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链重叠PCR构建抗HIV免疫毒素及其表达与鉴定 被引量：3
1
作者 金洪涛 金宁一 +3 位作者 李臻 李昌 付延军 王宏 《免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第1期94-96,共3页
目的提高抗HIV免疫毒素DT-ScFv原核表达的可溶性与生物活性。方法利用链重叠PCR融合的方法,构建了免疫毒素DT-ScFv,二者之间添加了connector序列,免疫毒素基因PCR连接测序以后,将其克隆入pET28a质粒,在BL21(DE3)工程菌中诱导表达,通过... 目的提高抗HIV免疫毒素DT-ScFv原核表达的可溶性与生物活性。方法利用链重叠PCR融合的方法,构建了免疫毒素DT-ScFv,二者之间添加了connector序列,免疫毒素基因PCR连接测序以后,将其克隆入pET28a质粒,在BL21(DE3)工程菌中诱导表达,通过免疫印迹鉴定表达的重组蛋白,并通过与表达HIV-1gp120的靶细胞的间接免疫荧光实验,验证免疫毒素的细胞识别结合能力。结果本研究成功地构建了免疫毒素DT-ScFv,经原核表达证明目的蛋白以部分可溶的形式存在于表达菌中,添加的connector序列有助于DT-ScFv在细胞中获得正确折叠,重组免疫毒素能与表达gp120的细胞发生特异性的识别结合。结论利用链重叠PCR融合的方法,添加connector序列,有助于提高免疫毒素表达的可溶性与生物活性。本研究对抗HIV免疫毒素的活性研究与应用研究具有重要的意义。 展开更多
关键词 免疫毒素 链重叠PCR 原核表达
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HIV-1 Gag蛋白酵母表达产物的纯化及免疫原性检测
2
作者 江文正 金宁一 +2 位作者 李子健 张立树 张洪勇 《免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2004年第4期307-309,共3页
目的　纯化HIV 1Gag蛋白 ,并检测其免疫原性。方法　将表达HIV 1Gag蛋白的酵母工程菌GS115 /pPICGAG接种到YPD培养基中多次传代后 ,用PCR检测其目的基因。该酵母工程菌在BMMY培养基中经甲醇诱导表达 ,上清液初步浓缩后上柱进行凝胶过滤... 目的　纯化HIV 1Gag蛋白 ,并检测其免疫原性。方法　将表达HIV 1Gag蛋白的酵母工程菌GS115 /pPICGAG接种到YPD培养基中多次传代后 ,用PCR检测其目的基因。该酵母工程菌在BMMY培养基中经甲醇诱导表达 ,上清液初步浓缩后上柱进行凝胶过滤层析 ,并将纯化蛋白免疫Balb/c小鼠 ,检测其血清抗体水平。结果　该酵母工程菌经多次传代后外源基因不丢失。Westernblot检测结果表明纯化蛋白具有很好的反应原性 ,其纯度可达 85 %。纯化蛋白免疫小鼠后可诱导特异性抗体产生。结论　表达HIV 1Gag蛋白的酵母工程菌具有很好的遗传稳定性 。 展开更多
关键词 HIV-1 GAG 毕赤酵母 纯化 免疫原性
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HIV-1Gag-gp120嵌合基因在重组杆状病毒系统中的嵌合表达
3
作者 张东威 金宁一 《中国实用医药》 2009年第35期29-30,共2页
将中国株HIV-1B亚型gag基因序列克隆到杆状病毒表达载体pFASTBAC1中,将gp120基因以相同的读框克隆到gag基因的3/端下游,构建了重组表达质粒pFge,利用大肠杆菌埃希菌杆状病毒表达系统筛选重组杆状病毒,在昆虫细胞sf9中表达了HIV-1的Gag-g... 将中国株HIV-1B亚型gag基因序列克隆到杆状病毒表达载体pFASTBAC1中,将gp120基因以相同的读框克隆到gag基因的3/端下游,构建了重组表达质粒pFge,利用大肠杆菌埃希菌杆状病毒表达系统筛选重组杆状病毒,在昆虫细胞sf9中表达了HIV-1的Gag-gp120嵌合蛋白。 展开更多
关键词 HIV-1嵌合蛋白 表达
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含Apoptin基因重组腺病毒的构建及鉴定 被引量：2
4
作者 陈漉 金宁一 +6 位作者 李霄 刘立明 贾鹏 刘妍 高鹏 陆蕴松 迟宝荣 《世界华人消化杂志》 CAS 北大核心 2008年第31期3505-3509,共5页
目的:构建携凋亡素(Apoptin)基因重组腺病毒,为进一步研究Apoptin基因抗肿瘤作用分子机制建立基础.方法:利用BamHⅠ和SpeⅠ双酶切质粒pVAX1-Apoptin,获得Apoptin片段并连接入pacAd5 CMV K-N pA,构建含Apoptin基因的穿梭质粒pacAd5-Apopt... 目的:构建携凋亡素(Apoptin)基因重组腺病毒,为进一步研究Apoptin基因抗肿瘤作用分子机制建立基础.方法:利用BamHⅠ和SpeⅠ双酶切质粒pVAX1-Apoptin,获得Apoptin片段并连接入pacAd5 CMV K-N pA,构建含Apoptin基因的穿梭质粒pacAd5-Apoptin.利用PacⅠ单酶切对pacAd5-Apoptin和腺病毒基因组质粒(pAd5)进行线性化处理后应用脂质体介导法共转染AAV-293细胞,分别利用蚀斑纯化和RT-PCR、Western blot等方法对重组病毒进行筛选和鉴定,并测定所获得重组病毒的滴度.结果:所构建重组腺病毒中的Apoptin基因得到了正确转录,表达产物的相对分子质量约为13kDa,与CVA阳性对照一致;所获得重组腺病毒可有效表达Apoptin蛋白,该蛋白与CAV阳性血清具有反应原性,重组病毒滴度为1011PFU/L.结论:成功构建含Apoptin基因的重组腺病毒,所获得重组病毒的滴度可以满足体内外实验要求. 展开更多
关键词 Apoptin基因 腺病毒载体 基因治疗 逆转 录-聚合酶链反应 免疫印迹法
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口蹄疫三价重组鸡痘病毒疫苗免疫原性研究
5
作者 马鸣潇 金宁一 +6 位作者 尹革芬 鲁会军 李昌 金扩世 田明尧 金明兰 曲祖乙 《免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第6期676-679,共4页
目的对本室已经筛选到的共表达O型、A型和Asia1型FMDV复合多表位免疫原基因OAAT与猪IL-18基因的重组鸡痘病毒vUTA-IL18-OAAT的免疫原性进行研究。方法分别用重组病毒毒vUTA-IL18-OAAT、FPV疫苗株和PBS溶液进行小鼠免免疫,每间隔14d加强... 目的对本室已经筛选到的共表达O型、A型和Asia1型FMDV复合多表位免疫原基因OAAT与猪IL-18基因的重组鸡痘病毒vUTA-IL18-OAAT的免疫原性进行研究。方法分别用重组病毒毒vUTA-IL18-OAAT、FPV疫苗株和PBS溶液进行小鼠免免疫,每间隔14d加强免疫1次,第3次免疫后10d杀鼠取血清和脾淋巴细胞检测抗体、T淋巴细胞亚群的数量及CTL活性。结果小鼠免疫试验结果表明,与阴性对照组相比,vUTA-IL18-OAAT免疫组的T细胞亚类数量、CTL杀伤活性,抗O型、A型和Asia1型FMDV的特异性抗体水平差异显著。结论vUTA-IL18-OAAT能有效激发机体的细胞和体液免疫反应。 展开更多
关键词 重组鸡痘病毒 口蹄疫病毒 vUTA-IL18-OAAT 免疫原性
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高致病性禽流感的流行及其预防控制 被引量：10
6
作者 金宁一 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第1期5-12,共8页
禽流行性感冒（简称禽流感，Avian influenza，AI）也称禽流感综合征，是由A型流感病毒（Avian influenza vires，AIV）引起的急性、高度致死性、烈性传染病。该病已被列入国际生物武器公约动物类传染病名单。AIV依据其外膜血凝素（Hema... 禽流行性感冒（简称禽流感，Avian influenza，AI）也称禽流感综合征，是由A型流感病毒（Avian influenza vires，AIV）引起的急性、高度致死性、烈性传染病。该病已被列入国际生物武器公约动物类传染病名单。AIV依据其外膜血凝素（Hemagglutinin，H）和神经氨酸酶（Neuraminidase，N）抗原性的不同，目前至少可分为15个H亚型（H1～H15）和9个N亚型（N1-N9）。由H5和H7亚型毒株（以H5N1和H7N7为代表）所引起的禽类疾病称为高致病性禽流感（Highly pathogenic avian influenza，HeM），其发病率和病死率都很高，危害极大。 展开更多
关键词 高致病性禽流感 预防控制 烈性传染病 禽流行性感冒 A型流感病毒 亚型毒株 流感综合征 神经氨酸酶 生物武器 禽类疾病
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表达PRRS病毒GP5、GP3和猪IL-18的核酸疫苗的构建及实验免疫研究 被引量：10
7
作者 沈国顺 金宁一 +4 位作者 秦晓光 尹荣兰 庄天中 马鸣潇 郑敏 《免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第6期629-634,共6页
目的获得安全有效的防治PRRSV核酸疫苗。方法采用RT-PCR方法扩增了PRRSV长春分离株ORF5、ORF3基因,并将其插入真核表达载体pVAX1、pVIR-IL-18的CMV启动子下游,构建成真核表达质粒pVAX1-ORF5-ORF3和pVIR-IL18-ORF5-ORF3,通过Westernblot... 目的获得安全有效的防治PRRSV核酸疫苗。方法采用RT-PCR方法扩增了PRRSV长春分离株ORF5、ORF3基因,并将其插入真核表达载体pVAX1、pVIR-IL-18的CMV启动子下游,构建成真核表达质粒pVAX1-ORF5-ORF3和pVIR-IL18-ORF5-ORF3,通过Westernblot及IFA等检测目的基因表达产物。同时进行了Balb/c小鼠免疫试验,检测免疫后小鼠的ELISA抗体水平和脾T淋巴细胞亚群数量。结果所构建的2个重组DNA疫苗质粒在真核细胞能进行有效的转录,并表达了目的蛋白(GP5、GP3)。pVIR-IL18-ORF5-ORF3免疫组的小鼠的ELISA抗体水平高于pVAX1-ORF5-ORF3和PRRS灭活苗免疫组,但差异不显著。CD8+T淋巴细胞亚群数量显著高于pVAX1-ORF5-ORF3和PRRS灭活苗组。结论IL-18对猪的细胞免疫功能具有明显的促进作用。 展开更多
关键词 PRRSV病毒 ORF5/ORY3基因 核酸疫苗 免疫
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H3、H5、H7、H9亚型流感病毒通用多表位重组鸡痘病毒构建 被引量：8
8
作者 陈义锋 金宁一 +7 位作者 贾雷立 鲁会军 南文龙 田明尧 陈晓月 马海利 马鸣潇 刘成宏 《免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第5期524-527,共4页
目的构建表达H3、H5、H7、H9亚型流感病毒通用多表位重组鸡痘病毒活载体疫苗候选株。方法筛选流感病毒主要抗原(HANANPM)优势抗原表位基因,以生物信息学软件优化其排列结构合成流感多表位基因(Epi),以H5、H7HA融合表达基因为骨架,将多... 目的构建表达H3、H5、H7、H9亚型流感病毒通用多表位重组鸡痘病毒活载体疫苗候选株。方法筛选流感病毒主要抗原(HANANPM)优势抗原表位基因,以生物信息学软件优化其排列结构合成流感多表位基因(Epi),以H5、H7HA融合表达基因为骨架,将多表位基因插入构建H7HA-Epi-H5HA阅读盒,定向克隆至鸡痘病毒表达载体pUTA-2复合启动子(ATI-P7.5×20)下游,构建重组鸡痘病毒中间转移载体pUTA-2-H7HA-Epi-H5HA。应用脂质体介导的转染法,将该重组鸡痘病毒中间转移载体与282E4株鸡痘病毒共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),经BrdU进行3次加压筛选挑斑纯化后传代,并对重组以鸡痘病毒进行PCR和IFA检测和Western blot分析。结果成功构建了重组鸡痘病毒中间转移载体pUTA-2-H7HA-Epi-H5HA,PCR、IFA和Western blot检测阳性。结论筛选出稳定共表达H5H7HA基因和通用多表位基因的重组鸡痘病毒vUTA2-H7HA-Epi-H5HA株,该重组鸡痘病毒的构建为跨种通用型流感病毒活载体疫苗的研究奠定了物质基础。 展开更多
关键词 重组鸡痘病毒 多表位基因(Epi) 构建
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口蹄疫病毒三价复合多表位佐剂DNA疫苗构建及其免疫原性 被引量：6
9
作者 马鸣潇 金宁一 +4 位作者 尹革芬 鲁会军 李昌 金扩世 曲祖乙 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第4期514-519,共6页
以O型、A型口蹄疫病毒(FMDV)结构蛋白VP1全基因和AsiaI型FMDV两个基因拓扑型的结构蛋白VP1基因上的5个抗原表位基因作为主要免疫原基因,以来源于非结构蛋白3ABC和结构蛋白VP4上的3个Th2细胞表位基因作为辅助基因,构建了O型、A型和Asia1... 以O型、A型口蹄疫病毒(FMDV)结构蛋白VP1全基因和AsiaI型FMDV两个基因拓扑型的结构蛋白VP1基因上的5个抗原表位基因作为主要免疫原基因,以来源于非结构蛋白3ABC和结构蛋白VP4上的3个Th2细胞表位基因作为辅助基因,构建了O型、A型和Asia1型FMDV复合多表位基因工程疫苗表达盒OAAT,在此基础上,以金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)为基因佐剂,通过分子设计构建了SEA与OAAT融合表达基因。将构建好的表达盒OAAT与SEA融合表达基因克隆至真核表达载体PVAX1PCMV启动子下游,构建了口蹄疫三价基因佐剂DNA疫苗pEA。经Western blotting和IFA检测,目的蛋白在Hela细胞中获得正确表达。小鼠免疫实验表明,pA和pEA免疫组的血清抗体均能分别与O型、A型和AsiaI抗原反应,与对照组相比差异较显著,且pEA免疫组和灭活疫苗免疫组抗体水平均显著高于pA免疫组;同时pA和pEA免疫小鼠细胞因子IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-10较对照组显著提高,且pEA免疫组的IL-2、IFN-γ和IL-4水平明显高于pA免疫组。用O/NY00和Asia1/YNBS/58株FMDV进行豚鼠攻毒免疫保护试验,结果表明O型和Asia1型FMDV二联灭活疫苗免疫组均获得完全保护,pA免疫组均获得2/4保护,pEA免疫组均获得3/4保护,而pVAX1和PBS免疫组完全没有保护。实验结果表明,SEA与OAAT融合表达蛋白具有较好免疫原性,且SEA可以作为DNA疫苗的有效基因佐剂。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒 金黄色葡萄球菌肠毒素A SEA DNA疫苗
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新出现人兽共患传染病与人类健康
10
作者 金宁一 《动物保健》 2006年第7期27-28,42,共3页
关键词 人兽共患传染病 人类健康 20世纪70年代 日本血吸虫病 人类疾病 猪链球菌病 畜牧业生产 布氏杆菌病 死亡病例 狂犬病
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