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Ad-IL-24对人胶质瘤细胞生长抑制效应的体外实验 被引量:12
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作者 单云波 盛伟华 +4 位作者 谢宇锋 刘铁连 井莹莹 胡志清 杨吉成 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第2期279-286,共8页
研究携带人白介素24(IL-24)的腺病毒表达载体(Ad-IL-24)对人U251胶质瘤细胞生长的影响和抗肿瘤分子机制。将不同MOI Ad-IL-24感染U251人胶质瘤细胞后,MTT法检测Ad-IL-24对U251细胞生长的抑制作用,流式细胞仪和Hochest染色法检测细胞的... 研究携带人白介素24(IL-24)的腺病毒表达载体(Ad-IL-24)对人U251胶质瘤细胞生长的影响和抗肿瘤分子机制。将不同MOI Ad-IL-24感染U251人胶质瘤细胞后,MTT法检测Ad-IL-24对U251细胞生长的抑制作用,流式细胞仪和Hochest染色法检测细胞的凋亡率。RT-PCR检测bcl-2、bax、ICE、C-myc、HIF-1α和p53等基因的转录表达水平,Western blotting检测Cleaved Caspase-3的表达。结果表明100 MOI Ad-IL-24感染U251细胞后能明显抑制细胞生长,并能明显诱导细胞凋亡,感染72 h后细胞凋亡率可达42%,感染4 d后细胞生长抑制率可达50%。RT-PCR检测发现Ad-IL-24能引起与细胞凋亡和血管形成相关基因bax/bcl-2、ICE、C-myc、p53的上调和HIF-1α的下调,并促进Caspase-3的活化。本研究结果显示Ad-IL-24能明显抑制人胶质瘤细胞U251生长和诱导细胞凋亡,其抗肿瘤机制可能与通过bax/bcl-2、ICE、c-myc、p53的上调和HIF-1α的下调,进而导致Caspase-3的活化而诱导肿瘤细胞发生凋亡有关。 展开更多
关键词 腺病毒 白介素-24 基因治疗 凋亡
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腺病毒介导的ING4基因对人肺腺癌裸鼠移植瘤的生长抑制作用及其分子机制 被引量:4
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作者 黄锦宏 杨吉成 +3 位作者 凌春华 赵大国 谢宇锋 由振华 《中国肺癌杂志》 CAS 北大核心 2014年第2期142-147,共6页
背景与目的肿瘤生长抑制因子4(inhibitor of growth 4,ING4)基因是一种重要的肿瘤抑制因子,研究发现ING4基因对多种肿瘤细胞具有抑癌作用。本研究旨在探讨ING4基因对人肺腺癌裸鼠移植瘤的生长抑制作用及其潜在的作用机制。方法采用SPC-A... 背景与目的肿瘤生长抑制因子4(inhibitor of growth 4,ING4)基因是一种重要的肿瘤抑制因子,研究发现ING4基因对多种肿瘤细胞具有抑癌作用。本研究旨在探讨ING4基因对人肺腺癌裸鼠移植瘤的生长抑制作用及其潜在的作用机制。方法采用SPC-A1细胞株建立肺腺癌裸鼠移植瘤模型,15只荷瘤裸鼠随机等分为PBS组、腺病毒组(Ad-GFP组)、腺病毒介导的ING4组(Ad-ING4组),上述各组进行局部干预用药,动态测量肿瘤体积,治疗结束后摘取瘤体称重并计算瘤重抑瘤率;脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记(TUNEL)法检测瘤体内细胞凋亡情况,免疫组织化学SP法检测天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、环氧化酶-2(COX-2)、Fas与FasL的表达。结果 Ad-ING4组的肿瘤体积、瘤重均呈现明显下降,与Ad-GFP组抑瘤率(1.31%±0.31%)比较,差异有统计学意义(P<0.05),其抑瘤率为(33.17%±5.24%);Ad-ING4组的凋亡指数为(69.23%±6.53%),与PBS组(17.04%±1.10%)、Ad-GFP组(18.81%±1.93%)比较,差异有统计学意义(P<0.05)。SP法检测结果显示,Ad-ING4可明显上调Caspase-3、Fas与FasL表达,下调COX-2表达。结论 ING4具有抑制肺腺癌裸鼠移植瘤的生长抑制作用,该作用机制可能与诱导肿瘤细胞凋亡有关。 展开更多
关键词 生长抑制因子4 肺肿瘤 移植瘤
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腺病毒载体介导IL-24基因对肺癌细胞的化疗增敏效应 被引量:4
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作者 李畅 赵军 +3 位作者 李印 梁光辉 盛伟华 杨吉成 《苏州大学学报(医学版)》 CAS 2012年第3期322-325,共4页
目的研究携带人IL-24基因腺病毒载体(Ad-IL-24)联用顺铂(DDP)对人非小细胞肺癌NCI-H460细胞生长和凋亡的影响。方法取对数生长期的NCI-H460细胞,MTT比色法检测Ad-IL-24联合DDP对细胞生长的影响,流式细胞仪分析细胞周期及检测细胞凋亡率... 目的研究携带人IL-24基因腺病毒载体(Ad-IL-24)联用顺铂(DDP)对人非小细胞肺癌NCI-H460细胞生长和凋亡的影响。方法取对数生长期的NCI-H460细胞,MTT比色法检测Ad-IL-24联合DDP对细胞生长的影响,流式细胞仪分析细胞周期及检测细胞凋亡率。结果 Ad-IL-24联合DDP对NCI-H460细胞的生长抑制作用和诱导凋亡效应均明显优于单用Ad-IL-24和单用化疗药物DDP,且G2/M期细胞比例显著增加(P<0.05或<0.01)。结论 Ad-IL-24能提高NCI-H460肺癌细胞对化疗药物DDP的敏感性。 展开更多
关键词 腺病毒 人白细胞介素-24 肺癌 基因治疗 顺铂
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IL-24基因修饰增强CIK细胞对HL-60细胞的细胞毒作用 被引量:4
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作者 夏卫 郁心 +5 位作者 王浦南 徐洪卫 陈宇 奚华新 杨吉成 缪竞诚 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第12期1080-1084,共5页
目的:研究IL-24基因修饰的CIK细胞与同源树突状细胞共培养后对白血病细胞的杀伤作用及其机制。方法:从健康人外周血单个核细胞中常规诱导DC和CIK细胞,电穿孔法将IL-24基因导入CIK细胞中(获得细胞为CIK-IL24),RT-PCR和ELISA法检测CIK细胞... 目的:研究IL-24基因修饰的CIK细胞与同源树突状细胞共培养后对白血病细胞的杀伤作用及其机制。方法:从健康人外周血单个核细胞中常规诱导DC和CIK细胞,电穿孔法将IL-24基因导入CIK细胞中(获得细胞为CIK-IL24),RT-PCR和ELISA法检测CIK细胞中IL-24基因的表达,FCM和ELISA法检测转基因前后CIK表型及分泌细胞因子能力的变化,将CIK细胞和同源DC共培养,FCM法检测共培养的DC-CIK细胞对HL-60细胞细胞毒活性的变化。结果:通过电穿孔法成功将IL-24基因导入CIK细胞,与对照组相比,转IL-24基因后CIK细胞中CD3+、CD3+CD56+细胞的比例无明显改变,CD4+CD25+细胞比例显著下降。IL-24可上调CD3+CD56+细胞表面粘附分子CD54、CXCR4的表达,转染IL-24基因后CIK分泌TNF-α和IFN-γ的能力显著增强,与DC共同作用HL-60细胞时转染IL-24基因后的CIK细胞细胞毒活性明显增强。结论:通过IL-24基因修饰,明显增强了CIK细胞对HL-60细胞的杀伤能力,其机制与IL-24促进CIK分泌TNF-αI、FN-γ,上调CIK细胞表面粘附分子的表达,减少CD4+CD25+调节性T细胞比例等密切相关。 展开更多
关键词 人IL-24 CIK细胞 HL-60细胞 细胞毒
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腺病毒介导IL-24-E1A双基因载体的构建及其体外抑制SMMC-7721肝癌细胞生长作用初探 被引量:3
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作者 汪小华 缪竞诚 +3 位作者 谢宇锋 盛伟华 单云波 杨吉成 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第7期1035-1041,共7页
构建IL-24和E1A双基因腺病毒载体,获得Ad-IL-24-E1A重组腺病毒子,分析其体外抑瘤作用。PCR及BglⅡ和SalⅠ酶切获得IL-24,与空载体构建成pAdTrack-IL-24-IRES。XhoI和EcoRV酶切获得E1A片段,与pAdTrack-IL-24-IRES连接后成功构建pAdTrack-... 构建IL-24和E1A双基因腺病毒载体,获得Ad-IL-24-E1A重组腺病毒子,分析其体外抑瘤作用。PCR及BglⅡ和SalⅠ酶切获得IL-24,与空载体构建成pAdTrack-IL-24-IRES。XhoI和EcoRV酶切获得E1A片段,与pAdTrack-IL-24-IRES连接后成功构建pAdTrack-IL-24-IRES-E1A,同源重组、包装和扩增获得Ad-IL-24-E1A重组病毒子。用50MOI重组腺病毒感染SMMC-7721肝癌细胞,MTT法测定Ad-IL-24-E1A的细胞生长抑制作用;流式细胞仪分析细胞凋亡情况。本研究成功获得Ad-IL-24-E1A重组病毒子。与其他组相比,Ad-IL-24-E1A明显抑制肿瘤细胞生长,感染48h后凋亡率达52%,而抑制正常细胞作用不明显。研究提示Ad-IL-24-E1A双基因重组载体明显抑制SMMC-7721肝癌细胞生长。 展开更多
关键词 构建 Ad-IL-24-E1A SMMC-7721肝癌细胞 抑瘤
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IRES/polyA-promoter介导的Ang-1与VEGF165双基因表达效率的对比分析 被引量:2
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作者 陈瑶 缪竞诚 +6 位作者 韩亚丽 盛伟华 包婉蓉 田丽娜 张凤娟 吕海涛 杨吉成 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第12期10-19,共10页
目的:构建IRES及polyA-promoter介导人血管生成素-1(Angiogenin-1,Ang-1)和人血管内皮生长因子165(vascular endothelial growth factor165,VEGF165)双基因共表达的腺病毒载体,比较IRES与polyA-promoter不同表达模式及其对位于二... 目的:构建IRES及polyA-promoter介导人血管生成素-1(Angiogenin-1,Ang-1)和人血管内皮生长因子165(vascular endothelial growth factor165,VEGF165)双基因共表达的腺病毒载体,比较IRES与polyA-promoter不同表达模式及其对位于二者前后基因的表达效率和诱导兔角膜新生血管的形成功能,为今后构建双基因或多基因高效共表达载体提供实验依据。方法:以pAdTrack-CMV-Ang-1-IRES-VEGF165质粒为模板,PCR扩增人VEGF165及Ang-1基因片段,分别将其亚克隆至改建的pAdTrack-CMV-PolyA-promoter及pAdTrack-CMV-IRES转移质粒中,构建pTrack-CMV-Ang-1-polyA-promoter-VEGF165、pTrack-CMV-VEGF165-polyA-promoter-Ang-1、pTrack-CMV-VEGF165-IRES-Ang-1基因重组转移质粒,再与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1在BJ5183细菌中同源重组,然后经PacI线性化后转染QBI-293A人胚肾成纤维细胞(简称293A细胞),收获腺病毒重组病毒子Ad-Ang-1-polyA-promoter-VEGF165及Ad-VEGF165-polyA-promoter-Ang-1,Ad-VEGF165-IRES-Ang-1,RT-PCR检测Ang-1和VEGF165在QBI-293A细胞中的转录,ELISA法分别检测不同腺病毒载体目的基因的表达量,比较分析Ang-1与VEGF165基因在IRES和polyA-promoter介导的不同腺病毒表达载体中的表达能力,及在同一腺病毒表达载体中前后不同位置的表达效率。并进一步于兔角膜缘注射Ad-Ang-1-polyA-promoter-VEGF165,Ad-VEGF165-polyA-promoter-Ang-1,Ad-VEGF165-IRES-Ang-1,Ad-Ang-1-IRES-VEGF165,检测角膜新生血管的面积,并比较其诱导血管形成能力的差异。结果:测序显示Ang-1和VEGF165序列正确,不同重组腺病毒载体均获得成功包装,病毒效价可达2~5×1010pfu/m l,RT-PCR检测Ang-1和VEGF165均能有效转录,ELISA法检测结果表明Ang-1、VEGF165基因不仅均能在细胞中有效表达,而且IRES介导的Ang-1及VEGF165基因,无论在IRES上游或下游,其表达量均低于polyA-promoter相同位置的Ang-1及VEGF165基因表达量,大约降低60%~70%左右,同时Ang-1/VEGF165在同一载体上、下� 展开更多
关键词 血管生成素-1 血管内皮生长因子 IRES PolyA-promoter 构建
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IL-24基因修饰的树突状细胞促进CIK细胞对肺癌细胞的杀伤作用 被引量:2
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作者 郁心 夏卫 +5 位作者 王浦南 徐洪卫 陈宇 奚华新 杨吉成 缪竞诚 《中华微生物学和免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第9期841-846,共6页
目的研究IL-24基因修饰的树突状细胞(DC)与同源细胞因子诱导的杀伤细胞(cyto—kine-induced killer,CIK)共培养后对A549肺癌细胞的杀伤作用及其机制。方法从健康人外周血单个核细胞中常规诱导DC、CIK细胞,同时抽提重组腺病毒质粒p... 目的研究IL-24基因修饰的树突状细胞(DC)与同源细胞因子诱导的杀伤细胞(cyto—kine-induced killer,CIK)共培养后对A549肺癌细胞的杀伤作用及其机制。方法从健康人外周血单个核细胞中常规诱导DC、CIK细胞,同时抽提重组腺病毒质粒pAdEasy-1-pTrack—CMV—IL-24,PacⅠ酶切线性化后脂质体转染QBI-293A细胞,收获Ad—IL-24重组病毒。将IL-24基因通过重组病毒导入已负载肿瘤抗原的DC,获得细胞称为DC—IL-24。RT—PCR和ELISA法检测DC中IL-24基因的表达,FCM和ELISA法检测DC表型及分泌细胞因子能力的变化,将DC和CIK细胞混合培养,溶血试验检测CIK细胞产生穿孔素的能力,FCM法检测共培养的DC-CIK细胞对A549肺癌细胞细胞毒活性的变化。结果获得了高滴度的重组病毒Ad—IL-24并成功将IL-24基因导入DC,在倒置荧光显微镜下可观察到荧光,IL-24可上调DC表面CDSO、CD83、HLA—DR、CIMO、CXCR4分子的表达,转染后DC分泌IL-12、TNF-α仅和IL-24的能力显著增强,DC—IL-24更能促进CIK细胞产生穿孔素,与同源CIK细胞共培养后对A549肺癌细胞的细胞毒活性明显增强。结论IL-24基因修饰的DC能增强自体CIK细胞产生特异性抗肿瘤免疫,其机制与IL-24能促进DC表型成熟,分泌Th1型细胞因子,维持DC活化状态,进而促进CIK细胞活化密切相关。 展开更多
关键词 IL-24 树突状细胞 CIK细胞 A549细胞
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Ad-LIF-OSM双基因转染饲养细胞对脐血造血细胞体外增殖和分化的影响 被引量:1
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作者 包婉蓉 郁心 +4 位作者 盛伟华 张凤娟 王家融 杨吉成 缪竞诚 《中华微生物学和免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第10期865-869,共5页
目的构建表达人白血病抑制因子(LIF)和抑瘤素M(OSM)双基因的WI-38人胚肺成纤维细胞,并以此细胞作为饲养层细胞观察其对CD34造血干/祖细胞体外增殖和分化的影响。方法以双启动子转移载体pAdTrack-CMV-LIF-polyA+promoter。为基础... 目的构建表达人白血病抑制因子(LIF)和抑瘤素M(OSM)双基因的WI-38人胚肺成纤维细胞,并以此细胞作为饲养层细胞观察其对CD34造血干/祖细胞体外增殖和分化的影响。方法以双启动子转移载体pAdTrack-CMV-LIF-polyA+promoter。为基础,将OSM基因片段酶切后插入,构建出转移质粒pAdTrack-CMV-LIF-polyA+promoter。OSM。将构建正确的转移质粒与腺病毒骨架质粒共转化,获得重组腺病毒载体pAdEasy-1-pAdTrack-CMV-LIF-polyA+promoter。OSM,通过包装,收获重组腺病毒(Ad-LIF-OSM)。将重组腺病毒感染饲养层细胞,经RT.PCR、ELISA法检测外源基因在细胞中的表达;体外与CD34造血干/祖细胞共培养后,通过Transwell法和细胞计数检测,比较各实验组干/祖细胞体外扩增与分化情况。结果测序结果显示重组载体中的LIF和OSM基因序列正确;转基因饲养层细胞中能检测到外源LIF和OSM基因的转录和表达;外源LIF和OSM基因在造血干/祖细胞体外培养中能够发挥作用。结论成功构建携带人LIF和OSM的双基因重组腺病毒载体(Ad-LIF-OSM),Ad-LIF.OSM在造血干/祖细胞体外培养的过程中能够有效地扩增CD34造血干/祖细胞,并延缓其分化。 展开更多
关键词 腺病毒 白血病抑制因子 抑瘤素M 共表达载体 造血干/祖细胞
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B7-H4实时荧光定量PCR检测方法的建立及其在人胃癌组织中的初步应用
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作者 王琦 蒋敬庭 魏文祥 《中国医药生物技术》 2013年第2期81-87,共7页
目的建立实时荧光定量PCR检测B7-H4的方法并初步应用于人胃癌组织。方法将B7-H4和内参GAPDH的PCR扩增产物经测序鉴定正确后克隆入载体pMD19-T,构建重组质粒标准品,并纯化、定量及梯度稀释,分别建立B7.H4和GAPDH的标准曲线,应用实... 目的建立实时荧光定量PCR检测B7-H4的方法并初步应用于人胃癌组织。方法将B7-H4和内参GAPDH的PCR扩增产物经测序鉴定正确后克隆入载体pMD19-T,构建重组质粒标准品,并纯化、定量及梯度稀释,分别建立B7.H4和GAPDH的标准曲线,应用实时荧光定量PCR检测8例人胃癌组织中的B7一H4相对于GAPDH的表达情况。结果B7.H4的最低检测拷贝数为5.27拷贝,线性范围5.27×10^1~5.27×10^7拷贝,标准曲线方程Y=-3.1395X+41.805,直线回归相关系数r=0.994904,批间变异系数范围2.39%~3.59%,扩增效率108.2%;GAPDH的最低检测拷贝数为38.6拷贝,线性范围3.86×10^2~3.86×10^7拷贝,标准曲线方程Y=-3.2436x+41.083,直线回归相关系数r=0.998913,批间变异系数范围2.26%~3.86%,扩增效率103.4%。8例人胃癌组织的B7.H4相对于GAPDHmRNA表达水平在0.044~0.888之间。结论荧光定量PCR检测B7.H4的方法具备较高的敏感性和特异性,且系统有良好的重复性和线性范围。 展开更多
关键词 胃肿瘤 实时荧光定量PCR B7-H4
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