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微管抑制及尾桥蛋白磷酸化促进骨肉瘤细胞U2OS微核形成
1
作者 阮荻 孙林 +3 位作者 潘高 周文豪 林怡然 龚业莉 《华中科技大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期207-213,共7页
目的探讨微管及微管相关蛋白尾桥蛋白在肿瘤细胞微核形成中的作用。方法利用DAPI染色检测不同类型细胞自发微核率;利用诺考达唑(nocodazole)抑制微管聚集后,DAPI染色和胞质分裂阻滞(cytokinesis-block,CB)微核实验观察人骨肉瘤细胞株U2O... 目的探讨微管及微管相关蛋白尾桥蛋白在肿瘤细胞微核形成中的作用。方法利用DAPI染色检测不同类型细胞自发微核率;利用诺考达唑(nocodazole)抑制微管聚集后,DAPI染色和胞质分裂阻滞(cytokinesis-block,CB)微核实验观察人骨肉瘤细胞株U2OS中微核形成情况;免疫荧光多重染色检测诺考达唑处理不同时间对U2OS细胞中微管及尾桥蛋白的影响;在U2OS细胞中过表达尾桥蛋白或利用collybistin使尾桥蛋白磷酸化,再利用免疫荧光及DAPI染色检测其对微管及微核形成的影响。结果相对于人胚肾HEK293细胞和原代神经细胞,U2OS自发微核率更高;诺考达唑处理使U2OS细胞微核数量增加,且与释放时间相关;诺考达唑处理使尾桥蛋白分布改变,逐渐聚集于细胞核;U2OS细胞中磷酸化尾桥蛋白主要表达于分裂期细胞;过表达尾桥蛋白和(或)增加其磷酸化水平并不影响U2OS细胞中微管蛋白的表达,但过表达尾桥蛋白并增加其磷酸化水平可使微核数量增多。结论肿瘤细胞内微核形成与微管聚集能力关系密切,可形成于细胞周期不同时期,具有积累效应。尾桥蛋白磷酸化后细胞中微核数量增多,提示其可能参与调节肿瘤细胞微核形成。 展开更多
关键词 微管 微核 尾桥蛋白 诺考达唑 collybistin U2OS
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人MR1/IgG1Fc二聚体融合蛋白的构建、表达及功能检测
2
作者 赵桂华 龚业莉 翁秀芳 《华中科技大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2023年第5期649-655,共7页
目的构建MR1/IgG1Fc融合蛋白杆状病毒表达载体并使其在昆虫细胞内表达获得MR1/IgG1Fc二聚体,制备人工抗原提呈细胞用于黏膜相关恒定T细胞(MAIT)反应性代谢物及MAIT细胞功能调控研究。方法从人外周血单个核细胞中扩增β2m编码基因。商业... 目的构建MR1/IgG1Fc融合蛋白杆状病毒表达载体并使其在昆虫细胞内表达获得MR1/IgG1Fc二聚体,制备人工抗原提呈细胞用于黏膜相关恒定T细胞(MAIT)反应性代谢物及MAIT细胞功能调控研究。方法从人外周血单个核细胞中扩增β2m编码基因。商业化合成MR1胞外段和IgG1Fc融合基因的全序列基因MR1/IgG1Fc,与β2m基因重组构建pFastBac^(TM)Dual+[β2m+MR1/IgG1Fc]表达载体;利用Bac-to-Bac昆虫表达系统表达MR1/IgG1Fc二聚体融合蛋白,并通过双抗体夹心ELISA、Western blot及流式细胞术进行检测。建立MR1/IgG1Fc二聚体加载的人工抗原提呈细胞(artificial antigen presenting cells,aAPCs),即MR1aAPCs,提呈大肠埃希菌(DH5α)来源的代谢物,与人外周血单个核细胞共培养,检测MAIT细胞的活化和增殖水平。结果经PCR及测序鉴定证实pFastBac^(TM)Dual+[β2m+MR1/IgG1Fc]载体中MR1/IgG1Fc与β2m具有正确序列。ELISA、Western blot及流式细胞术检测结果表明MR1/IgG1Fc二聚体在重组杆粒感染的Sf9细胞培养上清富集,具有正确构象。加载DH5α来源代谢物的MR1aAPCs能够促进MAIT细胞活化和增殖。结论成功构建pFastBac^(TM)Dual+[β2m+MR1/IgG1Fc]重组质粒,并在Sf9细胞中表达MR1/IgG1Fc二聚体,制备获得MR1aAPCs,为研究MAIT细胞反应性代谢物及MAIT细胞功能提供了新的工具。 展开更多
关键词 黏膜相关恒定T细胞 MR1/IgG1Fc二聚体 人工抗原提呈细胞 反应性代谢物
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特应性皮炎免疫浸润相关miR-155靶基因的筛选及验证
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作者 王晓晨 陈露 +3 位作者 刘畅 陈晓青 李芃 邱文洪 《山东医药》 CAS 2023年第21期15-19,共5页
目的筛选与特应性皮炎(AD)免疫浸润相关的miR-155靶基因,并进行细胞实验验证。方法从GEO数据库获取AD基因表达谱数据集GSE121212和GSE157194,筛选出AD皮损区差异表达基因,并进行GO功能富集分析、KEGG通路富集分析,构建蛋白互作网络(PPI... 目的筛选与特应性皮炎(AD)免疫浸润相关的miR-155靶基因,并进行细胞实验验证。方法从GEO数据库获取AD基因表达谱数据集GSE121212和GSE157194,筛选出AD皮损区差异表达基因,并进行GO功能富集分析、KEGG通路富集分析,构建蛋白互作网络(PPI)。基于CIBERSORT算法,分析AD患者免疫细胞浸润情况。利用miRNet网站预测miR-155靶基因,并筛选与AD免疫浸润相关的miR-155靶基因。将人永生化角质形成细胞株HaCaT细胞分为control组和TI组,TI组细胞加入TNF-α和IFN-γ构建炎症模型,control组常规培养,采用qRT-PCR法检测TI组、control组细胞中miR-155。取TI组HaCaT细胞分成TI+miR-155 mimics组、TI+mimics NC组,TI+miR-155 mimics组转染miR-155过表达质粒miR-155 mimics,TI+mimics NC组转染过表达对照质粒mimics NC,采用qRT-PCR法检测TI+miR-155 mimics组、TI+mimics NC组细胞中CXCL1、CXCL8 mRNA。结果筛选得到519个AD皮损区差异表达基因。GO功能富集分析结果显示,差异表达基因主要参与免疫系统过程、免疫反应、对外部刺激的反应、防御反应、免疫系统的调节等生物过程,KEGG通路富集分析结果显示,通路主要富集在细胞因子—细胞因子受体相互作用、病毒蛋白与细胞因子及细胞因子受体相互作用、趋化因子信号通路、IL-17信号通路等炎症相关信号通路。成功构建出由67个节点、146条边组成的PPI网络图。树突状细胞、M2巨噬细胞和肥大细胞在表皮免疫微环境中占比最高,免疫浸润最明显。与AD免疫浸润相关性比较高的miR-155靶基因为CXCL1、CXCL8。TI组细胞中miR-155相对表达量高于control组(P<0.05),TI+miR-155 mimics组细胞中CXCL1、CXCL8 mRNA相对表达量高于TI+mimics NC组(P均<0.05)。结论筛选获得的与AD免疫浸润相关的miR-155靶基因是CXCL1、CXCL8基因。高表达miR-155可提高炎症时HaCaT细胞中CXCL1、CXCL8基因的表达水平。 展开更多
关键词 特应性皮炎 MIR-155 免疫浸润 CXCL1基因 CXCL8基因 生物信息学分析 细胞实验
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