基于工程化毕赤酵母一锅法合成硫酸软骨素A 被引量：7

1

作者 盛靖雨 金学荣 +2 位作者 胥睿睿 王阳 康振 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第7期2594-2605,共12页

硫酸软骨素(chondroitin sulfate,CS)是一种线性多糖,广泛应用于医疗和保健等领域。相比于传统动物组织提取法,微生物合成硫酸软骨素具有可控、易规模化放大等优势。为实现硫酸软骨素A(CSA)的高效合成,本研究首先通过整合软骨素合酶编... 硫酸软骨素(chondroitin sulfate,CS)是一种线性多糖,广泛应用于医疗和保健等领域。相比于传统动物组织提取法,微生物合成硫酸软骨素具有可控、易规模化放大等优势。为实现硫酸软骨素A(CSA)的高效合成,本研究首先通过整合软骨素合酶编码基因kfoC、kfoA以及UDP-葡萄糖脱氢酶编码基因tuaD至毕赤酵母GS115基因组中,构建了以甘油为唯一碳源发酵生产软骨素的毕赤酵母工程菌株。通过进一步优化软骨素合成途径,软骨素分批补料发酵水平达到2.6 g/L。在进一步整合表达软骨素-4-O-磺基转移酶的基础上,本研究通过向生产软骨素毕赤酵母工程菌株破碎液中添加3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸和软骨素-4-O-磺基转移酶,成功建立了CSA的一锅法生物合成体系。通过优化,最终实现0-40%不同磺酸化水平CSA的可控合成。本研究中CSA的一锅法生物合成体系操作简便、易放大,更适用于工业化大规模生产。本研究结果也为肝素等其他糖胺聚糖的合成提供了思路。 展开更多

关键词 软骨素 硫酸软骨素A 一锅法 3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸 毕赤酵母 生物合成体系

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产麦角硫因大肠杆菌工程菌株的构建与优化 被引量：6

2

作者 王丽 王阳 +2 位作者 李江华 堵国成 康振 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第2期796-806,共11页

麦角硫因(ergothioneine,ERG)是一种天然的抗氧化剂,广泛应用于化妆品、食品以及医药领域。相比于传统植物提取和化学合成方法,微生物发酵合成麦角硫因具有周期短、成本低等优点,因而受到广泛关注。为构建高产麦角硫因的大肠杆菌工程菌... 麦角硫因(ergothioneine,ERG)是一种天然的抗氧化剂,广泛应用于化妆品、食品以及医药领域。相比于传统植物提取和化学合成方法,微生物发酵合成麦角硫因具有周期短、成本低等优点,因而受到广泛关注。为构建高产麦角硫因的大肠杆菌工程菌株,本研究以大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)为出发菌株,通过引入耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)来源的麦角硫因合成基因簇egtABCDE以及粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)来源的Egt1,构建了从头发酵合成麦角硫因的工程菌株E1-A1,麦角硫因发酵浓度为(95.58±3.20)mg/L。为进一步提高麦角硫因的产量,对前体氨基酸组氨酸、甲硫氨酸以及半胱氨酸合成路径中关键酶的表达进行了强化,结果表明,单一表达基因serA^(T410STOP)、thrA以及两者共表达时,麦角硫因发酵浓度分别提高至(134.83±4.22)mg/L、(130.26±3.34)mg/L以及(144.97±5.40)mg/L。最后,采用分批补料发酵策略,菌株E1-A1-thrA-serA^(*)在无机盐培养基和丰富培养基培养中的产量分别为548.75 mg/L和710.53 mg/L。 展开更多

关键词 麦角硫因 代谢工程 大肠杆菌 氨基酸 分批补料发酵

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细菌酪氨酸酶高效异源表达及其在生物染发和丝素多肽多巴修饰中的应用 被引量：1

3

作者 郑依琳 胥睿睿 +3 位作者 王阳 方承格 堵国成 康振 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第9期3083-3102,共20页

酪氨酸酶是一种含铜的多酚氧化酶,广泛应用于食品、日化、医药等领域。目前商品化酪氨酸酶主要依赖于真菌提取,存在价格高、纯度低、比酶活低和稳定性差等问题。本研究旨在获得高效表达并具有工业化应用前景的细菌酪氨酸酶。通过在大肠... 酪氨酸酶是一种含铜的多酚氧化酶,广泛应用于食品、日化、医药等领域。目前商品化酪氨酸酶主要依赖于真菌提取,存在价格高、纯度低、比酶活低和稳定性差等问题。本研究旨在获得高效表达并具有工业化应用前景的细菌酪氨酸酶。通过在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中异源表达5种不同来源的细菌酪氨酸酶,筛选获得了巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)和多刺疣微菌(Verrucomicrobium spinosum)来源的酪氨酸酶TyrBm和TyrVs,酶活分别为(16.1±0.2)U/mL和(48.6±0.9)U/mL。纯化后通过比较TyrBm与TyrVs的酶学性质,证明了TyrVs具有更高的热稳定性和底物专一性。在表征TyrVs高催化性能的基础上,建立了基于TyrVs催化的酶法生物染发体系,实现了原位催化染发,水洗色牢度实验测得模拟14 d清洁后的色差值∆E低于7.38±0.64。为便于催化产物与酶快速分离,成功构建了依赖于自组装标签CipA的固定化酶TyrVs-CipA催化体系并应用于水解丝素多肽(hydrolysed silk fibroin,HSF)的多巴修饰(DOPA modification),酶连续催化达7次以上,单次多巴修饰度超过70.00%。进一步研究表明,多巴修饰使HSF对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine,DPPH)自由基与O2-自由基清除活性分别提高了507.80%与78.23%。本研究为基于酪氨酸酶的绿色生物染发剂及组织工程生物材料开发提供了技术基础。 展开更多

关键词 细菌酪氨酸酶 固定化酶 生物染发剂 水解丝素 多巴修饰

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肠激酶在毕赤酵母中的分泌表达优化 被引量：5

4

作者 梁启星 石竟成 +2 位作者 金学荣 堵国成 康振 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第8期1689-1698,共10页

肠激酶(Enterokinase,EK)是一类特异性识别切割DDDDK序列的丝氨酸蛋白酶,作为一种工具酶广泛应用于生物医药领域。目前,EK在毕赤酵母Pichiapastoris中的表达水平较低,难以应用。本研究比较了6种不同的信号肽SP1、SP2、SP3、SP4、SP7和SP... 肠激酶(Enterokinase,EK)是一类特异性识别切割DDDDK序列的丝氨酸蛋白酶,作为一种工具酶广泛应用于生物医药领域。目前,EK在毕赤酵母Pichiapastoris中的表达水平较低,难以应用。本研究比较了6种不同的信号肽SP1、SP2、SP3、SP4、SP7和SP8对毕赤酵母分泌表达EK的影响。在摇瓶水平上,与α-factor信号肽相比,SP1信号肽显著提高了EK的分泌表达(从6.8 mg/L提高至14.3 mg/L),酶活从(2390±212)U/mL提高至(4995±378)U/mL。在此基础上,通过共表达毕赤酵母内源蛋白Kex2,EK酶活提高至(7219±489)U/mL。另外,N端融合WLR三个氨基酸进一步提高酶活至(15145±920)U/mL,比酶活为(1174600±53100)U/mg。EK在毕赤酵母中的高效分泌表达为未来应用奠定了基础。 展开更多

关键词 毕赤酵母 肠激酶 信号肽 共表达 N端改造

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哈茨木霉产水解热凝胶的内切β-1,3-葡聚糖酶的分离纯化 被引量：5

5

作者 徐敏 李晶 +4 位作者 郑志永 朱莉 詹晓北 李珊 张洪涛 《食品工业科技》 CAS CSCD 北大核心 2014年第12期157-161,共5页

结合多种分离方法,从哈茨木霉(Trichoderma harzianum Rifai ACCC30371)的发酵产物中分离得到一种对不溶性多糖热凝胶具有较高水解活性的内切β-1,3-葡聚糖酶。结果表明,哈茨木霉发酵液经50%饱和度硫酸铵沉淀预处理后,依次经过HiPrep 26... 结合多种分离方法,从哈茨木霉(Trichoderma harzianum Rifai ACCC30371)的发酵产物中分离得到一种对不溶性多糖热凝胶具有较高水解活性的内切β-1,3-葡聚糖酶。结果表明,哈茨木霉发酵液经50%饱和度硫酸铵沉淀预处理后,依次经过HiPrep 26/10 desalting层析柱脱盐、QFF阴离子交换层析柱去除杂质蛋白,最终经Superdex 75凝胶柱纯化获得纯度较高的内切β-1,3-葡聚糖酶。最终酶活回收率为6.63%,内切酶比酶活由6.86U/mg提高到133.01U/mg,纯化倍数达到19.39倍。MALDI-TOF-TOF鉴定结果表明,该内切酶与产自绿色木霉的endoglucanase存在较高的同源性。 展开更多

关键词 哈茨木霉 β-1 3-葡聚糖内切酶 热凝胶 分离纯化

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通气量对气升式反应器培养高山被孢霉生产花生四烯酸的影响 被引量：4

6

作者 王成 郑志永 +2 位作者 朱莉 高敏杰 詹晓北 《生物加工过程》 CAS 2015年第1期68-74,共7页

高山被孢霉具有很强的积累花生四烯酸（ARA）的能力,通过对30 L气升式反应器发酵过程的通气量进行调控,结果发现：通气量对高山被孢霉菌体生长、形态及ARA合成具有显著影响。中等大小的球形菌丝形态有利于菌体持续生长和油脂积累,ARA占... 高山被孢霉具有很强的积累花生四烯酸（ARA）的能力,通过对30 L气升式反应器发酵过程的通气量进行调控,结果发现：通气量对高山被孢霉菌体生长、形态及ARA合成具有显著影响。中等大小的球形菌丝形态有利于菌体持续生长和油脂积累,ARA占总油脂的含量最高,而羽状菌丝形态菌体中总油脂含量和ARA含量均小于球形菌丝形态菌体中的含量。通气量为1.0 vvm（1 vvm为每分钟通气量与罐体实际料液体积之比）时有利于菌体保持良好形态和生长,通气量为1.4 vvm有利于发酵对数期后（72~168 h）ARA的积累。提出一种两阶段通气量控制策略,在气升式发酵罐中高山被孢霉的菌丝形态得到显著改善,ARA产量达到4.72 g/L,比对照提高了40.1%。 展开更多

关键词 高山被孢霉 花生四烯酸 气升式反应器 通气量

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重组毕赤酵母产果糖基转移酶发酵条件的优化 被引量：2

7

作者 郭文文 陈献忠 +2 位作者 沈微 许菲 杨海泉 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2016年第10期39-43,共5页

果糖基转移酶(EC 2.4.1.9)是利用蔗糖为底物制备低聚果糖的关键酶。利用前期构建的产果糖基转移酶的重组毕赤酵母为出发菌株,对其进行发酵优化。最适发酵产酶条件为:装液量30 m L/250 m L、V(甘油)∶V(甲醇)=1∶20、初始pH为5.5、诱导... 果糖基转移酶(EC 2.4.1.9)是利用蔗糖为底物制备低聚果糖的关键酶。利用前期构建的产果糖基转移酶的重组毕赤酵母为出发菌株,对其进行发酵优化。最适发酵产酶条件为:装液量30 m L/250 m L、V(甘油)∶V(甲醇)=1∶20、初始pH为5.5、诱导温度为30℃、初始甲醇浓度为1.0%、后续甲醇浓度为1.5%、硫酸铵浓度10 g/L、诱导时间为120 h。在优化的发酵产酶条件下,重组果糖基转移酶酶活力达218.3 U/m L,较优化前提高了5倍。 展开更多

关键词 果糖基转移酶 毕赤酵母 发酵条件 优化

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气升式反应器中高山被孢霉发酵生产花生四烯酸过程的动态温度控制研究 被引量：2

8

作者 高敏杰 王成 +2 位作者 郑志永 朱莉 詹晓北 《食品工业科技》 CAS CSCD 北大核心 2014年第22期179-183,共5页

在利用高山被孢霉发酵生产花生四烯酸(Arachidonic Acid,ARA)过程中,考察了不同规模和培养环境下,单一以及动态温度控制对菌体生长和ARA合成的影响。结果表明:相对于机械搅拌罐,利用气升式反应器发酵生产ARA具有明显优势。同时,较高温度... 在利用高山被孢霉发酵生产花生四烯酸(Arachidonic Acid,ARA)过程中,考察了不同规模和培养环境下,单一以及动态温度控制对菌体生长和ARA合成的影响。结果表明:相对于机械搅拌罐,利用气升式反应器发酵生产ARA具有明显优势。同时,较高温度(25℃)有利于高山被孢霉菌体生长,而较低温度(16℃)有利于ARA合成。在此基础上进行动态控温发酵,即起始发酵温度25℃,72h后以每12h下降1.5℃至16℃,然后保持16℃至发酵结束。采用此控制策略,ARA产量达到4.7g/L,与单一温度(25℃)控制相比提高了38.2%。 展开更多

关键词 高山被孢霉 花生四烯酸 机械搅拌罐 气升式反应器 发酵温度

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高渗胁迫对光滑球拟酵母蛋白质组的影响 被引量：1

9

作者 徐沙 刘立明 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2014年第7期6-10,共5页

光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)在生产丙酮酸的过程中,发酵液渗透压不断提高,导致细胞生长缓慢,影响丙酮酸的持续积累。实验通过二维电泳和同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)技术,比较不同渗透压条件下蛋白质组的差异。结果表明,在... 光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)在生产丙酮酸的过程中,发酵液渗透压不断提高,导致细胞生长缓慢,影响丙酮酸的持续积累。实验通过二维电泳和同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)技术,比较不同渗透压条件下蛋白质组的差异。结果表明,在渗透压为1 765、2 603和3 324 mOsmol/kg时,相对于对照条件(860mOsmol/kg),分别有125、91和109个蛋白表达水平上调,94、89和78个蛋白表达水平下调,其中中心代谢和能量代谢途径的蛋白质表达量明显提高。此外,研究还发现,渗透压胁迫可诱导超氧化物歧化酶和富脯蛋白的表达量增加,前者可能和高渗环境下活性氧簇的积累有关,而后者可能与胞内脯氨酸的积累有关。该文为后续研究如何提高T.glabrata抵御高渗胁迫的能力提供理论依据。 展开更多

关键词 蛋白质组 同位素标记相对和绝对定量技术 光滑球拟酵母

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依赖IL-5增殖的细胞株TF-1-9E3的驯化及验证

10

作者 李诗洁 代维燕 +5 位作者 王雪莲 柯文锋 韩飞 陈永奇 刘畅 白仲虎 《生物学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2023年第6期109-114,共6页

在IL-5靶点药物的发现阶段,为评价候选药物的阻断活性,需建立依赖IL-5增殖且信噪比高、重现性好的检测用细胞株。TF-1是人白血病细胞,其生长完全依赖IL-3或GM-CSF,而IL-5与IL-3和GM-CSF共用β(βc)受体,因此,研究以GM-CSF依赖的TF-1细... 在IL-5靶点药物的发现阶段,为评价候选药物的阻断活性,需建立依赖IL-5增殖且信噪比高、重现性好的检测用细胞株。TF-1是人白血病细胞,其生长完全依赖IL-3或GM-CSF,而IL-5与IL-3和GM-CSF共用β(βc)受体,因此,研究以GM-CSF依赖的TF-1细胞株为来源,用IL-5替换TF-1细胞生长必需的生长因子GM-CSF,降低血清含量进行细胞驯化培养传代。通过35 d的细胞驯化及3~5次降血清传代培养,采用有限稀释法分离单克隆,一共得到14个单克隆细胞株。对14株细胞进行FACS检测,其中,有9个细胞株IL-5Rα表达量升高。对IL-5Rα过表达的细胞株进行IL-5增殖检测,结果表明,相比8%FBS得到的单克隆,6%FBS得到的单克隆对IL-5刺激更敏感。通过单因素优化实验,细胞增殖检测最优的细胞接种量为2×10^(4)个/孔,FBS含量为3%,血清品牌为Gibco。驯化后的细胞TF-1-9E3对IL-5的剂量-效应曲线的信噪比为3.19,Emax区间为2.15,可用于IL-5的生物学活性检测及IL-5与IL-5Rα的抗体阻断活性检测。 展开更多

关键词 IL-5 TF-1细胞 增殖 阻断活性 细胞驯化

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肝素C5异构酶的表达优化及分子改造 被引量：1

11

作者 王兵兵 周正雄 +3 位作者 金学荣 李江华 史仲平 康振 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第7期1450-1458,共9页

肝素和硫酸乙酰肝素是一类应用于临床抗凝血的糖胺聚糖。肝素葡萄糖醛酸C5异构酶(Heparosan-N-sulfate-glucuronate 5-epimerase,C5,EC 5.1.3.17)是肝素和硫酸乙酰肝素合成过程中重要的修饰酶,催化N-硫酸化肝素前体(N-sulfoheparosan)... 肝素和硫酸乙酰肝素是一类应用于临床抗凝血的糖胺聚糖。肝素葡萄糖醛酸C5异构酶(Heparosan-N-sulfate-glucuronate 5-epimerase,C5,EC 5.1.3.17)是肝素和硫酸乙酰肝素合成过程中重要的修饰酶,催化N-硫酸化肝素前体(N-sulfoheparosan)的D-葡萄糖醛酸(D-GlcA)上5号位羧基翻转生成L-艾杜糖醛酸(L-iduronic acid,L-IdoA)。文中以大肠杆菌Escherichia coli为宿主对斑马鱼来源的肝素葡萄糖醛酸C5异构酶基因Glce进行重组表达优化与分子改造。比较了3种不同的表达载体pET20b(+)、pET28a(+)和pColdⅢ对C5表达的差异情况,其中以嗜冷启动型载体pColdⅢ表达酶活最高,达到(1873.61±5.42)U/L。为了进一步提高C5的可溶表达量,在N端融合促溶标签SET2后,可溶蛋白表达量比对照提高了50%,酶活达到(2409.25±6.43)U/L。在此基础上,通过理性设计对底物结合口袋进行定点突变,获得最优突变体(V153R)的酶活和比酶活分别为(5804.32±5.63)U/L和(145.14±2.33)U/mg,是原始酶的2.41倍和2.28倍。肝素C5异构酶改造与表达优化为酶法催化合成肝素奠定了基础。 展开更多

关键词 肝素 葡萄糖醛酸-C5-异构化酶 异源表达 理性设计 底物结合口袋

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构建葡萄糖二酸指示系统筛选肌醇加氧酶突变株 被引量：1

12

作者 王毳 刘叶 +2 位作者 巩旭 刘龙 康振 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第11期1772-1783,共12页

葡萄糖二酸是一种高附加值天然有机酸,已经广泛应用于疾病防治、生产聚合物材料等领域。在葡萄糖二酸的合成途径中,肌醇加氧酶MIOX所催化的肌醇转换为葡萄糖醛酸的过程是整个途径的限速步骤。通过应用将葡萄糖二酸浓度与绿色荧光蛋白荧... 葡萄糖二酸是一种高附加值天然有机酸,已经广泛应用于疾病防治、生产聚合物材料等领域。在葡萄糖二酸的合成途径中,肌醇加氧酶MIOX所催化的肌醇转换为葡萄糖醛酸的过程是整个途径的限速步骤。通过应用将葡萄糖二酸浓度与绿色荧光蛋白荧光强度相结合的筛选系统,从突变体文库中筛选出3株有潜力的肌醇加氧酶突变体(K59V/R60A、R171S和D276A),使MIOX活性得到提高。重组菌株Escherichia coli BL21(DE3)/MU-R171S的葡萄糖二酸产量相比于未突变菌株提高了36.5%。 展开更多

关键词 葡萄糖二酸 肌醇加氧酶 生物传感器 高通量筛选

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毕赤酵母GT1的原核表达与体外功能鉴定

13

作者 潘颖越 董贵彬 +5 位作者 王荣斌 刘国强 刘春立 刘秀霞 白仲虎 杨艳坤 《生物学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2021年第3期47-51,共5页

为了开展体外互作实验,以pXMJ19质粒为载体构建pXMJ19-gt1-His重组质粒,通过单因素优化实验获得毕赤酵母甘油转运体GT 1的最优表达宿主为C41(DE3);最优表达条件为OD 600达到0.7时加入终浓度为0.1 mmol/L的异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷... 为了开展体外互作实验,以pXMJ19质粒为载体构建pXMJ19-gt1-His重组质粒,通过单因素优化实验获得毕赤酵母甘油转运体GT 1的最优表达宿主为C41(DE3);最优表达条件为OD 600达到0.7时加入终浓度为0.1 mmol/L的异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG),于30℃、110 r/min诱导10 h。通过超速离心验证了部分GT1蛋白在大肠杆菌中位于细胞质膜上,并筛选得到针对GT1重溶解率最高的去垢剂NP-40。在去垢剂环境下通过镍离子亲和层析纯化得到GT1蛋白,然后利用等温滴定量热法体外检测其与甘油的结合能力,结果表明:GT1与甘油在体外相互作用产生放热反应,且测得其与甘油的平衡解离常数K D值为6.58μmol/L。实验说明原核表达的GT1蛋白具有活性,且与甘油的体外相互作用明显,为GT1以甘油为配体进行结晶以及解析其三维结构提供了研究基础。 展开更多

关键词 巴斯德毕赤酵母 甘油转运体 膜蛋白表达 MFS蛋白超家族 蛋白-分子相互作用

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甘油替代葡萄糖作为碳源生产丙酮酸

14

作者 徐沙 吕永坤 周景文 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2014年第8期7-11,共5页

光滑球拟酵母是重要的丙酮酸工业生产菌株,主要利用葡萄糖作为碳源生产丙酮酸。该研究以产量大且价格便宜的甘油部分替代葡萄糖并控制碳源组成为80 g/L葡萄糖和20 g/L甘油,摇瓶条件下发酵52 h,丙酮酸产量达到27.6 g/L,在7 L发酵罐上最... 光滑球拟酵母是重要的丙酮酸工业生产菌株,主要利用葡萄糖作为碳源生产丙酮酸。该研究以产量大且价格便宜的甘油部分替代葡萄糖并控制碳源组成为80 g/L葡萄糖和20 g/L甘油,摇瓶条件下发酵52 h,丙酮酸产量达到27.6 g/L,在7 L发酵罐上最终丙酮酸产量为61.7 g/L,与碳源为100 g/L葡萄糖的对照条件相比,几乎没有任何变化。由于碳源是培养基的主要成分,用甘油替代葡萄糖可以降低丙酮酸生产的原料成本,减轻由于大量生物柴油合成造成的甘油产能过剩问题。 展开更多

关键词 光滑球拟酵母 甘油 葡萄糖 丙酮酸

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氨基甲酸乙酯水解酶的分离纯化及酶学性质 被引量：14

15

作者 李京京 方芳 +3 位作者 张继冉 刘龙 堵国成 陈坚 《食品与生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第12期1239-1245,共7页

氨基甲酸乙酯是发酵食品生产过程中的副产物,具有致癌性和遗传毒性,影响食品安全.酶法降解氨基甲酸乙酯是一种高效安全的去毒方法.从小鼠肠道筛选得到一株具有降解氨基甲酸乙酯活性的赖氨酸芽孢杆菌.通过对其细胞破碎上清液进行硫酸铵... 氨基甲酸乙酯是发酵食品生产过程中的副产物,具有致癌性和遗传毒性,影响食品安全.酶法降解氨基甲酸乙酯是一种高效安全的去毒方法.从小鼠肠道筛选得到一株具有降解氨基甲酸乙酯活性的赖氨酸芽孢杆菌.通过对其细胞破碎上清液进行硫酸铵沉淀、离子交换层析、疏水层析和凝胶层析分离纯化,得到了氨基甲酸乙酯水解酶纯酶.SDS-PAGE电泳图显示,该酶亚基分子量约为50 kDa.该酶最适反应温度为35℃,最适pH值为7.0,在10～45℃时,具有良好的热稳定性.以氨基甲酸乙酯为底物反应,其Km和Kcat分别为37.2 mmol/L和1 176.4 s-1.金属离子显著抑制酶活力,而EDTA对酶活力无影响,表明此酶为非金属酶.此外,该酶对低浓度的NaC1和乙醇有一定的耐受性,具有在酱油和黄酒中去除氨基甲酸乙酯的应用潜力. 展开更多

关键词 赖氨酸芽孢杆菌 氨基甲酸乙酯 氨基甲酸乙酯水解酶 分离纯化 酶学性质

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定点突变改造提高纺锤形赖氨酸芽孢杆菌氨基甲酸乙酯水解酶稳定性 被引量：9

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作者 刘晓慧 方芳 +2 位作者 夏小乐 堵国成 陈坚 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第9期1233-1242,共10页

氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate,EC)是一种存在于发酵食品和酿造酒精饮料中的潜在致癌物质。利用生物酶法去除食品饮料中的EC是一种较为安全有效的方法。本研究以来源于赖氨酸芽孢杆菌Lysinibacillus fusiformis SC02的氨基甲酸乙酯水解... 氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate,EC)是一种存在于发酵食品和酿造酒精饮料中的潜在致癌物质。利用生物酶法去除食品饮料中的EC是一种较为安全有效的方法。本研究以来源于赖氨酸芽孢杆菌Lysinibacillus fusiformis SC02的氨基甲酸乙酯水解酶为研究对象,采用计算机辅助设计突变位点,构建了其不稳定区域Q328位点的饱和突变体。通过酶学性质分析发现,突变体Q328C和Q328V在40℃下的半衰期分别提高了7.46和1.99倍,Q328R在高温下也有比原酶更好的耐受性。此外,突变体Q328C对乙醇的耐受性和酸耐受性也有所提高。对氨基甲酸乙酯水解酶分子改造的结果表明,通过改造其不稳定区域Q328位点,可以提高酶的热稳定性及对酸和乙醇的耐受性。 展开更多

关键词 定点突变 氨基甲酸乙酯水解酶 氨基甲酸乙酯 酶稳定性

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氨基甲酸乙酯水解酶在枯草芽孢杆菌中的表达及发酵优化 被引量：6

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作者 吕思熠 方芳 +1 位作者 堵国成 陈坚 《过程工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第5期846-852,共7页

将来源于赖氨酸芽孢杆菌SC02的氨基甲酸乙酯水解酶(UH)基因在枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WB600中进行克隆和表达,在枯草芽孢杆菌中实现了UH活性表达,在摇瓶水平通过单因素考察和响应面分析实验对氨基甲酸乙酯水解酶发酵进行优化.结... 将来源于赖氨酸芽孢杆菌SC02的氨基甲酸乙酯水解酶(UH)基因在枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WB600中进行克隆和表达,在枯草芽孢杆菌中实现了UH活性表达,在摇瓶水平通过单因素考察和响应面分析实验对氨基甲酸乙酯水解酶发酵进行优化.结表明,酶活最高可达到14.20 U/mL,产酶最佳培养基成分为:淀粉10 g/L、磷酸氢二钾9 g/L、麦芽浸膏25 g/L、硫酸镁1 g/L、胰蛋白胨55 g/L,最适发酵温度为37℃,最佳接种量4%.在3 L发酵罐中采用最优发酵条件,酶活在16 h达到18.03 U/mL. 展开更多

关键词 氨基甲酸乙酯水解酶 枯草芽孢杆菌 培养基 发酵 响应面

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高效液相色谱法同时测定微生物酶法产L-丙氨酰-L-谷氨酰胺反应体系中5种物质及其样品处理方法对色谱峰的影响分析 被引量：3

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作者 魏照辉 张震宇 孙付保 《分析测试学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第10期1317-1322,共6页

建立了同时测定微生物酶法产L-丙氨酰-L-谷氨酰胺反应体系中5种物质(L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-谷氨酰胺、L-丙氨酸甲酯、L-谷氨酸、L-丙氨酰-L-丙氨酸)的高效液相色谱分析方法。考察了样品处理中存在的发酵液、磷酸、三氯乙酸对色谱峰的... 建立了同时测定微生物酶法产L-丙氨酰-L-谷氨酰胺反应体系中5种物质(L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-谷氨酰胺、L-丙氨酸甲酯、L-谷氨酸、L-丙氨酰-L-丙氨酸)的高效液相色谱分析方法。考察了样品处理中存在的发酵液、磷酸、三氯乙酸对色谱峰的影响,建立了一种对色谱峰无干扰的样品处理方法。选用邻苯二甲醛(OPA)为衍生剂,以在线衍生的方式实现了标准品或样品的柱前自动衍生。选用C18色谱柱进行分离,柱温40℃,以12.5 mmol/L磷酸盐缓冲液(88%,pH 7.4)与12%乙腈为流动相进行等度洗脱,流速为1 m L/min,在λex=338 nm,λ_(em)=450 nm下进行荧光检测,外标法定量。结果显示,该色谱条件下5种物质的测定线性范围广,相关系数均大于0.999 4。低、中、高3组加标水平下的回收率为93.5%~104.9%,相对标准偏差(RSD)小于7%。1日内间隔2 h进行6次进样,5种物质保留时间的RSD均小于0.12%,峰面积RSD均小于1.2%。该方法操作简单,分离度与灵敏度高,定量精确,重复性好。 展开更多

关键词 高效液相色谱法 柱前自动化衍生 L-丙氨酰-L-谷氨酰胺反应体系 样品处理方法

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魏斯氏菌在发酵食品中的应用 被引量：49

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作者 李巧玉 方芳 +1 位作者 堵国成 陈坚 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2017年第10期241-247,共7页

魏斯氏菌是一类存在于酱油、泡菜、豆豉、香肠等多种发酵食品的乳酸菌。它是参与食品发酵的重要微生物,在发酵食品中具有广泛应用价值。在食品发酵过程中,魏斯氏菌对食品中有机酸、酯类及短链脂肪酸等风味物质的合成具有重要作用。此外... 魏斯氏菌是一类存在于酱油、泡菜、豆豉、香肠等多种发酵食品的乳酸菌。它是参与食品发酵的重要微生物,在发酵食品中具有广泛应用价值。在食品发酵过程中,魏斯氏菌对食品中有机酸、酯类及短链脂肪酸等风味物质的合成具有重要作用。此外,魏斯氏菌属的有些菌株具有合成细菌素、低聚糖、胞外多糖和纤维素等特性,具有潜在的益生菌特性。该文主要对魏斯氏菌的分离鉴定、生理生化特性以及菌株在发酵食品中的应用特性等几方面的研究进展进行了综述。 展开更多

关键词 魏斯氏菌 发酵食品 乳酸菌 分类 特性

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非离子表面活性剂对木质纤维素酶解的促进作用 被引量：11

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作者 孙付保 娄秀平 +4 位作者 洪嘉鹏 顾琴琴 陈晓旭 蔡宇杰 廖祥儒 《化工进展》 EI CAS CSCD 北大核心 2011年第12期2719-2723,共5页

纤维素酶单位酶活力较低、酶用量较高及酶自身易失活等因素依然是木质纤维素工业生产能源和生物基产品的瓶颈性问题。本文尝试在木质纤维素基质水解时添加一些非离子型表面活性剂以减少纤维素酶用量,并对这些非离子型表面活性剂促进酶... 纤维素酶单位酶活力较低、酶用量较高及酶自身易失活等因素依然是木质纤维素工业生产能源和生物基产品的瓶颈性问题。本文尝试在木质纤维素基质水解时添加一些非离子型表面活性剂以减少纤维素酶用量,并对这些非离子型表面活性剂促进酶解效率提高的原因进行了初步探讨。研究发现,添加非离子性表面活性剂能提高木质纤维素的酶解,添加浓度为0.05 g/g底物,常压甘油自催化预处理麦草经过添加两种非离子表面活性剂Tween-80和PEG 6000后葡萄糖产量分别可提高20%左右;非离子表面活性剂对不含木质素的原料酶解产糖也有较大的提高,以滤纸为底物时葡萄糖产量提高近90%,以微晶纤维素为底物时分别提高70%以上;添加非离子表面活性剂使得酶解体系中扩散系数k升高,异相反应效率提高,酶促反应动力学Km值明显减小,显著提高底物对纤维素酶的亲和力。 展开更多

关键词 非离子表面活性剂 木质纤维素 纤维素酶 酶解

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