作用。转染PCDNA3.1-Dnak重组质粒的HEK293T细胞可以表达Dnak蛋白。经MEGA11和Genedoc软件比对PRJNA804371株与宋内志贺菌(Shigella sonnei)、痢疾志贺菌(Shigella dysenteriae)、鲍氏志贺菌(Shigella boydii)、福氏志贺菌(Shigella flexneri)Dnak氨基酸序列同源性较高。结论成功表达志贺氏杆菌Dnak蛋白,具有良好反应性与免疫原性;制备的鼠多克隆抗体效价及灵敏度较高可满足后续实验需要。 展开更多
关键词 志贺氏杆菌 DNAK 蛋白表达与纯化 多克隆抗体 轮状病毒
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粪肠球菌在体外细胞模型和乳鼠轮状病毒感染模型中对轮状病毒SA11株复制的抑制作用 被引量：1
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作者 刘洋 于美玲 +5 位作者 程美慧 刘长城 贾雪娇 刘梦琦 李永刚 赵微 《吉林大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2023年第1期131-138,共8页
目的:探讨加入粪肠球菌后轮状病毒SA11株在体内和体外的复制情况,为阐明粪肠球菌影响轮状病毒感染提供依据。方法:体外实验,将108~1012 CFU·mL^(-1)粪肠球菌进行10倍浓度梯度稀释,与Caco-2细胞共培养12、18、24、30和48 h,同时设... 目的:探讨加入粪肠球菌后轮状病毒SA11株在体内和体外的复制情况,为阐明粪肠球菌影响轮状病毒感染提供依据。方法:体外实验,将108~1012 CFU·mL^(-1)粪肠球菌进行10倍浓度梯度稀释,与Caco-2细胞共培养12、18、24、30和48 h,同时设对照组(Caco-2细胞感染轮状病毒后不加入粪肠球菌),采用CCK-8法检测不同浓度粪肠球菌作用后各组Caco-2细胞存活率;感染复数(MIO)值为0.1的轮状病毒作用于Caco-2细胞1 h后加入108~1012 CFU·mL^(-1)粪肠球菌培养18 h,同时设对照组,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测各组Caco-2细胞中轮状病毒VP6基因拷贝数,免疫荧光灶法检测各组Caco-2细胞中轮状病毒滴度。体内实验,采用18窝4~5日龄SPF级昆明系乳鼠,相同窝数随机分为对照组、抗生素处理组和粪肠球菌移植组,抗生素处理组和粪肠球菌移植组乳鼠先用四联抗生素灌胃3 d耗竭其肠道菌群,然后3组乳鼠开始每日灌胃107 FFU·mL^(-1)轮状病毒100μL,持续8 d,粪肠球菌移植组乳鼠在灌胃病毒同时灌胃1010 CFU·mL^(-1)粪肠球菌100μL,收取病毒感染第2、4、6和8天各组乳鼠粪便,RT-qPCR法检测各组乳鼠粪便中轮状病毒拷贝数。结果:体外实验,CCK-8法检测,与对照组比较,不同浓度粪肠球菌作用48 h内各组Caco-2细胞存活率均有不同程度升高,表明粪肠球菌在该浓度范围内对Caco-2细胞无毒性;RT-qPCR法检测,与对照组比较,1010、1011和1012 CFU·mL^(-1)粪肠球菌组Caco-2细胞中轮状病毒VP6基因拷贝数分别降低了75.8%、99.9%和99.9%(P<0.05);免疫荧光灶法检测,与对照组比较,108、1010和1012 CFU·mL^(-1)粪肠球菌组Caco-2细胞中轮状病毒滴度分别降低13%、77%和100%(P<0.05)。体内实验,与对照组比较,粪肠球菌移植组乳鼠粪便中病毒基因拷贝数明显减少(P<0.05)。结论:在体外细胞模型和乳鼠感染轮状病毒模型中粪肠球菌对轮状病毒的复制均发挥抑制作用。 展开更多
关键词 粪肠球菌 轮状病毒 菌群移植 益生菌
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轮状病毒感染致腹泻乳鼠模型粪便中志贺杆菌的分离、鉴定及其对人克隆结肠腺癌细胞中紧密连接蛋白表达的影响 被引量：2
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作者 于美玲 陆恒章 +3 位作者 陶晓莉 程美慧 李永刚 赵微 《吉林大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2021年第5期1221-1228,共8页
目的:探讨密封蛋白1(Claudin-1)和闭合蛋白(Occludin)在志贺杆菌感染的人克隆结肠腺癌细胞(Caco-2)中的表达情况,阐明志贺杆菌对人克隆结肠腺癌Caco-2细胞的影响及其相关机制。方法:将10窝SPF级昆明系5日龄乳鼠分为对照组乳鼠5窝和实验... 目的:探讨密封蛋白1(Claudin-1)和闭合蛋白(Occludin)在志贺杆菌感染的人克隆结肠腺癌细胞(Caco-2)中的表达情况,阐明志贺杆菌对人克隆结肠腺癌Caco-2细胞的影响及其相关机制。方法:将10窝SPF级昆明系5日龄乳鼠分为对照组乳鼠5窝和实验组乳鼠5窝,对照组乳鼠每天每只灌胃PBS缓冲液100μL,实验组乳鼠每天每只灌胃病毒滴度为1×10^(6) PFU·mL^(-1) SA11株轮状病毒100μL,采集乳鼠粪便标本通过生化实验、血清学检测及16S rRNA测序,进行志贺杆菌的分离和鉴定。将Caco-2细胞分为对照组和志贺杆菌感染组,采用不同浓度梯度的志贺杆菌感染Caco-2细胞不同时间后,台盼蓝染色检测各组细胞存活率,Real-timePCR和Westernblotting法检测各组细胞中Claudin-1和OccludinmRNA及蛋白表达水平。结果:细菌生化鉴定可观察到双糖铁培养基斜面不变色,底部为黄色,且穿刺线明显,疑似致病性肠道菌。该菌对乳糖呈阴性,对葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和甘露醇呈阳性。16S rRNA测序,与志贺杆菌序列同源性为99%,确定为志贺杆菌。与对照组比较,志贺杆菌感染组志贺杆菌感染4 h内细胞存活率差异无统计学意义(P>0.05):与1×10^(6) CFU·mL^(-1)志贺杆菌共培养3 h时,Caco-2细胞中Claudin-1和Occludin mRNA及蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。结论:通过轮状病毒感染致腹泻乳鼠模型粪便中分离的志贺杆菌可降低人克隆Caco-2中Occludin和Claudin-l的表达水平,提高肠上皮细胞的通透性,从而影响肠上皮细胞的正常屏障功能。 展开更多
关键词 志贺杆菌 CACO-2细胞 密封蛋白1 闭合蛋白
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