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鸭坦布苏病毒RT-PCR检测方法的建立 被引量：10
1
作者 王永娟 董亚青 +1 位作者 郭方超 左伟勇 《黑龙江畜牧兽医（下半月）》 北大核心 2017年第5期105-107,共3页
为快速检测鸭坦布苏病毒(DTMUV),根据鸭坦布苏病毒E蛋白的基因序列设计一对特异性PCR引物,并以鸭坦布苏病毒基因组为模板,建立了鸭坦布苏病毒的特异性RT-PCR检测方法,进行了特异性和敏感性试验,并用该方法对采自江苏地区的疑似病料进行... 为快速检测鸭坦布苏病毒(DTMUV),根据鸭坦布苏病毒E蛋白的基因序列设计一对特异性PCR引物,并以鸭坦布苏病毒基因组为模板,建立了鸭坦布苏病毒的特异性RT-PCR检测方法,进行了特异性和敏感性试验,并用该方法对采自江苏地区的疑似病料进行了检测。结果表明:该方法可以特异性地扩增出鸭坦布苏病毒E蛋白基因保守区514 bp的序列,和对照的其他鸭病毒无交叉反应;敏感性较好,最低可检测到1 fg的基因组;临床样品的检出率为100%。说明所建立的RT-PCR检测方法特异性强、敏感性高,可用于临床快速诊断鸭坦布苏病毒。 展开更多
关键词 鸭 鸭坦布苏病毒(DTMUV) RT-PCR检测 方法建立 特异性 敏感性
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6种中药体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的作用 被引量：9
2
作者 刘云 朱善元 +4 位作者 龚祝南 秦枫 夏文龙 吴双 吴晓洁 《河南农业科学》 北大核心 2019年第10期147-154,共8页
为研究荆芥、委陵菜、啤酒花、翻白草、百部和虎杖6种中药体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的作用,建立了Marc-145细胞模型,在研究其对Marc-145细胞最大安全质量浓度的基础上,结合细胞形态观察和MTT法,对PRRSV进行阻断、抑制、灭活... 为研究荆芥、委陵菜、啤酒花、翻白草、百部和虎杖6种中药体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的作用,建立了Marc-145细胞模型,在研究其对Marc-145细胞最大安全质量浓度的基础上,结合细胞形态观察和MTT法,对PRRSV进行阻断、抑制、灭活3种作用方式的测定。结果显示,荆芥、委陵菜、啤酒花、翻白草、百部和虎杖对Marc-145细胞的最大安全质量浓度分别为0.25 mg/mL、1.25 mg/mL、0.63 mg/mL、0.31 mg/mL、1.56 mg/mL和0.47 mg/mL。在体外抗PRRSV作用的试验中,从细胞形态观察发现,委陵菜和虎杖药物组均未出现明显的细胞病变,其余4种药物组都出现了不同程度的细胞病变;从对PRRSV的抑制率来看,荆芥对PRRSV的阻断、抑制和直接灭活作用的最高抑制率分别为80.6%、52.2%和56.5%,委陵菜3种作用方式对PRRSV的最高抑制率分别为115.8%、93.0%和125.4%,啤酒花3种作用方式对PRRSV的最高抑制率分别为61.5%、32.0%和82.4%,翻白草3种作用方式对PRRSV的最高抑制率分别为15.6%、129.4%和57.7%,百部3种作用方式对PRRSV的最高抑制率分别为120.2%、61.8%和71.9%,虎杖3种作用方式对PRRSV的最高抑制率分别为110.4%、94.3%和130.8%。综合细胞形态观察和抑制率结果,委陵菜和虎杖抗PRRSV的效果最好,其次是荆芥和百部。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 中药 抗病毒 体外 细胞病变 抑制率
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猪伪狂犬病毒YZ株的分离鉴定及遗传进化分析 被引量：8
3
作者 傅宏庆 姚志兰 +1 位作者 刘轶秋 王永娟 《扬州大学学报（农业与生命科学版）》 CAS 北大核心 2020年第5期36-41,共6页
为了解猪伪狂犬病毒(PRV)流行变异株的病原学特性及分子遗传变异特点,从江苏扬州市某发病猪场采集病料,经无菌处理后接种BHK-21细胞并连续传代,分离获得1株病毒。通过细胞病变观察、PCR鉴定、电镜观察和动物感染试验,证明该毒株为伪狂... 为了解猪伪狂犬病毒(PRV)流行变异株的病原学特性及分子遗传变异特点,从江苏扬州市某发病猪场采集病料,经无菌处理后接种BHK-21细胞并连续传代,分离获得1株病毒。通过细胞病变观察、PCR鉴定、电镜观察和动物感染试验,证明该毒株为伪狂犬病毒,将其命名为YZ株。利用PCR扩增、测序,获得YZ株的gB与gE基因序列,基因同源性分析与遗传进化分析表明:YZ株gB与gE基因与我国猪伪狂犬变异毒株同源性均在99.2%以上,且位于同一进化分支,提示该毒株与流行于我国的猪伪狂犬变异毒株亲缘关系较近。进一步研究YZ株的致病性,将该毒株P5代细胞培养液人工感染60日龄PRV阴性健康猪。结果表明:试验猪在感染病毒后出现发热、呕吐、腹泻、咳嗽、呼吸困难和神经症状,发病率达100%。感染猪剖检病变为脑组织水肿出血、肝脏组织表面出现灰白色坏死灶。综上, PRV-YZ株遗传进化分析与致病性研究表明该毒株为猪伪狂犬变异毒株。这一研究可为江苏省PRV的流行病学、遗传进化分析以及免疫防控提供参考。 展开更多
关键词 伪狂犬病毒 变异株 进化树分析 致病性
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GC-MS/MS法快速测定党参等中药中3种拟除虫菊酯类农药残留的方法学研究 被引量：3
4
作者 张乐 于生兰 +5 位作者 秦枫 徐加兵 高岭梅 杨海峰 谢恺舟 仇雅静 《扬州大学学报（农业与生命科学版）》 CAS 北大核心 2023年第1期132-138,共7页
通过对比气相色谱法(GC)和气相色谱-串联质谱(GC-MS/MS)联用2种检测技术,建立党参、黄芪等5种中药中常见的联苯菊酯、甲氰菊酯和氯氟氰菊酯3种拟除虫菊酯类农药残留量的检测方法。结果表明:在与GC-MS/MS法同一样品浓度下,采用配置ECD检... 通过对比气相色谱法(GC)和气相色谱-串联质谱(GC-MS/MS)联用2种检测技术,建立党参、黄芪等5种中药中常见的联苯菊酯、甲氰菊酯和氯氟氰菊酯3种拟除虫菊酯类农药残留量的检测方法。结果表明:在与GC-MS/MS法同一样品浓度下,采用配置ECD检测器的GC法检测信号强度较弱,无法在较低浓度下进行农药残留量的定量分析;而通过GC-MS/MS法,以联苯菊酯、甲氰菊酯和氯氟氰菊酯含量测定为研究目标,通过MRM模式在线检测,优化GC-MS/MS检测条件,具有较好的信号强度,可采用外标法进行含量测定。线性范围在1.95~21.79 ng·g^(-1)之间,线性关系良好,最低检出限为0.25~0.50 ng·g^(-1),定量限为0.84~1.67 ng·g^(-1),决定系数R2为0.987 5~0.998 1, 5种中药的加标回收率为87.45%~92.82%,精密度为3.08%~4.78%,相对标准偏差为5.53%~6.41%。综上,GC-MS/MS方法具有灵敏度高、操作快捷、定性定量准确,可用于5种药食同源中药中3种拟除虫菊酯类农药残留的检测。 展开更多
关键词 中草药 气相色谱-串联质谱联用技术 拟除虫菊酯类农药 农药残留检测
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响应面法优化壳聚糖对三七茎叶皂苷提取液除杂工艺的影响 被引量：7
5
作者 秦枫 朱善元 +3 位作者 李金贵 辛雪梅 王安平 吴双 《河南农业科学》 北大核心 2019年第7期155-160,共6页
在单因素分析的基础上,以药液质量体积比、壳聚糖用量和作用温度为自变量,以固形物去除率和皂苷保留率为评价指标,设计了三因素三水平响应面法优化试验,研究壳聚糖用于三七茎叶皂苷提取液除杂的最佳工艺。结果表明,三七茎叶皂苷提取液... 在单因素分析的基础上,以药液质量体积比、壳聚糖用量和作用温度为自变量,以固形物去除率和皂苷保留率为评价指标,设计了三因素三水平响应面法优化试验,研究壳聚糖用于三七茎叶皂苷提取液除杂的最佳工艺。结果表明,三七茎叶皂苷提取液除杂最佳工艺:药液质量体积比[生药质量(g)∶提取液体积(mL)]为1∶6,壳聚糖(1%溶液)用量(壳聚糖溶液体积与生药量之比)为0.8 mL/g,作用温度为65℃。三七茎叶皂苷提取液除杂工艺优化后,固形物去除率及皂苷保留率分别为26.09%、96.10%,其RSD分别为1.54%、0.69%,重现性较好,表明该模型有效。 展开更多
关键词 三七 壳聚糖 固形物去除率 皂苷质量浓度 响应面法
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三七总皂苷粗提物S-3溶血性及体外免疫活性的研究 被引量：7
6
作者 陈毓 秦枫 +2 位作者 朱善元 杨海峰 李锋涛 《扬州大学学报（农业与生命科学版）》 CAS 北大核心 2019年第4期84-88,共5页
经大孔吸附树脂分离纯化,从三七中得到三七总皂苷(PNS) S-3组分,研究其溶血性及体外免疫活性。采用红细胞溶血率测定溶血性,以体外小鼠T、B淋巴细胞增殖反应及IL-2诱生检测S-3的体外免疫活性。结果表明:S-3浓度在0.25 mg·mL^-1以... 经大孔吸附树脂分离纯化,从三七中得到三七总皂苷(PNS) S-3组分,研究其溶血性及体外免疫活性。采用红细胞溶血率测定溶血性,以体外小鼠T、B淋巴细胞增殖反应及IL-2诱生检测S-3的体外免疫活性。结果表明:S-3浓度在0.25 mg·mL^-1以下时无溶血性,在125μg·mL^-1以下时未表现出对脾淋巴细胞活力有抑制作用。S-3浓度为10μg·mL^-1时对刀豆蛋白A诱导的体外小鼠T淋巴细胞增殖有极显著促进作用,为100μg·mL^-1时则极显著抑制T淋巴细胞增殖反应;而PNS浓度在1~100μg·mL^-1范围内均呈现出显著促进作用, S-3浓度为10、100μg·mL^-1时极显著抑制LPS诱导的小鼠B淋巴细胞增殖作用,在此浓度下PNS显示出对B淋巴细胞增殖有显著或极显著促进作用。S-3浓度为25μg·mL^-1时极显著促进小鼠T淋巴细胞IL-2分泌,与相同浓度的PNS相比, S-3无更显著的促进作用。这一研究提示S-3具有较好的安全性,且在体外具有一定的细胞免疫活性和诱生细胞因子的能力,为从PNS中开发出安全、高效的动物免疫增强剂奠定了基础。 展开更多
关键词 三七皂苷 溶血性 脾淋巴细胞毒性 体外免疫活性
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牡丹籽油对小鼠免疫功能的影响 被引量：7
7
作者 孙燕 李成忠 左伟勇 《上海农业学报》 CSCD 2018年第6期65-68,共4页
为研究牡丹籽油对小鼠免疫功能的影响,以21日龄ICR清洁级雄性小鼠为研究对象,连续灌胃不同剂量的牡丹籽油及牡丹籽油复合物20 d,测定并分析血清NO、NOS,脾脏IL-2、IL-6、TNF-α和肠粘膜组织s Ig A的变化。结果表明:与对照相比,牡丹籽油... 为研究牡丹籽油对小鼠免疫功能的影响,以21日龄ICR清洁级雄性小鼠为研究对象,连续灌胃不同剂量的牡丹籽油及牡丹籽油复合物20 d,测定并分析血清NO、NOS,脾脏IL-2、IL-6、TNF-α和肠粘膜组织s Ig A的变化。结果表明:与对照相比,牡丹籽油能显著提高小鼠血清NO水平和脾脏IL-2水平,显著降低脾脏TNF-α水平,并能显著提高肠道粘膜s Ig A水平,说明牡丹籽油能提高动物机体的免疫机能。 展开更多
关键词 牡丹籽油 ICR小鼠 免疫功能
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荧光定量RT-PCR检测高致病性PRRSV接触感染仔猪增殖动态 被引量：6
8
作者 夏文龙 余树培 +4 位作者 吴植 郭长明 卢会鹏 孙怀昌 朱善元 《江苏农业科学》 2018年第10期169-172,共4页
为检测高致病性PRRSV接触感染仔猪的增殖动态,建立了荧光定量RT-PCR方法,该方法在模板为2.18×10~1~2.18×10~6拷贝范围内具有良好线性关系,相关系数为0.996,灵敏度比常规RT-PCR高1 000倍,并且与其他猪病病毒无交叉反应;在3头... 为检测高致病性PRRSV接触感染仔猪的增殖动态,建立了荧光定量RT-PCR方法,该方法在模板为2.18×10~1~2.18×10~6拷贝范围内具有良好线性关系,相关系数为0.996,灵敏度比常规RT-PCR高1 000倍,并且与其他猪病病毒无交叉反应;在3头健康仔猪中引入1头PRRSV人工感染猪,定期监测仔猪接触感染PRRSV后病毒血症和排毒水平,研究结果表明,接触感染猪后分别于3、5 d首次在血清和粪便中检出PRRSV,相比人工接种猪推迟2 d,此后7 d内病毒含量迅速上升并维持较高水平直至死亡。本研究为PRRSV在猪体内的定量检测提供了有效手段,为进一步了解PRRSV的传播机制以及建立防治PRRSV感染的仔猪模型提供了基础数据。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征 荧光定量RT-PCR 增殖动态
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江苏省部分地区水禽肠道外致病性大肠杆菌的分离鉴定及生物学特性研究 被引量：2
9
作者 郭长明 陈怀君 +5 位作者 袁橙 封琦 王永娟 徐海 吴双 朱善元 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2023年第3期25-33,共9页
本研究旨在明确江苏地区水禽致病性大肠杆菌的血清型、进化分群、毒力基因分布和耐药情况,以期为水禽大肠杆菌病的防控提供依据。本研究从江苏省部分规模化水禽养殖场疑似大肠杆菌感染病例中,分离得到24株水禽肠道外致病性大肠杆菌,并... 本研究旨在明确江苏地区水禽致病性大肠杆菌的血清型、进化分群、毒力基因分布和耐药情况,以期为水禽大肠杆菌病的防控提供依据。本研究从江苏省部分规模化水禽养殖场疑似大肠杆菌感染病例中,分离得到24株水禽肠道外致病性大肠杆菌,并检测分离菌株的血清型、毒力基因分布、系统进化分群和耐药情况。血清型检测结果表明,O65血清型菌株共8株,占全部菌株的33.3%,O16、O68、O87、O126、O138、O164血清型菌株各1株,其他未鉴定血清型10株;毒力基因检测结果表明,fimA、ECs3737、ECs3703、tsh和irp2基因在分离菌株中的阳性率分别为83.3%、75.0%、66.7%、33.3%和4.2%,其中含有4个毒力基因组合的菌株占29.2%;系统进化分群结果表明,非致病群A占45.8%,低致病群B1占33.3%,高致病群B2和D分别占8.3%、1.3%;药敏试验结果表明,24株分离菌株均对恩诺沙星、强力霉素100%耐药,对四环素、万古霉素、红霉素的耐药率为91.7%,对阿莫西林/棒酸的敏感率为100%。本研究结果表明,江苏省水禽致病性大肠杆菌血清型较为复杂、耐药性严重。 展开更多
关键词 禽致病性大肠杆菌 血清型 毒力基因 耐药性
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鸭呼肠孤病毒的RT-PCR检测方法的建立 被引量：6
10
作者 王永娟 左伟勇 +4 位作者 朱善元 王安平 吴双 洪伟鸣 陆辉 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2016年第5期1107-1110,共4页
为快速检测临床鸭呼肠孤病毒的感染情况,根据鸭呼肠孤病毒σC蛋白的基因序列设计1对特异性PCR引物,并以呼肠孤病毒基因组为模板,建立了鸭呼肠孤病毒的特异性RT-PCR检测方法。采集江苏省多地疑似呼肠孤病毒感染病料,提取基因组DNA进行RT-... 为快速检测临床鸭呼肠孤病毒的感染情况,根据鸭呼肠孤病毒σC蛋白的基因序列设计1对特异性PCR引物,并以呼肠孤病毒基因组为模板,建立了鸭呼肠孤病毒的特异性RT-PCR检测方法。采集江苏省多地疑似呼肠孤病毒感染病料,提取基因组DNA进行RT-PCR扩增,产物经测序鉴定后判断建立的方法对临床样品的检出率。结果显示,该方法可以特异性扩增鸭呼肠孤病毒σC基因保守区438 bp的序列,与其他鸭病毒无交叉反应,最低可检测1 fg基因组DNA,对于临床样品检出率为100%。该方法可以用于临床快速诊断鸭呼肠孤病毒感染。 展开更多
关键词 鸭 呼肠孤病毒 RT-PCR 检测
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鸭源H9N2亚型禽流感病毒RT-PCR检测方法的建立 被引量：5
11
作者 王永娟 董亚青 +2 位作者 郭方超 左伟勇 孟婷 《江苏农业科学》 2018年第1期105-106,115,共3页
为建立鸭H9N2亚型禽流感病毒的监测及临床诊断方法,根据鸭源H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白的基因序列设计1对特异性PCR引物,并以鸭源H9N2亚型禽流感病毒基因组为模板,建立鸭源H9N2亚型禽流感病毒的特异性RT-PCR检测方法,并用该方法对江苏省... 为建立鸭H9N2亚型禽流感病毒的监测及临床诊断方法,根据鸭源H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白的基因序列设计1对特异性PCR引物,并以鸭源H9N2亚型禽流感病毒基因组为模板,建立鸭源H9N2亚型禽流感病毒的特异性RT-PCR检测方法,并用该方法对江苏省多地采集的疑似病料进行检测,扩增产物经测序鉴定后判断建立的方法对临床样品的检出率。结果显示,该方法可以特异性扩增鸭源H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白基因保守区的837 bp的序列,与对照的病毒无交叉反应,敏感性较好,最低可检测1fg基因组,临床样品的检测率为100%,表明本试验建立的鸭源H9N2亚型禽流感病毒RT-PCR特异性强、敏感性高,可用于临床快速诊断鸭源H9N2亚型禽流感病毒感染。 展开更多
关键词 鸭 H9N2亚型禽流感病毒 RT-PCR 检测
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应用iTRAQ定量蛋白质组学技术筛选无乳链球菌鱼源株与牛源株差异表达蛋白 被引量：4
12
作者 郭长明 袁橙 +3 位作者 朱善元 刘广锦 陆承平 刘永杰 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2017年第4期868-873,共6页
为揭示不同宿主来源无乳链球菌致病机制,提取无乳链球菌鱼源株GD201008-001和牛源株ATCC13813的全菌蛋白质,经iTRAQ试剂标记后进行质谱鉴定,质谱数据用软件Mascot2.2和Proteome Discoverer1.4进行查库(UniProt数据库)鉴定及定量分析,并... 为揭示不同宿主来源无乳链球菌致病机制,提取无乳链球菌鱼源株GD201008-001和牛源株ATCC13813的全菌蛋白质,经iTRAQ试剂标记后进行质谱鉴定,质谱数据用软件Mascot2.2和Proteome Discoverer1.4进行查库(UniProt数据库)鉴定及定量分析,并利用blast2go软件对差异蛋白质进行GO(gene ontology)功能注释。共鉴定出在鱼源株GD201008-001和牛源株ATCC13813中差异表达的蛋白质17个(P<0.05),其中在ATCC13813中上调表达的蛋白质3个(比值>1.500),下调表达的蛋白质14个(比值<0.667)。GO分析预测结果表明这些蛋白质主要参与15个生物学功能,涉及代谢过程、细胞成分、结合、催化活性、结构分子活性等。其中cpsIVK在牛源株ATC13813中下调最显著,其功能为荚膜生物合成蛋白质,与无乳链球菌荚膜合成相关。进一步验证发现,鱼源株GD201008-001抵抗小鼠巨噬细胞RAW264.7吞噬的能力显著高于cpsIVK下调的牛源株ATCC13813(P<0.01),提示cpsIVK可能在鱼源无乳链球菌逃避宿主免疫细胞吞噬过程中发挥功能。 展开更多
关键词 无乳链球菌 鱼源株 牛源株 ITRAQ cpsIVK基因 蛋白质组学
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肠炎型犬细小病毒的分离鉴定及病毒滴度测定 被引量：4
13
作者 吴双 朱善元 +5 位作者 郭长明 秦枫 左伟勇 王永娟 洪伟鸣 王安平 《江苏农业科学》 2018年第23期173-175,共3页
为获得肠炎型犬细小病毒分离株,采集犬细小病毒胶体金初检阳性的3份粪便,采用同步接毒法分别接种猫肾细胞(F81)和犬肾细胞(MDCK)进行分离培养,F81盲传至第2代出现细胞病变,MDCK盲传至第3代出现细胞病变,2种细胞均仅从病料3中分离出1株... 为获得肠炎型犬细小病毒分离株,采集犬细小病毒胶体金初检阳性的3份粪便,采用同步接毒法分别接种猫肾细胞(F81)和犬肾细胞(MDCK)进行分离培养,F81盲传至第2代出现细胞病变,MDCK盲传至第3代出现细胞病变,2种细胞均仅从病料3中分离出1株病毒。采用PCR方法鉴定该分离株为犬细小病毒并命名为CPV3。根据VP2基因核苷酸序列绘制的系统进化树及其推导氨基酸序列的分析,确定CPV3属于CPV-2a亚型。测定CPV3在MDCK中72 h时的组织细胞半数感染量(TCID50),第5代次(CPV-M-5)和第10代次(CPV-M-10)的TCID50数值分别为10-4. 83/0. 1 mL和10-5. 50/0. 1 mL,这为后续测定重组犬干扰素活性试验提供了材料。 展开更多
关键词 犬细小病毒 细胞病变 CPV-2a亚型 组织细胞半数感染量
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地塞米松促进猪繁殖与呼吸综合征病毒致病性 被引量：3
14
作者 王永娟 朱善元 +2 位作者 刘博 崔平福 左伟勇 《江苏农业科学》 北大核心 2016年第7期293-295,共3页
为检测地塞米松对猪感染PRRSV后免疫力及致病性的影响,将6头健康猪平分为2组,分别注射地塞米松和生理盐水,连续注射3 d。检测注射前、注射后1周的PRRSV抗体阳性率及病毒量,观察并记录体温、呼吸、饮食、眼结膜、粪便等临床情况。结果显... 为检测地塞米松对猪感染PRRSV后免疫力及致病性的影响,将6头健康猪平分为2组,分别注射地塞米松和生理盐水,连续注射3 d。检测注射前、注射后1周的PRRSV抗体阳性率及病毒量,观察并记录体温、呼吸、饮食、眼结膜、粪便等临床情况。结果显示,猪的PRRSV抗体阳性率为100%,但注射后的抗体值高于注射前;病毒蛋白半定量结果显示病毒感染量显著增加;注射地塞米松组的猪表现出一定临床症状,而对照组未发生变化。结果表明,地塞米松会增加PRRSV的发病风险,为建立防治PRRSV感染的动物模型奠定了基础,为兽医临床中合理使用糖皮质激素类药物提出新的要求。 展开更多
关键词 糖皮质类激素 地塞米松 猪繁殖与呼吸综合征病毒 致病性
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内含肽-弹性蛋白介导的人溶菌酶在毕赤酵母中的表达 被引量：3
15
作者 王安平 朱善元 +3 位作者 吴双 王永娟 左伟勇 洪伟鸣 《扬州大学学报（农业与生命科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2014年第1期22-26,共5页
将人溶菌酶、内含肽、弹性蛋白3个基因串联插入巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K中,获得重组质粒pPIC-MIELYZ,经Pme I酶切线性化后电转化毕赤酵母GS115,经G418筛选阳性克隆,并用甲醇诱导表达,以探讨内含肽-弹性蛋白介导的人溶菌酶在... 将人溶菌酶、内含肽、弹性蛋白3个基因串联插入巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K中,获得重组质粒pPIC-MIELYZ,经Pme I酶切线性化后电转化毕赤酵母GS115,经G418筛选阳性克隆,并用甲醇诱导表达,以探讨内含肽-弹性蛋白介导的人溶菌酶在毕赤酵母中的表达情况。结果表明:SDS-PAGE和Western blot证实表达的融合蛋白分子量正确,抑菌试验表明融合蛋白对微球菌具有良好的抑菌效果。说明融合基因在毕赤酵母中成功表达,为后继的纯化工作及新型毕赤酵母表达载体的构建奠定基础。 展开更多
关键词 人溶菌酶 毕赤酵母 内含肽 弹性蛋白
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抗四环素单链抗体基因的构建与序列测定 被引量：3
16
作者 左伟勇 王永娟 +2 位作者 陆辉 洪伟鸣 刘莉 《生物技术通讯》 CAS 2013年第6期836-839,共4页
目的:构建抗盐酸四环素的单链抗体(scFv)基因。方法:以抗盐酸四环素单克隆抗体杂交瘤细胞株的总RNA为模板,用RT-PCR法扩增全套抗体轻、重链基因;经重叠延伸反应,以编码柔性多肽(Gly4Ser)3的基因为接头,将轻、重链基因组装为完整的scFv基... 目的:构建抗盐酸四环素的单链抗体(scFv)基因。方法:以抗盐酸四环素单克隆抗体杂交瘤细胞株的总RNA为模板,用RT-PCR法扩增全套抗体轻、重链基因;经重叠延伸反应,以编码柔性多肽(Gly4Ser)3的基因为接头,将轻、重链基因组装为完整的scFv基因,并克隆到pGEMT-Easy载体中进行测序分析。结果:所克隆的四环素scFV基因全长为735 bp,为VH-Linker-VL结构,VH基因为354 bp,Linker为(Gly4Ser)3多肽的核酸序列,VL基因为336bp。结论:构建了抗四环素的单链抗体基因,为进一步用于四环素的残留检测奠定基础。 展开更多
关键词 四环素 单链抗体 测序
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响应面法优化ZTC1+1Ⅱ型澄清剂对三七茎叶皂苷提取液的除杂工艺 被引量：2
17
作者 秦枫 李金贵 +3 位作者 朱善元 王红昀 王安平 吴双 《湖北农业科学》 2020年第20期150-154,169,共6页
为确定ZTC1+1Ⅱ型天然澄清剂用于三七(Panax notoginseng)茎叶皂苷提取液除杂的最佳工艺,在单因素分析的基础上,以药物质量浓度、澄清剂用量、作用温度为自变量,以皂苷含量和固形物去除率作为评价指标,建立三因素三水平的Design-Expert... 为确定ZTC1+1Ⅱ型天然澄清剂用于三七(Panax notoginseng)茎叶皂苷提取液除杂的最佳工艺,在单因素分析的基础上,以药物质量浓度、澄清剂用量、作用温度为自变量,以皂苷含量和固形物去除率作为评价指标,建立三因素三水平的Design-Expert响应面分析方法。结果表明,最佳除杂工艺为药液质量浓度(生药质量与皂苷提取液体积之比)为0.19 g/mL,ZTC1+1Ⅱ型天然澄清剂2组分加入顺序为先B组分后A组分,澄清剂B组分和A组分加入量分别为10%、5%药液体积,作用温度为40℃。在此工艺条件下进行三七茎叶皂苷提取液除杂工艺的优化,得出固形物去除率为28.40%,皂苷保留率为92.22%,其相对标准偏差(RSD)分别为1.74%和0.56%,重现性较好,验证了该模型的有效性。 展开更多
关键词 三七(Panax notoginseng)茎叶 ZTC1+1Ⅱ型澄清剂 皂苷含量 固形物去除率 响应面法
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新城疫病毒LaSota疫苗株的准种遗传变异分析 被引量：2
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作者 吴双 王永娟 +4 位作者 左伟勇 王安平 洪伟鸣 秦枫 朱善元 《江苏农业科学》 北大核心 2014年第3期161-163,共3页
为开展新城疫病毒(NDV)LaSota疫苗株的反向遗传操作技术研究,了解该病毒的准种分化情况,运用鸡胚极限稀释法对NDV LaSota疫苗株进行传代纯化,选择病毒稀释度最高、血凝价较高的鸡胚尿囊液作为传代接种物,传至第5代,RT-PCR扩增序列,测定... 为开展新城疫病毒(NDV)LaSota疫苗株的反向遗传操作技术研究,了解该病毒的准种分化情况,运用鸡胚极限稀释法对NDV LaSota疫苗株进行传代纯化,选择病毒稀释度最高、血凝价较高的鸡胚尿囊液作为传代接种物,传至第5代,RT-PCR扩增序列,测定并分析其全基因组序列,阐述LaSota疫苗株准种分化情况,为基因工程疫苗的研制奠定了一定基础。 展开更多
关键词 新城疫病毒 LaSota疫苗株 准种 极限稀释法
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1型鸭肝炎病毒RT-PCR快速检测方法的建立 被引量：2
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作者 王永娟 朱善元 +3 位作者 王安平 吴双 洪伟鸣 左伟勇 《河南农业科学》 CSCD 北大核心 2017年第2期116-119,共4页
为建立快速检测临床1型鸭肝炎病毒(DHAV-1)感染的方法,根据DHAV-1的vp1基因序列设计1对引物,以DHAV-1及其他常见的感染鸭的病毒基因组为模板,建立了DHAV-1的特异性RT-PCR检测方法;以10倍梯度稀释的DHAV-1 RNA为模板,测定该方法的灵敏度... 为建立快速检测临床1型鸭肝炎病毒(DHAV-1)感染的方法,根据DHAV-1的vp1基因序列设计1对引物,以DHAV-1及其他常见的感染鸭的病毒基因组为模板,建立了DHAV-1的特异性RT-PCR检测方法;以10倍梯度稀释的DHAV-1 RNA为模板,测定该方法的灵敏度;采集江苏多地的疑似DHAV-1感染病料,提取基因组进行RT-PCR扩增,产物经测序鉴定后判断所建立方法的检测率。结果显示,建立的方法可以特异性扩增DHAV-1 vp1基因保守区360 bp的序列,最低可检测1 fg基因组模板,对临床样品检测率为100%。表明,成功建立了特异性强、灵敏度高且可以用于临床快速诊断DHAV-1感染的方法。 展开更多
关键词 鸭 1型鸭肝炎病毒 反转录PCR 检测
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抗氯霉素单链抗体基因扩增与序列测定 被引量：2
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作者 陆辉 左伟勇 +2 位作者 王健 洪伟鸣 王永娟 《江苏农业科学》 北大核心 2013年第10期28-30,共3页
以抗氯霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株的总RNA为模板,利用RT-PCR法扩增全套抗体轻链、重链基因;经重叠延伸反应,以编码柔性多肽(Gly4Ser)3基因为接头,将轻链、重链基因组装为完整的单链抗体(ScFv)基因,并克隆到pGEMT-Easy载体中测序分析。... 以抗氯霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株的总RNA为模板,利用RT-PCR法扩增全套抗体轻链、重链基因;经重叠延伸反应,以编码柔性多肽(Gly4Ser)3基因为接头,将轻链、重链基因组装为完整的单链抗体(ScFv)基因,并克隆到pGEMT-Easy载体中测序分析。结果表明,所克隆的氯霉素ScFv基因全长为726 bp,为VH-Linker-VL结构,VH基因为345 bp,Linker为(Gly4Ser)3多肽的核酸序列,VL基因为336 bp。本研究首次成功构建抗氯霉素的单链抗体基因,为进一步用于氯霉素的残留检测奠定基础。 展开更多
关键词 氯霉素 单链抗体 测序
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