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应用流式细胞术检测BVDV-E_2截短基因重组卡介苗对小鼠的免疫效果 被引量：1
1
作者 杨宇航 宋纪伟 +7 位作者 时坤 曾范利 李健明 刘红娜 王文玉 郝俊伟 刘东旭 杜锐 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第4期551-559,共9页
为评价牛病毒性腹泻-黏膜病病毒(BVDV)E2截短基因重组卡介苗对小鼠的免疫效果,用BVDV-E2截短基因重组卡介苗pMV361-E11、pMV361-E12、pMV361-E13、pMV361-E21、pMV361-E22、pMV361-E23及卡介苗、BVDV灭活苗和生理盐水对试验小鼠进行腹... 为评价牛病毒性腹泻-黏膜病病毒(BVDV)E2截短基因重组卡介苗对小鼠的免疫效果,用BVDV-E2截短基因重组卡介苗pMV361-E11、pMV361-E12、pMV361-E13、pMV361-E21、pMV361-E22、pMV361-E23及卡介苗、BVDV灭活苗和生理盐水对试验小鼠进行腹腔免疫,在三免后14d取其脾脏对T、B淋巴细胞、树突状细胞及Th1细胞等细胞因子进行流式细胞术检测,评价各重组卡介苗的免疫效果。结果显示,pMV361-E23重组卡介苗组中各细胞因子的表达量尽管有个别因子在同组中不是最高,但均高于同组生理盐水的表达量(除INF-γ检测中略低外);pMV361-E12组中IL-12的含量高达9.7。表明pMV361-E23和pMV361-E122组截短重组卡介苗免疫效果较好,为预防牛病毒性腹泻病以及新型疫苗的研制奠定基础。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻-黏膜病病毒 E2截短基因 重组卡介苗 流式细胞术 免疫效果
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鹿布鲁菌分型实时荧光定量PCR检测方法的建立
2
作者 郝俊伟 时坤 +7 位作者 曾范利 李健明 王文玉 杨宇航 刘红娜 张云 张秀丽 杜锐 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第11期1783-1789,共7页
鹿布鲁菌病主要是由牛型、羊型和猪型布鲁菌引起的,其他感染型少见,本研究依据布鲁菌的特异性基因BruAB20168、BMEII0466、BR0952上的部分高度保守片段设计猪型、牛型、羊型引物和探针,用于检测并区分鹿源布鲁菌的种型,且优化了反应体系... 鹿布鲁菌病主要是由牛型、羊型和猪型布鲁菌引起的,其他感染型少见,本研究依据布鲁菌的特异性基因BruAB20168、BMEII0466、BR0952上的部分高度保守片段设计猪型、牛型、羊型引物和探针,用于检测并区分鹿源布鲁菌的种型,且优化了反应体系,筛选出引物、探针的最优浓度配比。将扩增产物连接到pUC57载体上,制备标准品及标准曲线,建立鹿布氏菌各分型荧光定量PCR检测方法,并对其特异性、稳定性、敏感性进行评价。由标准曲线敏感性可知该方法的最低检测浓度分别可达到12、9、8copies/μL,比常规PCR灵敏度高出很多。 展开更多
关键词 鹿 布鲁菌 分型 实时荧光定量PCR
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牛病毒性腹泻病毒E2基因优化表达重组卡介苗的免疫试验 被引量：2
3
作者 曾范利 张云 +5 位作者 张梦 时坤 李建明 郝俊伟 孙凡婷 杜锐 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2014年第2期176-181,共6页
为评价牛病毒性腹泻病毒(BVDV)E2基因优化表达重组卡介苗(rBCG)对小鼠的免疫效果,分别用已构建的pMV361-E2-1、pMV361-E2-2、pMV361-E2-3、pMV361-E2-4、pMV361-E2-5、pMV361-E2-6重组卡介苗,pMV361空载体,卡介苗,BVDV灭活疫苗和生理盐... 为评价牛病毒性腹泻病毒(BVDV)E2基因优化表达重组卡介苗(rBCG)对小鼠的免疫效果,分别用已构建的pMV361-E2-1、pMV361-E2-2、pMV361-E2-3、pMV361-E2-4、pMV361-E2-5、pMV361-E2-6重组卡介苗,pMV361空载体,卡介苗,BVDV灭活疫苗和生理盐水对小鼠进行免疫接种,检测各免疫组血清中特异性抗体效价、T淋巴细胞增殖程度和CD4+、CD8+和IL-12的水平,以评价其免疫效果。结果显示,6组重组卡介苗均能够引起小鼠产生BVDV特异性抗体,促进致敏T淋巴细胞增殖,免疫小鼠血清CD4+、CD8+和IL-12的水平均高于对照组,pMV361-E2-1重组卡介苗在诱导小鼠产生BVDV抗体方面要优于其他各组基因重组卡介苗。结果表明,BVDV E2基因不同片段的重组卡介苗均可诱导免疫小鼠产生特异性的体液免疫和细胞免疫,这为BVDV基因工程疫苗的研制奠定了基础。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒 E2基因 重组卡介苗 免疫
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牛病毒性腹泻-黏膜病病毒E2基因重组卡介苗初步免疫研究 被引量：2
4
作者 李健明 杨宇航 +5 位作者 王慧慧 曾范利 时坤 张妍 刘菲 杜锐 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第2期146-149,共4页
为评价表达牛病毒性腹泻-黏膜病病毒(BVDV)E2基因重组卡介苗(rBCG)的初步免疫效果,本研究分别将rBCG-pMV261-E2和rBCG-pMV361-E2免疫实验用大耳白兔,通过间接ELISA方法和T淋巴细胞转化试验分别检测兔体内体液免疫和细胞免疫应答水平。... 为评价表达牛病毒性腹泻-黏膜病病毒(BVDV)E2基因重组卡介苗(rBCG)的初步免疫效果,本研究分别将rBCG-pMV261-E2和rBCG-pMV361-E2免疫实验用大耳白兔,通过间接ELISA方法和T淋巴细胞转化试验分别检测兔体内体液免疫和细胞免疫应答水平。结果显示在体液免疫方面,两组rBCG均从第7 d开始产生BVDV抗体,抗体水平逐渐上升,在42 d达到峰值,并且rBCG-pMV361-E2刺激所产生的抗体水平始终高于rBCG-pMV261-E2;而rBCG血清中的抗结核菌抗体水平与正常BCG无显著差异,与BVDV阳性对照组和阴性对照组之间则差异显著;在细胞免疫方面,与阴性对照组相比,两组rBCG与BVDV灭活苗相同,免疫实验兔后淋巴细胞对特异性刺激均有明显的增殖。表明两组rBCG免疫实验兔后均使其产生了体液免疫应答和细胞免疫应答,为进一步研制BVDV新型基因工程疫苗奠定基础。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻-黏膜病病毒 E2基因 重组卡介苗
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牛病毒性腹泻病毒E_0-E_2融合基因重组卡介苗的构建 被引量：1
5
作者 孙凡婷 张云 +4 位作者 张妍 李晶 刘菲 刘杨 杜锐 《畜牧与兽医》 北大核心 2015年第10期89-92,共4页
为了增强重组卡介苗对牛病毒性腹泻黏膜病的免疫效果,本研究将敲除疏水氨基酸及密码子优化的E0基因与去除了C末端的疏水序列E2截短基因采用重叠延伸PCR的方法进行融合后,将其分别与p MV261/p MV361载体连接,电转化至卡介苗中,构建重组... 为了增强重组卡介苗对牛病毒性腹泻黏膜病的免疫效果,本研究将敲除疏水氨基酸及密码子优化的E0基因与去除了C末端的疏水序列E2截短基因采用重叠延伸PCR的方法进行融合后,将其分别与p MV261/p MV361载体连接,电转化至卡介苗中,构建重组卡介苗。45℃热诱导重组卡介苗表达,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blotting分析。结果证明E0-E2融合基因在卡介苗中成功表达,目的蛋白大小为66.5 ku,且具有反应原性。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒 E0-E2融合基因 重组卡介苗
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19ku脂蛋白信号肽优化表达的牛病毒性腹泻病毒E2基因重组卡介苗初步免疫研究
6
作者 时坤 孙凡婷 +4 位作者 张妍 李晶 刘菲 刘杨 杜锐 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第12期962-965,共4页
为评价19ku脂蛋白信号肽优化表达的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)重组卡介苗对小鼠的免疫效果,本研究将已构建的rBCG/19ku-E_2、rBCG/E_2、rBCG/pMV261(pMV261空载体构建的rBCG作为实验对照组)、卡介苗(BCG)及BVDV灭活苗免疫小鼠,通过检测血... 为评价19ku脂蛋白信号肽优化表达的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)重组卡介苗对小鼠的免疫效果,本研究将已构建的rBCG/19ku-E_2、rBCG/E_2、rBCG/pMV261(pMV261空载体构建的rBCG作为实验对照组)、卡介苗(BCG)及BVDV灭活苗免疫小鼠,通过检测血清抗体效价、T淋巴细胞亚群含量及细胞因子水平,评价其体液免疫与细胞免疫效果。结果显示,rBCG/19ku-E_2可以引起BVDV特异性抗体的产生,并且抗体水平要高于rBCG/E_2、rBCG/pMV261组。对CD4^+、CD8^+T淋巴细胞亚群含量的检测结果表明,rBCG免疫小鼠对CD4^+、CD8^+T淋巴细胞亚群没有显著影响。通过对IL-4、IL-10、IL-12和IFN-γ细胞因子检测结果表明,rBCG主要诱导Th1型细胞免疫应答,rBCG/19ku-E_2诱导的细胞因子水平低于BCG免疫组,但均高于细胞因子的平均水平。结果表明,rBCG/19ku-E_2可以诱导小鼠产生较好的特异性体液免疫应答和细胞免疫应答,为BVDV新型疫苗研究奠定基础。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒 19 ku脂蛋白信号肽 重组卡介苗 免疫
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水貂阿留申病毒VP2蛋白Dot-ELISA检测方法的建立 被引量：4
7
作者 李晶 时坤 +4 位作者 曾范利 张妍 孙凡婷 刘杨 杜锐 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第8期619-622,共4页
为建立一种适合于基层快速检测水貂阿留申病毒(ADV)的检测方法,本研究将ADV的VP2基因经重叠延伸PCR法进行扩增后克隆至表达载体p GEX-4T-1中进行原核表达,将纯化的重组蛋白作为包被抗原建立了ADV的Dot-ELISA检测方法,并与对流免疫电泳(C... 为建立一种适合于基层快速检测水貂阿留申病毒(ADV)的检测方法,本研究将ADV的VP2基因经重叠延伸PCR法进行扩增后克隆至表达载体p GEX-4T-1中进行原核表达,将纯化的重组蛋白作为包被抗原建立了ADV的Dot-ELISA检测方法,并与对流免疫电泳(CIEP)作对照试验。结果表明,抗原最适包被浓度为20μg/m L,最适血清稀释度为1∶200,酶标二抗最适工作浓度为1∶2 000,血清和酶标抗体最适反应温度为37℃,反应时间为45 min^60 min。阻断试验和交叉试验显示与常见的貂病毒性肠炎和貂犬瘟热阳性血清无交叉反应,表明其具有良好的特异性。采用建立的Dot-ELISA和CIEP对78份临床血清样品进行检测,结果显示Dot-ELISA阳性检出率为84.6%,CIEP的阳性检出率为80.8%,敏感性高于CIEP,两者符合率为96.2%。本研究建立的Dot-ELISA检测方法简便、快速、灵敏、特异、重复性好,适合基层单位用于水貂阿留申病快速诊断和疫病普查。 展开更多
关键词 水貂阿留申病毒 VP2基因 原核表达 DOT-ELISA检测
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牛病毒性腹泻-黏膜病病毒E2基因在卡介苗中的优化表达 被引量：3
8
作者 曾范利 张云 +5 位作者 张梦 时坤 李建明 刘菲 李晶 杜锐 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第1期94-100,共7页
为构建牛病毒性腹泻-黏膜病病毒(BVDV)基因工程活载体疫苗,根据已知的BVDV Changehun184毒株E2基因序列,利用DN.AStar生物学软件对其进行分析,预测了可能存在的抗原表位,设计6对引物,分别扩增了包含预测抗原位点的6个片段,1—297 aa、1... 为构建牛病毒性腹泻-黏膜病病毒(BVDV)基因工程活载体疫苗,根据已知的BVDV Changehun184毒株E2基因序列,利用DN.AStar生物学软件对其进行分析,预测了可能存在的抗原表位,设计6对引物,分别扩增了包含预测抗原位点的6个片段,1—297 aa、1—345 aa、1—374 aa、45—297 aa、45—345 aa和45—374 aa,克隆至穿梭表达载体pMV361中,经酶切、PCR扩增和测序证实已正确插入到表达载体中,构建了6个原核表达质粒。阳性重组质粒通过电转化到卡介苗(BCG)感受态中,热诱导后,进行SDS-PAGE分析和免疫印迹检测。结果表明6个重组质粒在卡介苗中均有不同程度的表达,表达产物与理论推测的相对分子质量一致。Western blot结果显示其融合蛋白能被牛抗BVDV的阳性血清识别,具有相应的反应原性。本研究为进一步研究BVDV基因工程活载体疫苗奠定了基础。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻-黏膜病病毒 E2基因 卡介苗 优化表达
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鹿结核病流行株与卡介苗差异基因原核表达质粒的构建及表达
9
作者 王文玉 曾范利 +3 位作者 时坤 李健明 刘红娜 杜锐 《吉林农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第6期707-712,共6页
以吉林农业大学经济动物疾病实验室保存的鹿体内分离并鉴定的结核病流行株的基因组为模板,应用PCR方法从已构建的鹿结核病野毒株与卡介苗差异基因文库中扩增RD1区的Rv3872、Rv3873、Rv3874、Rv3875和Rv3878 5段目的基因,分别与p MD18-T ... 以吉林农业大学经济动物疾病实验室保存的鹿体内分离并鉴定的结核病流行株的基因组为模板,应用PCR方法从已构建的鹿结核病野毒株与卡介苗差异基因文库中扩增RD1区的Rv3872、Rv3873、Rv3874、Rv3875和Rv3878 5段目的基因,分别与p MD18-T Simple Vector连接,经PCR、酶切鉴定后的阳性重组克隆质粒与原核表达载体p GEX-4T-1连接并进行原核表达,采用谷胱甘肽琼脂糖亲和层析方法对目的蛋白进行纯化,通过SDS-PAGE和Western blot对表达产物的反应原性进行初步研究。基因测序结果显示差异基因与期望的序列一致,并在大肠杆菌中成功诱导表达,获得以可溶形式表达的目的蛋白,经SDS-PAGE分析目的蛋白的相对分子量与理论值相符,经Western blot鉴定纯化好的目的蛋白能与鹿结核病的阳性血清发生反应,具有良好的反应原性,为其在鹿结核病血清诊断学中的应用奠定了试验基础。 展开更多
关键词 鹿 结核病 差异基因 原核表达 反应原性
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鹿结核病流行株融合基因Rv3872-Rv3874-Rv3875的原核表达
10
作者 王文玉 宋纪伟 +6 位作者 曾范利 时坤 李健明 张云 刘东旭 俊伟 杜锐 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2014年第5期515-520,共6页
以本实验室保存的鹿体内分离并鉴定的结核病流行株为模板,利用重叠延伸剪接技术设计融合基因的引物,扩增融合基因Rv3872-Rv3874-Rv3875,构建重组表达质粒pGEX-4T-1-Rv3872-Rv3874-Rv3875;重组表达质粒被转化入大肠杆菌BL21(DE3)后,IPTG... 以本实验室保存的鹿体内分离并鉴定的结核病流行株为模板,利用重叠延伸剪接技术设计融合基因的引物,扩增融合基因Rv3872-Rv3874-Rv3875,构建重组表达质粒pGEX-4T-1-Rv3872-Rv3874-Rv3875;重组表达质粒被转化入大肠杆菌BL21(DE3)后,IPTG诱导表达,并采用谷胱甘肽琼脂糖亲和层析方法对目的蛋白进行纯化。基因测序结果显示,融合基因Rv3872-Rv3874-Rv3875的序列与GenBank中序列的符合率为99.89%。SDS-PAGE分析显示,融合基因在大肠杆菌中成功被诱导表达,获得以可溶形式表达的融合蛋白,该蛋白的分子质量约为60ku。Western-blot鉴定结果显示,纯化好的融合蛋白能与鹿结核病的阳性血清发生反应,说明该融合蛋白具有良好的反应原性,这一结果为它在鹿结核病血清学诊断中的应用奠定了试验基础。 展开更多
关键词 鹿结核病 融合基因 原核表达 反应原性
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