目的:构建人类8型疱疹病毒(HHV-8)小衣壳蛋白(ORF65)基因重组原核表达质粒并诱导表达,获得其重组融合蛋白。方法:软件设计引物,在引物两端添加特异性酶切位点,以pGEM-Teasy/ORF65为模板,PCR扩增基因序列,克隆入原核表达载体pET-41a中,...目的:构建人类8型疱疹病毒(HHV-8)小衣壳蛋白(ORF65)基因重组原核表达质粒并诱导表达,获得其重组融合蛋白。方法:软件设计引物,在引物两端添加特异性酶切位点,以pGEM-Teasy/ORF65为模板,PCR扩增基因序列,克隆入原核表达载体pET-41a中,构建原核表达质粒pET41a-ORF65,转化大肠杆菌(E.coli)DH5x,经酶切、测序鉴定其插入序列的正确性,转入E.coli BL21(DE3),并诱导表达,采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)方法以及序列分析软件DNAMAN 5.0、Vector NTI Suite 6、Primer Primier 5对表达蛋白进行生物信息学分析。结果:测序结果表明所构建pET41a-ORF65原核表达质粒连接正确,SDS-PAGE表明ORF65基因获得成功表达,生物信息学分析显示该蛋白含有1个N糖基化位点,2个蛋白激酶C磷酸化位点,4个胆碱激酶Ⅱ磷酸化位点,4个N肉豆蔻酰化位点,1个酰胺化位点。BlastP数据库的相似性检索发现有与之有较高同源性的蛋白。结论:成功表达HHV-8病毒小衣壳蛋白ORF65,该蛋白与疱疹病毒衣壳蛋白的同源性较高,是疱疹病毒衣壳蛋白家族中的一员。展开更多
文摘目的:构建人类8型疱疹病毒(HHV-8)小衣壳蛋白(ORF65)基因重组原核表达质粒并诱导表达,获得其重组融合蛋白。方法:软件设计引物,在引物两端添加特异性酶切位点,以pGEM-Teasy/ORF65为模板,PCR扩增基因序列,克隆入原核表达载体pET-41a中,构建原核表达质粒pET41a-ORF65,转化大肠杆菌(E.coli)DH5x,经酶切、测序鉴定其插入序列的正确性,转入E.coli BL21(DE3),并诱导表达,采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)方法以及序列分析软件DNAMAN 5.0、Vector NTI Suite 6、Primer Primier 5对表达蛋白进行生物信息学分析。结果:测序结果表明所构建pET41a-ORF65原核表达质粒连接正确,SDS-PAGE表明ORF65基因获得成功表达,生物信息学分析显示该蛋白含有1个N糖基化位点,2个蛋白激酶C磷酸化位点,4个胆碱激酶Ⅱ磷酸化位点,4个N肉豆蔻酰化位点,1个酰胺化位点。BlastP数据库的相似性检索发现有与之有较高同源性的蛋白。结论:成功表达HHV-8病毒小衣壳蛋白ORF65,该蛋白与疱疹病毒衣壳蛋白的同源性较高,是疱疹病毒衣壳蛋白家族中的一员。
