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MAP30全长基因的克隆及在巴斯德毕赤酵母中的高效表达研究 被引量：6
1
作者 朱振洪 杨威威 +1 位作者 葛立军 万海同 《中国医药生物技术》 CSCD 2010年第2期110-116,共7页
目的研究毕赤酵母中高效表达全长MAP30蛋白及其生物活性。方法根据GeneBank公布的MAP30全序列设计特异性引物,以苦瓜基因组为模板,PCR扩增MAP30全长基因,将该基因插入pPIC9k载体中,经SacI酶切线性化后,电转化至GS115细胞,再通过G418筛选... 目的研究毕赤酵母中高效表达全长MAP30蛋白及其生物活性。方法根据GeneBank公布的MAP30全序列设计特异性引物,以苦瓜基因组为模板,PCR扩增MAP30全长基因,将该基因插入pPIC9k载体中,经SacI酶切线性化后,电转化至GS115细胞,再通过G418筛选,最终获得了高拷贝重组GS115菌株。重组菌株在甲醇诱导下,SDS-PAGE分析表达的特异性条带,运用Pharmacia VDS图像分析软件进行条带密度扫描,得到各条带的扫描曲线图,计算出同一泳道目的蛋白条带峰面积相对于整个曲线所占的百分比,即蛋白纯度,并根据蛋白纯度和上清蛋白总量(Lowry法)计算出发酵上清液中目标蛋白含量。纯化时首先用75%的饱和硫酸铵盐析,然后用Phenyl Sepharose6FF疏水层析,再用CM-sepharoseFF阳离子层析。采用MTT法检测MAP30蛋白对人胃癌细胞株SGC7901的抑制作用。为验证重组MAP30蛋白结构的正确性,采用EDMAN降解法分析N末端8个氨基酸。结果重组菌株在甲醇诱导下,SDS-PAGE分析可见相对分子质量32000的特异性条带,重组蛋白占上清液总蛋白的67%;发酵液经硫酸铵沉淀、疏水和阳离子交换层析后,目的蛋白总回收率为32.4%。MTT法检测结果表明,重组MAP30蛋白具有明显的抑制人胃癌细胞SGC7901的活性,IC50为30μg/ml。N端的8个氨基酸测序进一步证实与理论一致。结论重组MAP30蛋白在毕赤酵母中正确表达,表达产物具有抑制肿瘤细胞的活性。 展开更多
关键词 苦瓜 核糖体蛋白质类 毕赤酵母 基因表达
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