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150 L生物反应器规模化扩增狂犬病病毒工艺的建立
1
作者 原国强 郭宏庄 +5 位作者 崔晓峰 崔艳霞 孙志华 安文珏 李津 潘若文 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2024年第6期718-722,730,共6页
目的建立150 L生物反应器大规模培养狂犬病病毒(rabies virus,RABV)的工艺,为后期开发更大规模高密度微载体反应器工艺奠定基础。方法应用30 L(型号:C30-2)和150 L(型号:VESSEL FERMENTER 300L)生物反应器,以灌流方式培养Vero细胞和CTN... 目的建立150 L生物反应器大规模培养狂犬病病毒(rabies virus,RABV)的工艺,为后期开发更大规模高密度微载体反应器工艺奠定基础。方法应用30 L(型号:C30-2)和150 L(型号:VESSEL FERMENTER 300L)生物反应器,以灌流方式培养Vero细胞和CTN-1V株RABV,Cytodex-1微载体浓度20 g/L,培养温度36~38℃,DO 20%~60%,pH 7.0~7.4,连续13 d收获病毒液,培养过程中取样检测细胞密度、病毒滴度,并对病毒收获液进行无菌和支原体检查及抗原、宿主细胞蛋白(host cell protein,HCP)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)、DNA残留量检测。结果30和150 L生物反应器的细胞培养密度均可达1.2×10^(7)个/mL以上,在培养过程中各时间点的细胞密度差异均无统计学意义(t=0.225~2.173,P=0.096~0.833)。2种规模生物反应器病毒收获液均在感染后6 d达最高病毒滴度(8.5 lgLD_(50)/mL),且差异无统计学意义(t=1.000,P=0.374)。2种规模生物反应器病毒收获液的抗原、HCP、BSA和DNA残留量基本一致。结论可用150 L生物反应器大规模培养RABV,病毒收获液符合《中国药典》三部(2020版)相关标准。 展开更多
关键词 狂犬病病毒 VERO细胞 生物反应器 微载体
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群体倍增水平评价悬浮培养HEK293细胞的传代稳定性
2
作者 王朋超 孙志华 +8 位作者 崔晓峰 孟丽 尚雪 王夏楚 时琪琪 李玉华 李津 安文珏 潘若文 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2024年第9期1127-1132,共6页
目的采用群体倍增水平(population doubling level,PDL)评价悬浮培养HEK293细胞的传代稳定性,并进行验证,以期为该细胞工业化生产培养提供实验依据。方法将工作种子批HEK293细胞连续传代60 d,每2 d传1代,评价PDL增加至10~60时的细胞稳... 目的采用群体倍增水平(population doubling level,PDL)评价悬浮培养HEK293细胞的传代稳定性,并进行验证,以期为该细胞工业化生产培养提供实验依据。方法将工作种子批HEK293细胞连续传代60 d,每2 d传1代,评价PDL增加至10~60时的细胞稳定性。通过相关研究结果计算获得当HEK293细胞传代培养至2500 L规模时,各代PDL应控制在2±0.2范围内。将工作种子批HEK293细胞经摇瓶(125、500、1000、3000 mL,共传4代)、细胞扩增系统(cell expansion system,CES)(25、25及50 L,共传3代)、生物反应器(100、500、500,共传3代)阶段培养,各代PDL均控制在2±0.2范围内,共培养3批,并分析细胞密度、活率、结团率、直径等指标。500 L生物反应器培养HEK293细胞72 h,按MOI=5~10接种工作种子批腺病毒,培养2 d,收获病毒培养液,检测病毒颗粒数。结果工作种子批HEK293细胞连续传代至PDL达60时仍能维持较高的细胞密度和活率。将PDL控制在2±0.2范围内,3批HEK293细胞在摇瓶、CES、生物反应器培养阶段的密度均>2.0×10^(6)个/mL,活率均>96%,细胞直径约为17μm;结团率均<35%。3批500 L生物反应器培养的HEK293细胞接毒2 d后,病毒颗粒数分别达11.68×10^(10)、12.55×10^(10)和9.38×10^(10)vp/mL。结论采用PDL评价HEK293细胞传代稳定性是可行的,可更科学地反映传代细胞的生长状态。 展开更多
关键词 群体倍增水平 HEK293细胞 悬浮培养 传代 稳定性
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重组E.coli宿主中质粒DNA拷贝数qPCR检测方法的建立及验证
3
作者 王魁 殷吉祥 +3 位作者 程之铭 郭冰峰 郝一楠 潘若文 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2024年第10期1263-1267,1274,共6页
目的建立重组E.coli宿主中质粒DNA(pDNA)拷贝数的qPCR检测方法,并进行验证,以期为mRNA疫苗研发提供可靠的检测方法。方法根据E.coli Top10基因组DNA序列设计用于qPCR扩增的引物及探针,并优化引物浓度。提取重组E.coli/pUC57-HA的全DNA(... 目的建立重组E.coli宿主中质粒DNA(pDNA)拷贝数的qPCR检测方法,并进行验证,以期为mRNA疫苗研发提供可靠的检测方法。方法根据E.coli Top10基因组DNA序列设计用于qPCR扩增的引物及探针,并优化引物浓度。提取重组E.coli/pUC57-HA的全DNA(宿主DNA+pDNA),以其为模板,建立pDNA拷贝数的qPCR检测方法,并验证方法的线性范围、特异性及重复性。将重组E.coli/pUC57-HA于37℃培养24 h,每2 h取样,采用建立的方法检测pDNA拷贝数。结果确定最佳引物(F/R)浓度均为0.5μmol/L。重组E.coli/pUC57-HA全DNA在10~1~10~5倍稀释范围内,与Ct呈良好的线性关系,R^(2)均=1.00;E.coli/pUC57-HA及E.coli Top10的扩增结果为阳性,阴性对照(ddH_(2)O)未见扩增曲线;3次重复检测重组E.coli/pUC57-HA的pDNA拷贝数CV<5%。E.coli/pUC57-HA培养0~6 h期间pDNA拷贝数呈平稳趋势,6~12 h期间呈下降趋势,12~16 h期间呈增长趋势,16~24 h又趋于平稳。结论建立的qPCR法具有良好的特异性及重复性,可用于重组E.coli宿主中pDNA拷贝数的检测,有效监测菌株培养过程中pDNA含量变化。 展开更多
关键词 E.COLI 质粒DNA拷贝数 qPCR mRNA疫苗
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2022年某国产儿童四价流感病毒裂解疫苗质量检测分析
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作者 张勇朝 韩斌 +4 位作者 董洁 尚艳 潘若文 安文珏 孙伟 《现代疾病预防控制》 2024年第1期43-46,共4页
目的 回顾评估某国产儿童四价流感病毒裂解疫苗关键质量指标,分析疫苗的有效性、安全性和批间一致性。方法以某国产公司生产的14批儿童四价流感病毒裂解疫苗为研究样品,检测样品血凝素含量、总蛋白含量、总蛋白/血凝素比值、卵清蛋白含... 目的 回顾评估某国产儿童四价流感病毒裂解疫苗关键质量指标,分析疫苗的有效性、安全性和批间一致性。方法以某国产公司生产的14批儿童四价流感病毒裂解疫苗为研究样品,检测样品血凝素含量、总蛋白含量、总蛋白/血凝素比值、卵清蛋白含量、细菌内毒素含量、游离甲醛含量,和企业注册标准、中国药典标准及WHO标准比较,同时计算标准差(s),评价产品质量。结果 14批儿童四价流感病毒裂解疫苗血凝素含量为31.9~35.9μg/m L(s 0.6~1.2)、总蛋白含量223.4~256.0μg/mL(s 9.0)、总蛋白/血凝素比值1.7~1.8(s 0.06)、卵清蛋白含量0.84~2.32 ng/mL(s 0.47)、细菌内毒素含量0.03~0.04 EU/mL(s 0.004)、游离甲醛含量2.05~2.70μg/mL(s 0.23),检测符合标准要求。结论 该国产儿童四价流感病毒裂解疫苗14批产品检测结果均符合企业注册标准、中国药典标准及WHO标准,批间一致性好,产品具有良好的安全性和有效性。 展开更多
关键词 儿童四价流感病毒裂解疫苗 卵清蛋白 细菌内毒素 游离甲醛 血凝素 总蛋白
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离子交换和疏水层析法代替盐析沉淀技术精制破伤风毒素初探
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作者 田贝贝 崔晓峰 +5 位作者 郭旺 孙伟 李津 安文珏 潘若文 高新灿 《微生物学免疫学进展》 CAS 2023年第4期25-29,共5页
目的用离子交换+疏水层析法代替传统的盐析沉淀技术制备高纯度精制破伤风毒素。方法破伤风毒素浓缩液经Q Sepharose Fast Flow(QFF)离子交换层析去除杂蛋白,将收集到目标蛋白破伤风毒素经2.0 mol/L硫酸铵-磷酸盐缓冲液等量稀释后,再用Ph... 目的用离子交换+疏水层析法代替传统的盐析沉淀技术制备高纯度精制破伤风毒素。方法破伤风毒素浓缩液经Q Sepharose Fast Flow(QFF)离子交换层析去除杂蛋白,将收集到目标蛋白破伤风毒素经2.0 mol/L硫酸铵-磷酸盐缓冲液等量稀释后,再用Phenyl Sepharose^(TM)6 Fast Flow(high sub)疏水层析去除大部分杂质及色素制得纯度较高的精制破伤风毒素。结果用离子交换+疏水层析法纯化破伤风毒素实验重复3次,精制破伤风毒素絮状单位平均值达到3600 Lf/mL,纯度平均值为100%,精制破伤风毒素的特异蛋白条带相对分子质量分别在148000~153000、98000~103000、53000~57000范围内。与盐析法相比,离子交换+疏水层析法各项指标均有较大提高。结论离子交换+疏水层析法能有效、稳定地制备符合要求的精制破伤风毒素。在破伤风毒素的纯化中,离子交换+疏水层析法可取代传统的盐析沉淀技术。 展开更多
关键词 破伤风毒素 离子交换层析 疏水层析 纯度 纯化
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