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抗藤黄微球菌Rpf结构域单克隆抗体的制备与特性鉴定 被引量：9
1
作者 樊爱琳 师长宏 +5 位作者 苏明权 马静 柏银兰 程晓东 徐志凯 郝晓柯 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第5期484-487,共4页
目的:克隆、表达藤黄微球菌Rpf结构域多肽,并制备针对该多肽的单克隆抗体(mAb)。方法:采用聚合酶链反应(PCR)藤黄微球菌基因组中扩增出藤黄微球菌Rpf结构域基因,用限制性内切酶消化后插入到pUC-19克隆载体中,测序正确后,再亚克隆到融合... 目的:克隆、表达藤黄微球菌Rpf结构域多肽,并制备针对该多肽的单克隆抗体(mAb)。方法:采用聚合酶链反应(PCR)藤黄微球菌基因组中扩增出藤黄微球菌Rpf结构域基因,用限制性内切酶消化后插入到pUC-19克隆载体中,测序正确后,再亚克隆到融合表达载体pPro-EXHT中,转化大肠杆菌DH5α,目的基因经IPTG诱导,由T7启动子调控表达了氨基端带6个连续组氨酸残基的Rpf结构域基因多肽,在变性条件下纯化目的蛋白。用纯化的目的蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠,进行细胞融合、克隆化制备抗Rpf domain单抗(mAb),用ELISA法初步鉴定其特异性和相对亲和力。结果:在变性条件下用Ni2+-NTA亲和色谱柱纯化目的融合蛋白,纯化获得的蛋白纯度大于90%。用该融合蛋白免疫小鼠后,获得了3株抗Rpfdomain mAb,这3株mAb均特异性识别Rpf domain多肽。结论:所获得的抗Rpfdomain mAb特异性强、效价高,对进一步研究Rpf domain在结核病免疫预防中的作用提供了有力的工具。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 藤黄微球菌 Rpf DOMAIN MAB
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人食管癌细胞系的建立及其转移相关基因PCNA的表达 被引量：7
2
作者 周勇安 师长宏 +2 位作者 张海 武静 赵勇 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第11期1055-1057,共3页
目的:建立人食管癌细胞系,并对其肿瘤标志物(caycinoembryanic antigen,CEA)和转移相关基因增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)的表达进行研究。方法:将人食管癌手术标本移植至裸鼠皮下,成瘤后取组织块体外原代培... 目的:建立人食管癌细胞系,并对其肿瘤标志物(caycinoembryanic antigen,CEA)和转移相关基因增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)的表达进行研究。方法:将人食管癌手术标本移植至裸鼠皮下,成瘤后取组织块体外原代培养,光镜和电镜观察细胞形态,测定细胞周期和染色体众数。取部分裸鼠皮下移植瘤接种至裸鼠食管,观察裸鼠体内肿瘤转移特征,采用免疫组化法测定肝转移灶PCNA基因的表达。结果:裸鼠皮下移植瘤组织16d,可形成明显的瘤结节,体外培养获得大量的肿瘤细胞,命名为YXA-1,其形态和超微结构符合鳞状细胞癌的形态学特征,染色体保持人类肿瘤染色体的特点,众数为70～76,细胞中肿瘤标志物CEA。食管癌标本原位移植裸鼠21d时,发生了广泛的肝内侵袭和转移,转移灶中PCNA表达为阳性。结论:人食管癌细胞系YXA-1维持了原发肿瘤的特征,而裸鼠其原位移植模型体现了肿瘤的转移特性,可用于肿瘤的转移研究。 展开更多
关键词 食管癌 细胞系 PCNA
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藤黄微球菌Rpf结构域多肽诱导小鼠免疫应答的实验研究 被引量：1
3
作者 樊爱琳 简文 +5 位作者 师长宏 苏明权 柏银兰 马静 徐志凯 郝晓柯 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第7期686-688,共3页
目的:研究藤黄微球菌Rpf结构域多肽的免疫学特性。方法:用原核表达的藤黄微球菌Rpf结构域多肽免疫BALB/c小鼠3次,每次间隔2周。用ELISA法检测免疫小鼠血清中特异性抗体滴度。分离免疫小鼠的脾淋巴细胞,体外用抗原再刺激后,用MTT比色法... 目的:研究藤黄微球菌Rpf结构域多肽的免疫学特性。方法:用原核表达的藤黄微球菌Rpf结构域多肽免疫BALB/c小鼠3次,每次间隔2周。用ELISA法检测免疫小鼠血清中特异性抗体滴度。分离免疫小鼠的脾淋巴细胞,体外用抗原再刺激后,用MTT比色法检测免疫小鼠脾淋巴细胞的增值指数。ELISA方法检测淋巴淋巴细胞悬液中IFN-γ、IL-10和IL-12产生水平。另一部分免疫的小鼠经尾静脉感染MTB毒株H37Rv,4周后,计数脾脏细菌负荷数。结果:藤黄微球菌Rpf结构域多肽免疫小鼠血清特异性抗体滴度为1∶128000,淋巴细胞增殖指数为(2.10±0.12),明显高于生理盐水对照组(0.90±0.21)。ELISA方法检测Rpf结构域多肽免疫组IFN-γ,IL-10和IL-12水平为(1126±36)ng/L,(368±13)ng/L和(289±14)ng/L,明显高于生理盐水对照组(P<0.01)。与生理盐水免疫组(细菌负荷6.64±0.13)相比较,Rpf结构域多肽免疫的BALB/c小鼠,对攻击感染后抗MTB在脾脏中增殖有明显作用(细菌负荷为5.03±0.11,P<0.05)。结论:藤黄微球菌Rpf结构域多肽有可能作为新型结核疫苗的候选组分。 展开更多
关键词 藤黄微球菌 免疫学特性 Rpf结构域
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结核分枝杆菌ESAT6-CFP10融合蛋白诱导的小鼠免疫应答及其保护力 被引量：12
4
作者 张海 师长宏 +3 位作者 薛莹 柏银兰 王丽梅 徐志凯 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第4期443-446,共4页
目的:研究结核分枝杆菌(MTB)ESAT6-CFP10融合蛋白诱导的小鼠体液和细胞免疫应答以及对MTB感染小鼠的保护能力。方法:用预先转移到硝酸纤维素膜条的ES-AT6-CFP10融合蛋白采用皮下包埋的方法免疫小鼠。用MTB培养上清滤液蛋白(CFP)作为抗原... 目的:研究结核分枝杆菌(MTB)ESAT6-CFP10融合蛋白诱导的小鼠体液和细胞免疫应答以及对MTB感染小鼠的保护能力。方法:用预先转移到硝酸纤维素膜条的ES-AT6-CFP10融合蛋白采用皮下包埋的方法免疫小鼠。用MTB培养上清滤液蛋白(CFP)作为抗原,用ELISA法测定免疫小鼠血清特异性抗体的滴度。末次免疫后,取部分免疫小鼠脾淋巴细胞,体外用ESAT6-CFP10融合蛋白刺激后,以MTT比色法检测淋巴细胞增殖反应,同时检测免疫小鼠IFN-γ和IL-2水平及脾细胞杀伤效应。另一部分免疫的BALB/c小鼠经尾静脉感染MTB毒株H37Rv,4周后计数脾脏中的细菌数。结果:ESAT6-CFP10融合蛋白免疫小鼠血清特异性抗体的滴度为1∶6400。淋巴细胞刺激增殖指数为1.90±0.15,明显高于生理盐水组(0.90±0.15);IFN-γ和IL-2的含量分别为1.792±19ng/L和0.211±11ng/L,显著高于生理盐水对照组,但不及BCG免疫组;同时融合蛋白诱导的脾细胞杀伤率为36%。与生理盐水免疫组(细菌负荷6.51±0.13)相比较,融和蛋白免疫的BALB/c小鼠,对攻击感染后MTB在脾脏中增殖有显著作用(细菌负荷为5.24±0.15,P<0.05),但与BCG免疫组相比脾脏中细菌负荷减少甚微。结论:ESAT6-CFP10融合蛋白可作为新型结核疫苗的候选组分。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 疫苗 ESAT6 CFP10 重组融合蛋白
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复苏促生长因子结构域及其突变体重组蛋白诱导小鼠免疫应答的研究 被引量：1
5
作者 邱奕 赵善民 +1 位作者 师长宏 史皆然 《中国防痨杂志》 CAS 2013年第5期331-336,共6页
目的评价复苏促生长因子结构域蛋白(Rpfd)及其突变体蛋白(Rpfd1、Rpfd2)等3种重组蛋白的免疫效能。方法2011年11月至2012年2月间,分别以本实验前期制备的重组蛋白Rpfd(A组)、Rpfd1(A1组)、Rpfd2(A2组)分别于0、2、4周免疫无特定病原体(S... 目的评价复苏促生长因子结构域蛋白(Rpfd)及其突变体蛋白(Rpfd1、Rpfd2)等3种重组蛋白的免疫效能。方法2011年11月至2012年2月间,分别以本实验前期制备的重组蛋白Rpfd(A组)、Rpfd1(A1组)、Rpfd2(A2组)分别于0、2、4周免疫无特定病原体(SPF)级BALB/c小鼠,每组14只,并分别以BCG(B组)和生理盐水(C组)同期免疫同种小鼠各14只作为对照。第5周,每组取7只小鼠摘眼球取血,ELISA法检测血清特异性抗体、血清IFN-γ和IL-2表达水平;第8周,每组剩余7只小鼠用1×105 CFU结核分枝杆菌标准株H37Rv感染小鼠,第9周检测感染后小鼠血清细胞因子IFN-γ和IL-2水平。结果 (1)抗体水平:①Rpfd抗原包被。A1组刺激小鼠产生抗体A450的检测值(0.990±0.272)高于B组(0.631±0.180)(t=4.635,P<0.05);A2组(1.470±0.455)高于B组(t=6.634,P<0.05)。②Rpfd1抗原包被。A组刺激小鼠产生抗体A450的检测值(1.030±0.304)高于B组(0.573±0.004)(t=5.276,P<0.05);A1组(1.368±0.171)高于B组(t=17.20,P<0.05);A2组(2.766±0.245)高于B组(t=31.643,P<0.05);③Rpfd2抗原包被。A1组刺激小鼠产生抗体A450的检测值(1.055±0.202)高于B组(0.538±0.100)(t=8.009,P<0.05);A2组(1.605±0.544)高于B组(t=8.192,P<0.05)。(2)IFN-γ水平:①感染前。A组刺激小鼠产生IFN-γ水平[(553.47±132.00)pg/ml]高于B组[(385.28±129.07)pg/ml](t=3.150,P<0.05);②感染后。A1蛋白组刺激小鼠产生IFN-γ水平[(492.41±211.74)pg/ml]高于B组[(335.36±207.72)pg/ml](t=2.874,P<0.05);A2组[(543.09±223.07)pg/ml]高于B组(t=3.15,P<0.05)。(3)IL-2水平:①感染前。A组刺激小鼠产生IL-2水平[(1490.05±215.35)pg/ml]高于B组[(718.70±269.29)pg/ml](t=7.763,P<0.05);A1组[(1738.91±358.40)pg/ml]高于B组(t=7.903,P<0.05);A2组[(2270.74±193.40)pg/ml]高于B组(t=16.308,P<0.05);②感染后。A组刺激小鼠产生IL-2水平[(806.81±306.39)pg/ml]高于B组[(335.26±176.81)pg/ml](t=4.627,P<0.05);A1组[(1373.22±143.75)pg/ml]高于B组(t=15.90,P<0.05)。结论Rpfd、Rpfd1、Rpfd2蛋白具� 展开更多
关键词 细菌蛋白质类 白细胞介素2 干扰素Ⅱ型 重组蛋白质类 抗体生成 免疫 细胞
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胞壁表达HSP65-IL-2融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌的构建和鉴定
6
作者 栗文彬 师长宏 +4 位作者 张海 张廷芬 王丽梅 赵勇 白冰 《生物技术通讯》 CAS 2008年第5期667-669,共3页
目的:获得胞壁表达结核分枝杆菌热激蛋白65(HSP65)和人白细胞介素2(IL-2)融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌。方法:将HSP65和IL-2融合基因克隆入大肠杆菌-卡介苗(E.coli-BCG)穿梭质粒pCW,构建成重组质粒HSP65-IL-2-pCW,电穿入耻垢分枝杆菌,经... 目的:获得胞壁表达结核分枝杆菌热激蛋白65(HSP65)和人白细胞介素2(IL-2)融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌。方法:将HSP65和IL-2融合基因克隆入大肠杆菌-卡介苗(E.coli-BCG)穿梭质粒pCW,构建成重组质粒HSP65-IL-2-pCW,电穿入耻垢分枝杆菌,经潮霉素抗性筛选和PCR方法选取阳性克隆;用间接免疫荧光法对重组耻垢分枝杆菌进行表型鉴定;用重组耻垢分枝杆菌免疫BALB/c小鼠,检测其诱导的抗体水平。结果:筛选获得的重组耻垢分枝杆菌增殖特性与普通耻垢分枝杆菌无明显区别;与抗人的IL-2抗体和HSP65抗体均可形成免疫印迹条带;间接荧光染色后,可见细菌表面有极强的绿色荧光;重组耻垢分枝杆菌免疫BALB/c小鼠2周后,小鼠血清中HSP65抗体平均滴度为1∶4000,而生理盐水组的抗体几乎为阴性。结论:结核分枝杆菌HSP65和人IL-2融合基因在耻垢分枝杆菌胞壁获得表达,有望为结核病的预防提供有效的疫苗。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 耻垢分枝杆菌 热激蛋白65 白细胞介素2 融合蛋白
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