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基因-病毒治疗系统CNHK300-murine endostatin的构建及体外研究 被引量：12
1
作者 聂明明 方国恩 +4 位作者 王星华 苏长青 崔贞福 李林芳 钱其军 《中华实验外科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第1期45-48,共4页
目的构建一种新型的肿瘤基因-病毒治疗系统CNHK300-murine endostatin(CNHK300-mE),以肿瘤增殖病毒为载体,携带抗肿瘤新生血管生成的基因。方法利用基因重组技术将人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子插入腺病毒E1A基因上游,将小鼠内皮抑素... 目的构建一种新型的肿瘤基因-病毒治疗系统CNHK300-murine endostatin(CNHK300-mE),以肿瘤增殖病毒为载体,携带抗肿瘤新生血管生成的基因。方法利用基因重组技术将人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子插入腺病毒E1A基因上游,将小鼠内皮抑素基因表达盒插入到腺病毒包装信号和hTERT启动子之间,通过病毒增殖试验、电镜技术、Western blot分析、酶联免疫吸附实验(ELISA)、鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)试验,观察CNHK300-mE的复制情况、mE的表达情况及对鸡胚绒毛尿囊膜新生血管的抑制情况。结果成功构建了基因-病毒治疗系统CNHK300-mE,该系统为hTERT启动子调控腺病毒E1A基因表达并携带小鼠内皮抑素基因的重组腺病毒。该病毒可以在端粒酶阳性的胃癌细胞株SGC-7901和肝癌细胞株HepGII中大量增殖及复制,而在端粒酶阴性的正常纤维细胞中不增殖。电镜证实该重组病毒在胃癌细胞株SGC-7901中复制及增殖。ELISA检测表明SGC-7901感染CNHK300-mE后7d,小鼠内皮抑素的表达量为1000μg/L。CAM实验证实该病毒感染胃癌细胞后的培养液上清具有抗新生血管生成的生物活性。结论基因-病毒治疗系统CNHK300-mE能在端粒酶阳性的肿瘤细胞中特异性增殖复制,并大量表达具有抗新生血管生成生物活性的小鼠内皮抑素。 展开更多
关键词 基因-病毒治疗系统 CNHK300-murine ENDOSTATIN 肿瘤基因 血管生成 端粒酶 肿瘤细胞
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基因-病毒治疗系统CNHK300-murine endostatin治疗肝癌的实验研究 被引量：5
2
作者 李根丛 聂明明 +7 位作者 杨甲梅 苏长青 孙立臣 钱炎珍 Jonathan Sham 方国恩 吴孟超 钱其军 《中华医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2004年第11期943-948,共6页
目的　探讨一种新的基因 病毒治疗系统CNHK30 0 murineendostatin(简称CNHK30 0 mE)对肝癌的治疗作用。方法　利用基因重组技术构建一种用人端粒酶逆转录酶 (hTERT)启动子控制腺病毒E1A基因表达并携带内皮抑素基因的基因 病毒治疗系... 目的　探讨一种新的基因 病毒治疗系统CNHK30 0 murineendostatin(简称CNHK30 0 mE)对肝癌的治疗作用。方法　利用基因重组技术构建一种用人端粒酶逆转录酶 (hTERT)启动子控制腺病毒E1A基因表达并携带内皮抑素基因的基因 病毒治疗系统 ;通过 5 0 %组织培养感染剂量 (TCID5 0 )方法和细胞活性检测法四氮唑盐比色试验 (MTT法 )观察CNHK30 0 mE在 2种肝癌细胞株 (HepGII及Hep3B)及 1株正常的成纤维细胞株 (MRC 5 )中的病毒增殖能力和对细胞的杀灭能力 ;通过肝癌SMMC772 1细胞裸鼠皮下移植瘤模型观察该病毒对肝癌生长和对肿瘤血管生成的抑制作用 ;利用Western印迹法和酶联免疫吸附实验 (ELISA)法检测内皮抑素基因在体内和体外的表达。结果分别感染肝癌细胞株和正常细胞株 96h后病毒的增殖倍数相差 32 96倍 ,其达到半数杀伤量 (ED50 )时的感染复数 (MOI)值相差 2 5倍 ,差异有显著意义 ,且两者均明显优于ONYX 0 15 ;CNHK30 0 mE能明显抑制肝癌皮下移植瘤内血管的生成 ,对肿瘤生长的抑制作用与携带同一治疗基因的非增殖型腺病毒和不携带治疗基因的增殖型腺病毒ONYX 0 15相比均增强 (P均 <0 0 1) ;其所介导的内皮抑素基因在体内和体外的表达量均与携带该基因的非增殖型腺病毒载体相比均增高 (P <0 0 展开更多
关键词 基因-病毒治疗系统 CNHK300-murine ENDOSTATIN 肝癌 端粒酶逆转录酶 HTERT 内皮抑素
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携带可诱导共刺激分子基因的重组腺病毒载体构建及其在小鼠间充质干细胞中的表达 被引量：4
3
作者 王利平 包晓辰 +4 位作者 魏玮 陈洁 邵宇 王健民 钱其军 《医学研究生学报》 CAS 北大核心 2012年第9期909-914,共6页
目的阻断可诱导共刺激途径协同骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)可能能增强急性移植物抗宿主病(acute graft versus host disease,aGVHD)的防治作用。文中旨在构建携带小鼠可诱导共刺激分子(inducible costimula-tor,ICOS... 目的阻断可诱导共刺激途径协同骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)可能能增强急性移植物抗宿主病(acute graft versus host disease,aGVHD)的防治作用。文中旨在构建携带小鼠可诱导共刺激分子(inducible costimula-tor,ICOS)基因的重组腺病毒载体,转染小鼠骨髓MSCs,为转基因治疗提供实验基础。方法设计含有EcoRⅠ、SalⅠ酶切位点的引物,PCR扩增ICOS,将扩增产物克隆到穿梭质粒PDC318上,筛选阳性克隆,测序鉴定正确,将其与含有5型腺病毒右臂的质粒pPE3-F11B-EGFP在293细胞中同源重组,筛选获得含有ICOS基因的重组腺病毒质粒,行PCR鉴定。重组腺病毒质粒转染293细胞,扩增后用氯化铯密度梯度离心纯化病毒,用50%组织培养感染剂量法测定病毒滴度,并转染小鼠MSCs。结果重组腺病毒质粒经鉴定,证实含有ICOS基因,病毒滴度为6.54×109pfu/ml。转染小鼠MSCs,荧光显微镜下可见较多绿色荧光蛋白表达,流式细胞仪检测ICOS表达率为90.16%。结论成功构建了携带小鼠ICOS基因的重组腺病毒载体,并获得高滴度的病毒,能高效转染小鼠MSCs,为后续研究奠定了基础。 展开更多
关键词 腺病毒载体 可诱导共刺激分子 间充质干细胞 基因治疗
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