非洲猪瘟病毒p72蛋白的原核表达及单克隆抗体的制备 被引量：4

1

作者 吴宏举 李潮 +6 位作者 郑南南 侯浩宇 陈寅龙 靳家鑫 孙爱军 杜永坤 张改平 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2023年第1期1-6,13,122,共8页

为了研发非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)的免疫学诊断试剂,试验将ASFV B646L基因克隆至pET-30a(+)载体中构建表达载体pET-30a(+)-p72,利用大肠杆菌表达系统表达重组蛋白,采用SDS-PAGE分析诱导表达的大肠杆菌,以镍柱对... 为了研发非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)的免疫学诊断试剂,试验将ASFV B646L基因克隆至pET-30a(+)载体中构建表达载体pET-30a(+)-p72,利用大肠杆菌表达系统表达重组蛋白,采用SDS-PAGE分析诱导表达的大肠杆菌,以镍柱对重组蛋白进行纯化,通过SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定纯化的重组蛋白。用纯化后的重组蛋白免疫Balb/c小鼠,通过细胞融合方法制备杂交瘤细胞。采用间接ELISA方法筛选并检测单克隆抗体,以Western-blot及IFA方法鉴定单克隆抗体的特异性,并通过Mouse Monoclonal Antibody Isotyping ELISA Kit鉴定单克隆抗体的亚型。结果表明:PCR扩增得到大小约为1 941 bp的B646L基因,并成功构建了表达载体pET-30a(+)-p72。诱导表达的大肠杆菌在72 ku处出现目的条带,纯化后的重组蛋白p72在72 ku处出现目的条带。筛选出4种单克隆抗体2C7D8、2E6D12、3B10E3、4G5E6,其效价在1∶100 000~1∶500 000之间,且4种单克隆抗体均能特异性识别真核及原核表达的p72蛋白。4种单克隆抗体的重链亚型均为IgG2b,单克隆抗体2C7D8和4G5E6的轻链亚型为Lambda, 2E6D12和3B10E3的轻链亚型为Kappa。说明利用大肠杆菌表达系统原核表达ASFV重组蛋白p72及制备相应的单克隆抗体是可行的。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 p72蛋白 单克隆抗体 原核表达 细胞融合

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奶牛乳房炎病原菌的分离鉴定及15味中药对其抑菌效果试验

2

作者 周广微 张武豪 +6 位作者 张兴 刘芳 王学兵 孙宇 童超 贺秀媛 王红利 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2024年第9期122-128,共7页

为了探究15味中药对奶牛乳房炎主要致病菌的抑制效果,本试验对河南省豫东地区奶牛场采集的160份乳房炎奶样进行病原菌分离鉴定,筛选出主要致病菌,随后用煎煮法提取15味中药的有效成分,并进行浓缩,使用牛津杯法、琼脂稀释法和试管二倍稀... 为了探究15味中药对奶牛乳房炎主要致病菌的抑制效果,本试验对河南省豫东地区奶牛场采集的160份乳房炎奶样进行病原菌分离鉴定,筛选出主要致病菌,随后用煎煮法提取15味中药的有效成分,并进行浓缩,使用牛津杯法、琼脂稀释法和试管二倍稀释法进行体外抑菌试验,确定15味中药的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)。结果显示,共分离出347株病原菌,其中金黄色葡萄球菌和乳房链球菌检出率较高;15味中药水提物中黄连和紫花地丁对金黄色葡萄球菌抑制作用较强,MIC分别为31.25和62.5 mg/mL,MBC分别为62.5和125 mg/mL;黄连和蒲公英根对乳房链球菌抑制作用较强,MIC均为31.25 mg/mL,MBC分别为31.25和62.5 mg/mL,黄连、蒲公英根、穿心莲和马齿苋对大肠杆菌抑制作用较强,MIC均为62.5 mg/mL,MBC均为125 mg/mL。15味中药水提物中黄连、紫花地丁、蒲公英根、穿心莲和马齿苋对奶牛乳房炎致病菌大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和乳房链球菌的体外抑菌作用较好,提示其可作为潜在的中药抑菌剂。本试验为进一步开发治疗奶牛乳房炎的中药单方或复方制剂提供参考。 展开更多

关键词 奶牛乳房炎 病原菌 中药水提取物 抑菌试验

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整合NDV-F基因的重组MDV载体疫苗的构建

3

作者 龚乐乐 刘盼 +7 位作者 王乐乐 王芮 高美洁 赵旭阳 王新卫 杜永坤 庄国庆 孙爱军 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第1期52-58,共7页

为了预防马立克氏病毒(Marek’s disease virus,MDV)和新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)混合感染给养禽业造成的危害,本研究以细菌人工染色体(BAC)为基因编辑平台,利用Red同源重组技术,将NDV的F基因整合到MDV双基因缺失毒株Md5 ... 为了预防马立克氏病毒(Marek’s disease virus,MDV)和新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)混合感染给养禽业造成的危害,本研究以细菌人工染色体(BAC)为基因编辑平台,利用Red同源重组技术,将NDV的F基因整合到MDV双基因缺失毒株Md5 BACΔmeqΔLorf9基因组中,诱导Ⅰ-SceⅠ酶表达,将筛选标记卡那霉素抗性基因敲除,构建重组活载体疫苗候选毒株Md5 BACΔmeqΔLorf9-F。PCR以及限制性片段多态性(RFLP)分析结果显示F基因成功整合到MDV基因组且重组质粒基因组完整;将鉴定正确的重组质粒转染鸡胚成纤维细胞,1周后出现明显的细胞病变,且噬斑大小与亲本毒无明显差异;体外生长曲线结果显示,F基因的插入不影响病毒的体外复制能力。结果表明,本研究正确构建了表达NDV保护性抗原F基因的重组MDV,为研制ND重组MDV活载体疫苗奠定了基础,对NDV和MDV混合感染的防控具有重要意义。 展开更多

关键词 细菌人工染色体 马立克氏病病毒 新城疫病毒 活载体疫苗

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非洲猪瘟病毒调控宿主天然免疫应答机制研究进展 被引量：5

4

作者 何文瑞 杨中元 +2 位作者 韩世充 万博 张改平 《河南农业大学学报》 CAS CSCD 2022年第4期523-531,共9页

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染引起的高度致死性猪传染病,目前尚无针对该病的有效疫苗和治疗手段。本综述着眼于宿主抗病毒天然免疫应答过程,重点阐述新近发现的ASFV编码蛋... 非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染引起的高度致死性猪传染病,目前尚无针对该病的有效疫苗和治疗手段。本综述着眼于宿主抗病毒天然免疫应答过程,重点阐述新近发现的ASFV编码蛋白对干扰素(interferon,IFN)信号通路、炎症反应和细胞凋亡过程的调控作用,分析了相关病毒蛋白在ASFV感染、复制和致病力方面的影响,指出了潜在的ASFV新型疫苗研究靶点,以期为临床治疗药物和新型高效疫苗的研发提供方向和思路。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 天然免疫反应 干扰素信号通路 炎症反应 细胞凋亡

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非洲猪瘟新型诊断方法研究进展 被引量：1

5

作者 张圆圆 靳家鑫 +6 位作者 赵旭阳 张帅 刘月月 李祥林 孙爱军 林树乾 庄国庆 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2023年第10期62-71,共10页

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染猪而引起的一种急性、烈性传染病。2018年,我国发生的ASF疫情对养猪业造成了严重经济损失。目前尚无有效药物和疫苗用于治疗和预防ASF,主要通... 非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染猪而引起的一种急性、烈性传染病。2018年,我国发生的ASF疫情对养猪业造成了严重经济损失。目前尚无有效药物和疫苗用于治疗和预防ASF,主要通过临床诊断和扑杀感染动物来控制疫情传播。建立快速、精准和高效的诊断方法对于疫病防控至关重要。综述当前国内外ASF诊断方法的研究进展,重点阐述诊断靶标的选择以及病原学、血清学检测方法的研究现状,为ASF新型诊断方法的研发提供参考。 展开更多

关键词 非洲猪瘟 新型诊断方法 诊断靶标 疫病防控

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非洲猪瘟病毒K205R蛋白特异性纳米抗体的筛选与鉴定

6

作者 吴书雅 赵慧君 +7 位作者 任佳慧 董昊鑫 张铭芳 李嘉骥 杜永坤 万博 张昂克 张改平 《河南农业大学学报》 CAS CSCD 2023年第2期307-315,共9页

【目的】利用噬菌体展示技术筛选非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)K205R蛋白的特异性纳米抗体。【方法】将原核表达、纯化的ASFV K205R蛋白免疫双峰驼,采集全血,分离外周血淋巴细胞,提取总RNA并反转录,巢式PCR扩增VHH基因... 【目的】利用噬菌体展示技术筛选非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)K205R蛋白的特异性纳米抗体。【方法】将原核表达、纯化的ASFV K205R蛋白免疫双峰驼,采集全血,分离外周血淋巴细胞,提取总RNA并反转录,巢式PCR扩增VHH基因,构建VHH噬菌体文库,利用噬菌体展示技术筛选K205R特异性纳米抗体。【结果】成功构建库容量为5×10^(8)的VHH噬菌体文库,然后利用噬菌体展示技术经过3轮淘选,特异性VHH噬菌体得到明显富集,氨基酸序列比对显示共筛选出5株K205R蛋白的特异性纳米抗体,分别为ASFV-K205R-Nb1、ASFV-K205R-Nb14、ASFV-K205R-Nb35、ASFV-K205R-Nb64和ASFV-K205R-Nb82。【结论】筛选的5株纳米抗体均具有良好的特异性,其中ASFV-K205R-Nb1、ASFV-K205R-Nb35和ASFV-K205R-Nb82具有更好的亲和力,为以纳米抗体作为灵敏探针建立的特异性强、灵敏度高、成本低的新型ASFV血清学诊断方法提供依据。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 K205R蛋白 VHH噬菌体文库 噬菌体展示 纳米抗体

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水稻表达HA蛋白为探针研制H9亚型禽流感抗体半定量快速检测试纸 被引量：2

7

作者 李雪洋 牛香香 +7 位作者 许倩茹 杨继飞 王雅楠 张申立 屈小天 陈金炫 张二芹 张改平 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第6期1137-1142,1199,共7页

建立一种禽流感H9亚型抗体半定量快速检测试纸,用于H9亚型禽流感(AIV)抗体的评价。含HA蛋白水稻粉末用提取液溶解后,离心,取上清,即为HA蛋白粗提液。其经过Q阴离填料和HA单抗亲和纯化,通过SDS-PAGE鉴定,重组HA蛋白纯度达到90%以上。利... 建立一种禽流感H9亚型抗体半定量快速检测试纸,用于H9亚型禽流感(AIV)抗体的评价。含HA蛋白水稻粉末用提取液溶解后,离心,取上清,即为HA蛋白粗提液。其经过Q阴离填料和HA单抗亲和纯化,通过SDS-PAGE鉴定,重组HA蛋白纯度达到90%以上。利用胶体金标记纯化HA蛋白为探针,兔抗鸡IgG和HA的多抗分别作为检测线和质控线,依据高致病性禽流感HI诊断技术标准,建立一种适用于监测AIV H9亚型的半定量试纸检测方法。结果表明:胶体金标记HA蛋白量为30 mg/L,兔抗鸡IgG和HA多抗最佳包被质量浓度分别为1.0和1.2 g/L。试纸检测H9N2亚型阳性血清(HI为11 log_(2))的最低检出限是1∶12 800,这相当于HI效价的4 log_(2)。试纸与H5 AIV、新城疫病毒(NDV)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)、新城疫病毒(NDV)和马立克病病毒(MDV)阳性血清以及H9亚型阴性血清无交叉反应,在室温下至少能保存6个月,与HI试验平行检测比较,两者的符合率为90.6%。因此本试验研制了一种简单、快速、准确、特异的半定量免疫层析试纸,适用于H9N2亚型抗体临床检测。 展开更多

关键词 H9N2亚型禽流感 水稻源HA蛋白 半定量免疫层析试纸 血凝抑制试验

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纳米疫苗在防控非洲猪瘟中的应用前景 被引量：2

8

作者 王亚楠 霍健 +5 位作者 黄冉 程航航 范道朋 王淑琪 何华 张改平 《河南农业大学学报》 CAS CSCD 2022年第5期715-723,共9页

现有非洲猪瘟(African swine fever,ASF)疫苗存在免疫原性差、全身不良反应大等缺点,使防疫手段相对局限。近年来,纳米疫苗在增强免疫反应、提高抗原利用率及保证安全性等方面展现出显著优势,因而被广泛研究。目前,在防控ASF中尚未出现... 现有非洲猪瘟(African swine fever,ASF)疫苗存在免疫原性差、全身不良反应大等缺点,使防疫手段相对局限。近年来,纳米疫苗在增强免疫反应、提高抗原利用率及保证安全性等方面展现出显著优势,因而被广泛研究。目前,在防控ASF中尚未出现有关纳米疫苗的报道。本综述介绍了ASF传统疫苗的研究现状,阐述了纳米疫苗的定义和种类,重点从免疫学角度分析了纳米疫苗在防控ASF的优势,并对纳米疫苗防控ASF研究前景进行了展望,以期为ASF疫苗的研发提供新的思路和方向。 展开更多

关键词 非洲猪瘟 纳米疫苗 纳米材料 抗原呈递 免疫效应

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非洲猪瘟病毒p54蛋白的截短表达及其单克隆抗体的制备

9

作者 郑南南 东梦珂 +6 位作者 吴宏举 侯浩宇 陈寅龙 李潮 赵慧君 张改平 杜永坤 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第11期2139-2144,共6页

非洲猪瘟在我国首次暴发至今已经3年多,给我国养猪业及其相关产业带来了严重的损失。本试验主要以非洲猪瘟病毒E183L基因编码的p54蛋白为研究对象,设计扩增截短E183L基因的引物,构建p54蛋白重组表达载体pET-28a(+)-p54,转化至感受态细胞... 非洲猪瘟在我国首次暴发至今已经3年多,给我国养猪业及其相关产业带来了严重的损失。本试验主要以非洲猪瘟病毒E183L基因编码的p54蛋白为研究对象,设计扩增截短E183L基因的引物,构建p54蛋白重组表达载体pET-28a(+)-p54,转化至感受态细胞BL21(DE3)中进行诱导表达,获得可溶性表达的重组p54蛋白,通过Ni柱得到良好纯化。之后免疫BALB/c小鼠,将免疫小鼠的脾脏与骨髓瘤细胞融合制备单克隆抗体,通过ELISA方法筛选和3次亚克隆共制备出2株能稳定分泌针对ASFV p54蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株。经ELISA测定抗体腹水效价在1∶100000~1∶1000000之间。Western blot检测表明单克隆抗体与p54蛋白能够特异性反应。经鉴定2株单克隆抗体亚型均为IgG2b,κ。该研究获得的单克隆抗体将为p54蛋白的生物学功能的研究和ASFV血清学检测奠定基础。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 p54蛋白 原核表达 单克隆抗体

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利用细菌人工染色体技术构建整合F基因的重组MDV疫苗株

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作者 朱潇静 王芮 +7 位作者 张欣欣 靳家鑫 路闻龙 丁大顺 霍翠梅 李青梅 孙爱军 庄国庆 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2021年第10期33-41,共9页

目的:预防马立克氏病病毒(MDV)和新城疫病毒(NDV)混合感染鸡引起的疾病,构建表达NDV F蛋白的MDV疫苗株CVI988 BAC重组载体,并包装成重组病毒,为疫苗免疫提供更多的重组疫苗选择。方法:首先利用PCR扩增带有卡那霉素(Kanamycin,Kana)抗性... 目的:预防马立克氏病病毒(MDV)和新城疫病毒(NDV)混合感染鸡引起的疾病,构建表达NDV F蛋白的MDV疫苗株CVI988 BAC重组载体,并包装成重组病毒,为疫苗免疫提供更多的重组疫苗选择。方法:首先利用PCR扩增带有卡那霉素(Kanamycin,Kana)抗性基因片段的F基因,采用同源重组的方法将其整合到CVI988 BAC上,进一步诱导I-SceI表达敲除Kana基因而获得重组质粒CVI988 BAC-F。通过磷酸钙法转染鸡胚成纤维细胞获得重组病毒。结果:Western blot和间接免疫荧光实验证实重组病毒能够表达F蛋白。病毒生长曲线和蚀斑大小测定结果表明,F基因的插入不影响病毒的体外增殖。结论:利用BAC技术成功构建了整合F基因的重组MDV病毒CVI988 BAC-F,为MDV重组疫苗研发,防控NDV与MDV共感染奠定了基础。 展开更多

关键词 细菌人工染色体 新城疫病毒 F基因 马立克氏病毒 重组疫苗

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H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白在水稻胚乳中的表达及其纯化

11

作者 屈小天 王雅楠 +4 位作者 许倩茹 李雪洋 张申立 张二芹 张改平 《河南农业科学》 北大核心 2024年第3期125-132,共8页

为制备H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白并评估其免疫原性,利用水稻表达系统表达H5N1亚型禽流感病毒重组HA蛋白。首先构建了重组植物表达载体pCAMBIA1300-HA,该载体具有GT13特有启动子、信号肽SP和终止子,有利于外源基因在水稻中表达。之后将... 为制备H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白并评估其免疫原性,利用水稻表达系统表达H5N1亚型禽流感病毒重组HA蛋白。首先构建了重组植物表达载体pCAMBIA1300-HA,该载体具有GT13特有启动子、信号肽SP和终止子,有利于外源基因在水稻中表达。之后将重组质粒pCAMBIA1300-HA通过电转化法导入根癌农杆菌EHA105中,筛选出阳性菌落并侵染水稻愈伤组织。经过暗培养、潮霉素筛选、分化、生根、成苗,采用CTAB法提取水稻叶片DNA,PCR鉴定结果显示,HA基因已插入到水稻基因组中,重组HA基因大小为4660 bp。将阳性植株移植到大田中,4个月后收获水稻种子,提取水稻胚乳蛋白,Western blot鉴定结果表明,HA蛋白在水稻胚乳中成功表达。重组HA蛋白通过Q阴离子层析、疏水层析和凝胶过滤层析三步分离纯化,其纯度达到90%以上。最后将纯化后的重组HA蛋白与ISA 50V佐剂混合并乳化制成疫苗,免疫小鼠,小鼠血清具有较高的特异性抗体水平,表明重组HA蛋白免疫原性较好。综上,成功构建了H5N1亚型禽流感病毒HA重组蛋白的水稻表达系统,并分离纯化获得了高纯度和免疫原性良好的重组HA蛋白。 展开更多

关键词 H5N1亚型禽流感病毒 HA蛋白 水稻胚乳表达 蛋白质纯化

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非洲猪瘟病毒p10蛋白和p49蛋白的生物信息学分析及表位预测

12

作者 孙卓雅 王梦翔 +5 位作者 宋金星 秦晓东 孙俊如 周蕾 吴亚楠 张改平 《江苏农业科学》 北大核心 2024年第15期195-202,共8页

运用多种生物信息技术对非洲猪瘟病毒(ASFV)Georgia 2007/1株p10蛋白和p49蛋白的理化性质、二级及三级空间结构、抗原性、抗原决定簇进行初步分析,并预测其B、T淋巴细胞优势表位。结果表明,p10是亲水性蛋白,含有2个抗原决定簇,该蛋白α... 运用多种生物信息技术对非洲猪瘟病毒(ASFV)Georgia 2007/1株p10蛋白和p49蛋白的理化性质、二级及三级空间结构、抗原性、抗原决定簇进行初步分析,并预测其B、T淋巴细胞优势表位。结果表明,p10是亲水性蛋白,含有2个抗原决定簇,该蛋白α-螺旋、β-转角、无规则卷曲和延伸链的比例为32.05%、11.54%、52.56%和3.85%;p49同样是亲水性蛋白,含有17个抗原决定簇,其α-螺旋、β-转角、无规则卷曲和延伸链的比例依次为29.91%、7.53%、55.94%和6.62%。基于以上分析,p10不适合用于ASF疫苗制备的候选蛋白;而p49作为亲水性衣壳蛋白,具有一定免疫原性,有望成为疫苗研制的备选蛋白,为ASFV蛋白研究和疫苗研发提供一定参考。 展开更多

关键词 非洲猪瘟 生物信息学 表位预测

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