目的探究Rv1985c、rv3807c、rv1981c基因编码蛋白的生物学特征,建立间接ELISA方法并对其诊断效能进行分析和评价。方法从NCBI数据库中获取rv1985c、rv3807c、rv1981c的全基因序列;应用生物信息学分析软件SOPMA预测蛋白的二级结构;采用SW...目的探究Rv1985c、rv3807c、rv1981c基因编码蛋白的生物学特征,建立间接ELISA方法并对其诊断效能进行分析和评价。方法从NCBI数据库中获取rv1985c、rv3807c、rv1981c的全基因序列;应用生物信息学分析软件SOPMA预测蛋白的二级结构;采用SWISS-MODEL建立rv1985c、rv3807c和rv1981c 3个蛋白的3D模型;采用TMHMM Server v.2.0分别预测并分析蛋白的跨膜结构;采用IEDB在线软件预测分析蛋白质线性B细胞抗原表位。以H37RV标准株基因组为模版,PCR扩增目的基因序列并克隆至表达载体中,经IPTG诱导表达后采用Ni柱纯化得到高纯度的目的蛋白,方阵滴定法确定其在间接ELISA中的最佳反应条件。结果rv1985c、Rv1981c为亲水性蛋白且无跨膜结构域,rv3807c为疏水性蛋白且存在3次跨膜结构,3个蛋白均无信号肽,Rv1985c、Rv1985c的不稳定系数高于rv3807c,通过B细胞表位分析各筛选出3个优势表位区。成功构建3个重组表达载体,亲和层析纯化后Western blot验证3个蛋白均能与结核病患者血清反应,具有良好的反应原性,3个蛋白间接ELISA检测血清中IgM敏感性分别为37.20%、54.70%、40.60%,特异性分别为63.70%、71.30%、67.50%,检测IgG时敏感性为:47.60%、61.60%、46.50%,特异性分别为49.70%、74.80%、74.30%。结论生物信息学分析rv1985c、rv3807c、rv1981c均含优势B细胞表位,原核表达的3个蛋白均具有作为ELISA诊断抗原的潜力,为结核病快速诊断候选抗原筛选提供了理论基础。展开更多
文摘目的探究Rv1985c、rv3807c、rv1981c基因编码蛋白的生物学特征,建立间接ELISA方法并对其诊断效能进行分析和评价。方法从NCBI数据库中获取rv1985c、rv3807c、rv1981c的全基因序列;应用生物信息学分析软件SOPMA预测蛋白的二级结构;采用SWISS-MODEL建立rv1985c、rv3807c和rv1981c 3个蛋白的3D模型;采用TMHMM Server v.2.0分别预测并分析蛋白的跨膜结构;采用IEDB在线软件预测分析蛋白质线性B细胞抗原表位。以H37RV标准株基因组为模版,PCR扩增目的基因序列并克隆至表达载体中,经IPTG诱导表达后采用Ni柱纯化得到高纯度的目的蛋白,方阵滴定法确定其在间接ELISA中的最佳反应条件。结果rv1985c、Rv1981c为亲水性蛋白且无跨膜结构域,rv3807c为疏水性蛋白且存在3次跨膜结构,3个蛋白均无信号肽,Rv1985c、Rv1985c的不稳定系数高于rv3807c,通过B细胞表位分析各筛选出3个优势表位区。成功构建3个重组表达载体,亲和层析纯化后Western blot验证3个蛋白均能与结核病患者血清反应,具有良好的反应原性,3个蛋白间接ELISA检测血清中IgM敏感性分别为37.20%、54.70%、40.60%,特异性分别为63.70%、71.30%、67.50%,检测IgG时敏感性为:47.60%、61.60%、46.50%,特异性分别为49.70%、74.80%、74.30%。结论生物信息学分析rv1985c、rv3807c、rv1981c均含优势B细胞表位,原核表达的3个蛋白均具有作为ELISA诊断抗原的潜力,为结核病快速诊断候选抗原筛选提供了理论基础。
